定向誘導為神經(jīng)元樣細胞的骨髓間充質(zhì)干細胞對大鼠坐骨神經(jīng)損傷的修復(fù)作用研究

胡安全 馮祁軍 王正安 秦 力 李 哲

浙江省嘉興市第一醫(yī)院骨科，浙江嘉興 314000

周圍神經(jīng)損傷多見于高能量暴力損傷患者[1]，尤其以坐骨神經(jīng)損傷最難處理且術(shù)后恢復(fù)緩慢，這與周圍神經(jīng)的再生和修復(fù)能力有限、功能恢復(fù)差有關(guān)。目前骨髓間充質(zhì)干細胞（BM-MSCs）已經(jīng)成為組織工程、細胞治療領(lǐng)域理想的種子細胞[2-3]，尤其可用于周圍神經(jīng)損傷的再生細胞治療[4]。但是由于干細胞移植在體內(nèi)的存活率和分化率不理想，患者很難獲得理想的臨床效益[5-7]。為了提高BM-MSCs 移植對坐骨神經(jīng)損傷的再生與修復(fù)作用，本研究在體外通過不同的誘導方法定向誘導BM-MSCs 向神經(jīng)元樣細胞分化，并進一步通過大鼠坐骨神經(jīng)損傷模型，以證實在體外定向誘導為神經(jīng)元樣BM-MSCs 有促進大鼠神經(jīng)損傷恢復(fù)和神經(jīng)遞質(zhì)分泌的作用。

1 材料與方法

1.1 材料

12 只SPF 級4 周齡雄性SD 大鼠（175±10）g 和90 只SPF 級3 月齡雄性SD 大鼠（225±25）g 購自浙江維通利華實驗動物技術(shù)有限公司[許可證號：SCXK（浙）2019-0001]，動物房溫度（22±1）℃，濕度（50±5）%，適應(yīng)性喂養(yǎng)1 周后進行實驗，實驗過程中遵循“3R”原則。

BriCyte E6 型流式細胞儀購自深圳邁瑞醫(yī)療公司；β-巰基乙醇（貨號：0482-250ML）和全反式視黃酸（貨號：C20734-100mg）購自美國Sigma 公司；免疫印跡一抗腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子（BDNF）（貨號：ab108319）、髓磷脂堿性蛋白（MBP）（貨號：ab20216）和生長關(guān)聯(lián)蛋白43（GAP-43）（貨號：ab75810）購自英國Abcam 公司。

1.2 BM-MSCs 分離培養(yǎng)及鑒定

取12 只4 周齡大鼠，窒息處死。參照Maridas 等[8]、Huang 等[9]方法取大鼠雙側(cè)股骨及脛骨分離骨髓細胞。細胞培養(yǎng)用常規(guī)細胞貼壁篩選法，通過多次1∶1傳代在體外進行純化。取1.0×106個/mL P3 代細胞加入適量鼠抗人抗體CD29、CD44、CD90 免疫熒光鑒定，流式細胞儀檢測BM-MSCs 表面標志物。

1.3 BM-MSCs 定向誘導和分化

將BM-MSCs 細胞分為化學誘導分化組（β-巰基乙醇組和全反式視黃酸組）、Transwell 小室共培養(yǎng)組和對照組（不作處理）?；瘜W誘導分化組按1.0×105個/mL濃度接種于蓋玻片上，用低糖DMEM 培養(yǎng)基培養(yǎng)，達到70%融合時，換成含3 mmol/L β-巰基乙醇或1 μmol/L 全反式視黃酸的培養(yǎng)基誘導。Transwell 小室共培養(yǎng)組，取細胞懸液，培養(yǎng)貼壁細胞至有神經(jīng)網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)后，按1×106個/mL 的密度接種于Transwell 雙層培養(yǎng)皿的底層，Transwell 內(nèi)板中接種骨髓間充質(zhì)干細胞。

