心肌細(xì)胞株的特性及其在心血管疾病研究中的應(yīng)用*

田香勤 郭志坤

（新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院河南省醫(yī)用組織再生重點實驗室，新鄉(xiāng) 453003）

成年大鼠心肌細(xì)胞體外培養(yǎng)環(huán)境要求較高，難以分離培養(yǎng)[1]。乳鼠的心肌細(xì)胞與成年大鼠相比在形態(tài)、結(jié)構(gòu)和功能方面具有較大差異[2]，而且乳鼠出生后7 d心肌細(xì)胞便停止分裂和增殖[3]，難以進(jìn)行體外傳代培養(yǎng)，限制了其遺傳操作。心肌細(xì)胞的原代分離和純化技術(shù)較為復(fù)雜，細(xì)胞的提取需要以犧牲大量實驗動物為代價。以上原因限制了原代心肌細(xì)胞在心血管疾病研究中的應(yīng)用。近年來，多能干細(xì)胞誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞（cardiomyocytes derived from pluripotent stem cells，PSC-CMCs）逐漸成為心血管疾病研究的新模型[4]，但由于PSC-CMCs代價昂貴、耗時費力，并且存在誘導(dǎo)效率低和分化成熟度不均一等問題，在科研應(yīng)用中亦受到一定限制[5]。

心肌細(xì)胞株由于其來源穩(wěn)定，可重復(fù)性強，體外培養(yǎng)條件簡單，并且能穩(wěn)定傳代，在心血管疾病研究中得到越來越廣泛的應(yīng)用。目前常用的心肌細(xì)胞株包括大鼠心肌H9C2細(xì)胞株、小鼠HL-1心房肌細(xì)胞系、成人心室肌AC16細(xì)胞株等，盡管以上心肌細(xì)胞株功能相近，但每一種細(xì)胞株都有其本身的特性及研究應(yīng)用中的優(yōu)缺點?，F(xiàn)針對當(dāng)前心肌細(xì)胞株的生物學(xué)特性及其應(yīng)用進(jìn)行綜述，以拓展其在心血管疾病研究應(yīng)用中的認(rèn)識，從而為心血管疾病研究選擇更好的細(xì)胞模型提供參考。

1 小鼠H9C2心肌細(xì)胞系

1.1 H9C2細(xì)胞的基本特性

H9C2細(xì)胞是20世紀(jì)70年代首個通過細(xì)胞連續(xù)傳代建立的大鼠心衍生細(xì)胞。1976年，Kimes和Brandt從BD1X大鼠13 d胚胎心室組織的細(xì)胞克隆中獲得了H9C2細(xì)胞株。盡管H9C2細(xì)胞未分化為成年心肌細(xì)胞，但已經(jīng)基本具備心肌細(xì)胞的生理特性。H9C2細(xì)胞和原代大鼠心肌細(xì)胞表面被膜中存在類似的糖殘基。在電刺激或用乙酰膽堿刺激作用下，H9C2細(xì)胞產(chǎn)生收縮并同時產(chǎn)生動作電位[6]，表現(xiàn)出向外整流的瞬時K+電流以及內(nèi)向L型Ca2+通道電流的特性[7]。然而，H9C2在形態(tài)上具有骨骼肌的特性，細(xì)胞中無法觀察到心特異性的形態(tài)學(xué)結(jié)構(gòu)[8]。

1.2 H9C2細(xì)胞的適用性及其優(yōu)缺點

由于H9C2細(xì)胞具有增殖分裂能力強、易于傳代等特點，已經(jīng)成為研究心肌細(xì)胞自噬、缺血缺氧，氧化應(yīng)激、炎癥、藥物篩選以及藥物毒性代謝的首選細(xì)胞[9]。利用原代分離大鼠心肌細(xì)胞與H9C2細(xì)胞同時作為研究體外心肌肥厚的模型，2種細(xì)胞表現(xiàn)出幾乎相同的肥厚反應(yīng)[10]。研究表明，H9C2細(xì)胞和原代分離心肌細(xì)胞在相同干預(yù)條件下的細(xì)胞關(guān)鍵基因功能改變基本一致[11]。

在心跨物種研究中，H9C2細(xì)胞亦是體外實驗研究的首選。H9C2細(xì)胞在細(xì)胞毒性、氧化應(yīng)激和興奮-收縮耦聯(lián)Ca2+瞬變等方面與斑馬魚的心肌細(xì)胞具有相似的特點[12-14]。另外，大鼠和斑馬魚的miR-1基因序列中，除了“種子序列”外，只有一個核苷酸的差異[15]。因此，在進(jìn)行斑馬魚心研究時常選用H9c2細(xì)胞作為模型。然而，H9C2細(xì)胞增殖相關(guān)基因與班馬魚心再生基因仍存在差異，除miR-133基因家族外，其他并不相同，對于單個miRNA的功能仍需開展深入研究[16]。

由于H9C2細(xì)胞在不同條件下具有向骨骼肌和心肌細(xì)胞分化的能力，不同分化狀態(tài)的細(xì)胞對毒物的敏感性不同[17]。Lenco等利用蛋白組學(xué)分別檢測H9C2細(xì)胞、原代分離的乳鼠心肌細(xì)胞和成年大鼠心室肌細(xì)胞時顯示，在H9C2細(xì)胞中最典型的12種橫紋肌特征蛋白中沒有一個具有心肌橫紋肌表型，未分化的H9C2細(xì)胞與新生心肌細(xì)胞和成年心肌的表型存在顯著差異[18]。Branco等利用低血清濃度培養(yǎng)基和全反式維甲酸誘導(dǎo)H9C2細(xì)胞分化為心肌細(xì)胞樣細(xì)胞（H9C2 cardiac-like phenotype cell，H9C2 CM），并研究了H9C2 CM細(xì)胞的基因表達(dá)譜，發(fā)現(xiàn)參與鈣調(diào)控、糖酵解和線粒體代謝相關(guān)的基因表達(dá)增加，與心肌收縮、擴張型心肌病等相關(guān)的基因表達(dá)明顯上調(diào)，從而證實了心肌細(xì)胞樣表型的存在[19]。利用同樣的誘導(dǎo)方法，Kankeu等[20]采用蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)分析發(fā)現(xiàn)，H9C2細(xì)胞分化的早期改變與心肌形態(tài)形成和鞘脂合成的蛋白途徑有關(guān)。另外，心細(xì)胞的分化狀態(tài)影響其對毒物的易感性，線粒體凋亡通路在未成熟心肌細(xì)胞中比在成年心肌細(xì)胞中更活躍[21]。分化程度越高的H9C2細(xì)胞對阿霉素線粒體氧化應(yīng)激和凋亡信號的敏感性越低[22]。由此可見，在利用H9C2細(xì)胞作為心細(xì)胞模型時，先將其誘導(dǎo)細(xì)胞分化為H9C2 CM細(xì)胞更具研究意義[17]。

目前，很多研究通過對H9C2細(xì)胞誘導(dǎo)和改造，使其更接近心肌細(xì)胞的表型。傳統(tǒng)的方法是利用全反式維甲酸誘導(dǎo)或改變細(xì)胞外基質(zhì)微環(huán)境[23]。Singla等研究表明，向H9C2細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)導(dǎo)Oct3/4、Sox2、Klf4和c-Myc轉(zhuǎn)錄因子可使其成為誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞（induced pluripotent stem cells，iPS），該細(xì)胞在培養(yǎng)系統(tǒng)中具有向心肌細(xì)胞分化的潛能，并能在體內(nèi)修復(fù)梗死后的心肌，改善心功能[24]。另有報道H9C2細(xì)胞誘導(dǎo)的iPS細(xì)胞在小鼠糖尿病心肌梗死模型心肌中可分化為內(nèi)皮細(xì)胞和血管平滑肌細(xì)胞[25]，表明其具有多向分化的潛能。

2 小鼠HL-1心房肌細(xì)胞系

2.1 HL-1細(xì)胞的來源和基本特性

小鼠HL-1心房肌細(xì)胞系是1998年Claycomb教授從Jackson實驗室成年雌性近交系C57BL/6J小鼠身上切除的AT-1皮下腫瘤中獲得的，該細(xì)胞可以連續(xù)傳代，表現(xiàn)心細(xì)胞形態(tài)、生化及電生理特性，具有自發(fā)的收縮能力和小鼠胚胎心房肌細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)特征；HL-1細(xì)胞的α-心肌球蛋白重鏈、α-心肌動蛋白、連接蛋白CX43和心房利鈉因子等與成年心房肌細(xì)胞具有相似的基因表達(dá)模式[26]。Pelloux等[27]報道HL-1細(xì)胞具有二氫吡啶受體L型鈣通道，但沒有發(fā)現(xiàn)規(guī)則肌節(jié)的存在。另外，HL-1細(xì)胞具有心房心肌細(xì)胞典型的乙酰膽堿激活的K+內(nèi)向整流電流[28]，并具有HCN家族基因參與編碼的超極化激活電流，這是心臟起搏產(chǎn)生和參與調(diào)節(jié)的基礎(chǔ)[29]。