誘導7 d 后，免疫組化法檢測神經(jīng)元特異性烯醇化酶表達。并用細胞免疫熒光染色法和流式細胞術(shù)法鑒定神經(jīng)分化標志物膠質(zhì)纖維酸性蛋白（GFAP）、神經(jīng)營養(yǎng)素（NT3）、微管相關(guān)蛋白2（MAP2）、Tau、趨化因子基質(zhì)細胞衍生因子-1 受體（CXCR4）、神經(jīng)微絲蛋白200 kD（N200）、NESTIN、泛素（UBIQUITIN）、微管蛋白Ⅲ（TUBULIN Ⅲ）陽性表達情況。

1.4 大鼠坐骨神經(jīng)缺損模型的建立和分組

取90 只3 月齡SD 大鼠，按照隨機數(shù)字表法分為假手術(shù)組、模型組、普通細胞組與定向誘導組。除假手術(shù)組20 只外，其余70 只大鼠用鉗夾法建立大鼠坐骨神經(jīng)損傷模型[10]。操作方法：腹腔注射10%水合氯醛麻醉，固定。常規(guī)備皮、消毒后，鈍性分離左大腿肌肉。顯露坐骨神經(jīng)，在大腿根部用動脈瘤夾鉗夾坐骨神經(jīng)，鉗夾10 s，反復(fù)3 次，造成3 mm 的損傷區(qū)。手術(shù)過程中，顯微鏡觀察到其外膜連續(xù)而神經(jīng)軸突中斷。含抗生素鹽水清潔傷口后，縫合組織。術(shù)后，以大鼠左下肢反應(yīng)遲鈍，屈伸力量明顯減弱，為造模成功的標準。假手術(shù)組大鼠僅暴露坐骨神經(jīng)，而不用夾鉗損傷神經(jīng)，隨后縫合組織。最終造模成功63 只，為了平衡每組動物數(shù)量，隨機剔除3 只大鼠，確保每組20 只大鼠。術(shù)后用微量注射器將10 μL 的P3 代BM-MSCs 懸液（1×106個）和經(jīng)定向誘導分化的神經(jīng)元樣細胞懸液（1×106個）分別植入普通細胞組和定向誘導組大鼠坐骨神經(jīng)損傷處。假手術(shù)組和模型組注入等量生理鹽水。注射3 min，留針5 min。注射完成后，繼續(xù)飼養(yǎng)12 周。

1.5 坐骨神經(jīng)功能指數(shù)（SFI）評估

自制大鼠足跡行走箱，采集四組2、4、8、12 周（細胞移植后）大鼠足印，根據(jù)Bain 公式[11]計算并比較各組大鼠的SFI。SFI 測定結(jié)果介于-100（完全失去神經(jīng)支配功能）～0（運動正常）。

1.6 大鼠運動功能評估

采用Basso Beattie Bresnahan（BBB）運動功能評分法評估大鼠運動功能，自大鼠造模后2、4、8、12 周（細胞移植后）對大鼠模型進行盲法評分。BBB 分值介于0（完全失去神經(jīng)支配功能）～21 分（運動正常）[12]。

1.7 肌濕重恢復(fù)率比較

實驗結(jié)束后，取大鼠實驗側(cè)（E）和健側(cè)（N）小腿三頭肌稱重，根據(jù)公式[13]（肌濕重恢復(fù)率=E 肌濕重/N肌濕重×100%）計算肌濕重恢復(fù)率。

1.8 大鼠坐骨神經(jīng)中BDNF、MBP 和GAP-43 蛋白表達水平檢測

BBB 運動功能評分后，通入過量二氧化碳，將大鼠安樂死。收集大鼠坐骨神經(jīng)組織，提取總蛋白。經(jīng)BCA 法測定蛋白濃度后，加入適量樣品緩沖液調(diào)節(jié)蛋白濃度為0.5 μg/μL，100℃水浴5 min 后，SDS-PAGE膠上每孔上樣20 μL。120 V 40 min 后轉(zhuǎn)膜7 min。至5%的脫脂奶粉中封閉30 min。加入相應(yīng)的一抗（1:1000）稀釋液，4℃儲存，過夜；加HRP 標記二抗（1:1000），水平搖床，室溫封閉1 h 后，TBST 洗3 次，每次10 min，顯影。