為了維持HL-1細(xì)胞收縮功能和心細(xì)胞表型，需要纖維連接蛋白-明膠基質(zhì)和特殊配方的生長培養(yǎng)基等培養(yǎng)條件[30]。隨著心肌組織工程生物材料的發(fā)展，生物支架的應(yīng)用改變了心肌細(xì)胞排列形式，增強了跳動能力和生物活性[31]。細(xì)胞的匯集度是HL-1細(xì)胞分化的重要因素，高密度培養(yǎng)條件下可增強其收縮活性[32]。

2.2 HL-1細(xì)胞的亞克隆

2006年，Pelloux研究組在HL-1細(xì)胞株的基礎(chǔ)上分離出不具有跳動功能的細(xì)胞株（non-beating HL-1，NB HL-1）。該細(xì)胞株與原HL-1細(xì)胞相比，除不具有If起搏器電流和自動去極化外，幾乎具備原細(xì)胞株的所有特征[27]。在能量代謝方面，NB HL-1細(xì)胞與成體大鼠心肌細(xì)胞相比，具有較低的氧化磷酸化能力，但糖酵解系統(tǒng)能力較強，糖酵解系統(tǒng)是能量消耗反應(yīng)中ATP的主要來源[33]，缺乏搏動的NB HL-1細(xì)胞在形態(tài)學(xué)研究及線粒體呼吸代謝研究方面具有較好的優(yōu)勢[27]。

為獲得更加穩(wěn)定一致性的細(xì)胞系，Diasn等[34]從原HL-1細(xì)胞系低密度培養(yǎng)中分離出1、2、3、4、6亞克隆株，其中第6亞克隆細(xì)胞（HL1-6）在細(xì)胞密度低的情況下具有穩(wěn)定的收縮表型，其細(xì)胞肌節(jié)更為典型，動作電位和成年心房肌細(xì)胞相似。Houston等[35]證實HL1-6作為心肌細(xì)胞房顫模型更為穩(wěn)定。

2.3 HL-1細(xì)胞主要應(yīng)用優(yōu)勢

HL-1細(xì)胞是體外研究心率失常較好的細(xì)胞模型[36]。采用連續(xù)均勻高頻率的電場刺激能夠成功制作細(xì)胞房顫模型[37]。轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究體外HL-1細(xì)胞房顫模型顯示，HL-1細(xì)胞與人類房顫轉(zhuǎn)錄組主要基因的改變基本一致[38]，形態(tài)上出現(xiàn)相似的肌溶解現(xiàn)象[39]。HL-1細(xì)胞具備能分裂傳代和體外容易培養(yǎng)等優(yōu)勢，有利于基因的導(dǎo)入和敲低，是研究心律失常相關(guān)基因優(yōu)先選擇的細(xì)胞[40]。同時，HL-1細(xì)胞也是心房細(xì)胞體外研究首選的細(xì)胞系[41]，在探索心功能調(diào)節(jié)信號通路等方面發(fā)揮重要作用[42]。

3 成人心室心肌AC16細(xì)胞株

3.1 AC16細(xì)胞基本特征

2005年，Davidson等[43]建立了成人心室心肌AC16細(xì)胞株，為研究人類心發(fā)生機制和心肌疾病的問題提供了便利。該團隊利用原代成人心室組織的細(xì)胞與轉(zhuǎn)入SV40T抗原基因合并尿苷缺陷性人類成纖維細(xì)胞融合，經(jīng)過亞克隆和細(xì)胞篩選獲得AC16細(xì)胞克隆。AC16細(xì)胞具有心肌細(xì)胞的細(xì)胞核和線粒體，表達(dá)轉(zhuǎn)錄因子GATA4、MYCD 和NFATc4，具有β-myosin重鏈、心肌動蛋白、肌鈣蛋白I、輔肌動蛋白、中間絲蛋白、肌間線蛋白、縫隙連接蛋白和橋粒斑等心肌特征性蛋白[43]。該細(xì)胞最重要的特征是能控制細(xì)胞的增殖和分化狀態(tài)，當(dāng)使用RNAi技術(shù)沉默致癌基因SV40時，細(xì)胞從增殖狀態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)榉只癄顟B(tài)，表達(dá)心特異性標(biāo)記物BMP2，而增殖細(xì)胞不表達(dá)BMP2。AC16為研究心肌發(fā)育的轉(zhuǎn)錄調(diào)控提供了良好模型，但由于該細(xì)胞不具有瞬時K+電流、L型Ca2+電流和If等典型電流，不能產(chǎn)生動作電位，不具有細(xì)胞收縮功能[43]。因此，AC16不適合心肌細(xì)胞的電生理研究。