1.9 統(tǒng)計學方法

采用GraphPad Prism 6 統(tǒng)計學軟件進行數(shù)據(jù)分析。計量資料用均數(shù)±標準差（）表示，不同時間點比較采用重復(fù)測量方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗。以P<0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 BM-MSCs 形態(tài)變化及鑒定

大鼠BM-MSCs 培養(yǎng)24 h 后，只有少數(shù)細胞貼壁生長；貼壁細胞在常規(guī)培養(yǎng)72 h 后開始增殖，逐漸出現(xiàn)出現(xiàn)長短不一的突起，并呈集落樣生長。P3 代細胞生長態(tài)勢均一，排列緊密，呈渦旋狀集落，見圖1。經(jīng)流式細胞術(shù)鑒定，P3 代BM-MSCs 可高表達CD29、CD44、CD90，幾乎不表達CD45，見圖2。

圖1 倒置顯微鏡下觀察BM-MSCs 細胞形態(tài)（100×）

2.2 不同誘導方法對BM-MSCs 神經(jīng)元特異性烯醇化酶陽性表達率的影響

整體比較：不同誘導方法對BM-MSCs 神經(jīng)元特異性烯醇化酶陽性表達率組間、時間及交互作用比較，差異均有統(tǒng)計學意義（均P<0.05）。組內(nèi)比較：對照組各時間點BM-MSCs 神經(jīng)元特異性烯醇化酶陽性表達率比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。β-巰基乙醇組、全反式視黃酸組、Transwell 小室共培養(yǎng)組各時間點比較，差異均有統(tǒng)計學意義（均P<0.05）。組間比較：第1 天，Transwell 小室共培養(yǎng)組BM-MSCs神經(jīng)元特異性烯醇化酶陽性表達率高于β-巰基乙醇組、全反式視黃酸組；全反式視黃酸組BM-MSCs 神經(jīng)元特異性烯醇化酶陽性表達率低于β-巰基乙醇組；β-巰基乙醇組BM-MSCs 神經(jīng)元特異性烯醇化酶陽性表達率高于對照組。第3、5、7 天，四組各時間點組間兩兩比較，差異均有統(tǒng)計學意義（均P<0.05）。見表1。

圖2 流式細胞術(shù)檢測P3 代BM-MSCs 細胞表面抗原

誘導7 d 后，β-巰基乙醇組BM-MSCs 神經(jīng)元特異性烯醇化酶陽性表達率高于其他三組，故而選擇β-巰基乙醇組定向誘導分化7 d 后的BM-MSCs 用于后續(xù)動物實驗。

表1 不同誘導方法對BM-MSCs 神經(jīng)元特異性烯醇化酶陽性表達率的影響（%，，n=3）

表1 不同誘導方法對BM-MSCs 神經(jīng)元特異性烯醇化酶陽性表達率的影響（%，，n=3）

注：與同組第1 天比較，*P <0.05；與同組第3 天比較，#P <0.05；與同組第5 天比較，&P <0.05；與對照組同期比較，aP <0.05；與β-巰基乙醇組同期比較，bP <0.05；與全反式視黃酸組同期比較，cP <0.05。BM-MSCs：骨髓間充質(zhì)干細胞

2.3 β-巰基乙醇定向誘導分化7 d 后的BM-MSCs神經(jīng)分化標志物檢測

免疫熒光染色法顯示，神經(jīng)分化標志物CXCR4、GFAP、NT3、MAP2、Tau、N200 表達率為75%～100%，NESTIN 陽性表達率為50%～75%，而UBIQUITIN、TUBULIN Ⅲ檢出率為25%～50%，見圖3。經(jīng)流式細胞術(shù)法顯示，GFAP、NT3、MAP2、Tau、N200陽性表達率超過70%，CXCR4、NESTIN、UBIQUITIN、TUBULIN Ⅲ細胞陽性表達率低于70%，見圖4。