3.1 AC16細(xì)胞的研究適用優(yōu)勢

由于AC16保留了原代人心肌細(xì)胞的細(xì)胞核和線粒體DNA，具有完整的功能呼吸鏈，是探索心肌線粒體功能調(diào)節(jié)、氧化應(yīng)激、能量代謝和藥物或環(huán)境對線粒體毒性等研究的優(yōu)先選擇[44]，在研究甲基汞對AC16和H9C2心肌細(xì)胞線粒體影響時顯示，AC16細(xì)胞在線粒體ATP生成能力方面有更好的藥物毒性劑量依賴性[45]，而線粒體介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡途徑影響細(xì)胞的活性和最終命運。因此，AC16細(xì)胞在研究心肌細(xì)胞活性和凋亡方面具有重要應(yīng)用價值[46]。另外，AC16細(xì)胞具有成人心室肌細(xì)胞所有的DNA序列，決定了它在基因水平上研究的優(yōu)勢[47-48]，采用二代測序和生物信息學(xué)方法分析低氧組和正常組AC16細(xì)胞顯示，AC16細(xì)胞的mRNAs和miRNAs的改變與心功能密切相關(guān)[49]。

4 新型心肌細(xì)胞株

成熟的心肌細(xì)胞株是研究心血管疾病的重要材料，許多研究人員曾嘗試將SV40大T抗原永生基因轉(zhuǎn)入心肌細(xì)胞建立細(xì)胞系。2013年，朱高慧團隊利用腺病毒載體把兩側(cè)帶有l(wèi)oxP位點的SV40大T抗原基因轉(zhuǎn)入15.5 d胎鼠心室肌組織細(xì)胞，使細(xì)胞得到永生化，構(gòu)建了iCP15心肌細(xì)胞株，iCP15細(xì)胞表現(xiàn)出較強的增殖活性，并且其增殖可以通過Cre重組酶去除SV40大T抗原而發(fā)生逆轉(zhuǎn)，從而向心肌細(xì)胞分化[50]。2018年，Liu等[5]采用慢病毒載體把由強力霉素條件控制表達(dá)的SV40大T抗原基因轉(zhuǎn)入新鮮分離的新生大鼠心房肌細(xì)胞（immortalized atrial myocyte，iAM），獲得無限增殖能力的心房肌iAM-1細(xì)胞。該細(xì)胞在強力霉素條件下培養(yǎng)進(jìn)入增殖狀態(tài)，喪失了大多數(shù)心肌細(xì)胞特征，其增殖速度較快，比目前廣泛使用的HL-1細(xì)胞高10倍，在缺乏強力霉素的條件下，細(xì)胞停止分裂增殖，向心房肌細(xì)胞表型分化，在肌節(jié)、收縮能力、電特性等方面和原代分離心肌細(xì)胞相似[5]。新型細(xì)胞株最明顯的特點是能夠利用基因調(diào)控技術(shù)控制細(xì)胞的增殖和分化，從而更有利于控制細(xì)胞狀態(tài)的一致性。

5 問題與展望

人類的心臟疾病復(fù)雜多樣，致病機制的調(diào)節(jié)難以復(fù)制，而心肌細(xì)胞株有其良好的遺傳穩(wěn)定性和單一的生存條件，更有利于重復(fù)模擬單因素試驗研究。因此，需要構(gòu)建更好的心肌細(xì)胞株來滿足當(dāng)前科研需要。但目前通過體外構(gòu)建的心肌細(xì)胞株與來自體內(nèi)的心肌細(xì)胞表型及功能仍存在差異，科學(xué)家應(yīng)該尋找新的誘導(dǎo)藥物，同時充分利用現(xiàn)代生物技術(shù)（如基因編輯技術(shù)），通過改良細(xì)胞培養(yǎng)環(huán)境，研發(fā)新的細(xì)胞培養(yǎng)載體，構(gòu)建與人類心肌細(xì)胞形態(tài)和功能更為接近的心肌細(xì)胞株，為心血管疾病研究及臨床應(yīng)用提供更大便利。