圖3 免疫熒光染色法檢測β-巰基乙醇定向誘導分化7 d 后BM-MSCs 神經(jīng)分化標志物（10 000×）

2.4 四組術(shù)后2、4、8、12 周SFI 比較

圖4 流式細胞術(shù)檢測β-巰基乙醇定向誘導分化7 d 后BM-MSCs 神經(jīng)分化標志物

整體比較：各組大鼠SFI 組間、時間及交互作用比較，差異均有統(tǒng)計學意義（均P<0.05）。組內(nèi)比較：假手術(shù)組各時間點SFI 比較，差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）；模型組、普通細胞組、定向誘導組各時間點SFI比較，差異均有統(tǒng)計學意義（均P<0.05）。組間比較：模型組術(shù)后2、4、8、12 周SFI 低于假手術(shù)組，差異均有統(tǒng)計學意義（均P<0.05）。定向誘導組術(shù)后2、4、8、12 周SFI 高于模型組、普通細胞組；普通細胞組術(shù)后2、4、8、12 周SFI 高于模型組，差異均有統(tǒng)計學意義（均P<0.05）。見表2～3。

表2 假手術(shù)組和模型組術(shù)后2、4、8、12 周SFI 比較（%，，n=20）

表2 假手術(shù)組和模型組術(shù)后2、4、8、12 周SFI 比較（%，，n=20）

注：與同組2 周比較，*P <0.05；與同組4 周，#P <0.05；與同組8 周，&P <0.05；與假手術(shù)組同期比較，aP <0.05。SFI：坐骨神經(jīng)功能指數(shù)

表3 模型組、普通細胞組、定向誘導組大鼠在術(shù)后2、4、8、12 周SFI 結(jié)果（%，，n=20）

表3 模型組、普通細胞組、定向誘導組大鼠在術(shù)后2、4、8、12 周SFI 結(jié)果（%，，n=20）

注：與同組2 周比較，*P <0.05；與同組4 周，#P <0.05；與同組8 周，&P <0.05；與模型組同期比較，bP <0.05；與普通細胞組同期比較，cP <0.05。SFI：坐骨神經(jīng)功能指數(shù)

2.5 四組術(shù)后2、4、8、12 周BBB 評分比較

整體比較：各組大鼠BBB 評分組間、時間及交互作用比較，差異均有統(tǒng)計學意義（均P<0.05）。組內(nèi)比較：四組術(shù)后8 周、12 周BBB 評分高于術(shù)后2 周和4 周，差異均有統(tǒng)計學意義（均P<0.05）；四組術(shù)后2 周和4 周BBB 評分比較，差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。組間比較：模型組術(shù)后2、4、8、12 周BBB 評分低于假手術(shù)組，差異均有統(tǒng)計學意義（均P<0.05）。定向誘導組術(shù)后8、12 周BBB 評分高于模型組和普通細胞組；普通細胞組術(shù)后8、12 周BBB 評分高于模型組，差異均有統(tǒng)計學意義（均P<0.05）。見表4～5。

2.6 四組肌濕重恢復(fù)率比較

實驗結(jié)束后，模型組大鼠肌濕重恢復(fù)率為（42.50±2.17）%，低于假手術(shù)組的（92.58±4.57）%，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。定向誘導組肌濕重恢復(fù)率為（65.78±3.36）%，高于普通細胞組的（52.45±3.34）%及模型組；普通細胞組肌濕重恢復(fù)率高于模型組，差異均有統(tǒng)計學意義（均P<0.05）。

表4 假手術(shù)組和模型大鼠術(shù)后2、4、8、12 周BBB 評分結(jié)果（分，，n=20）

表4 假手術(shù)組和模型大鼠術(shù)后2、4、8、12 周BBB 評分結(jié)果（分，，n=20）

注：與同組2 周比較，*P <0.05；與同組4 周，#P <0.05；與同組8 周，&P<0.05；與假手術(shù)組同期比較，aP<0.05。BBB：Bsso Beattie Bresnahan

表5 模型組、普通細胞組、定向誘導組大鼠術(shù)后BBB 評分結(jié)果（分，，n=20）

表5 模型組、普通細胞組、定向誘導組大鼠術(shù)后BBB 評分結(jié)果（分，，n=20）

注：與同組2 周比較，*P <0.05；與同組4 周，#P <0.05；與同組8 周，&P <0.05；與模型組同期比較，bP <0.05；與普通細胞組同期比較，cP <0.05。BBB：Bsso Beattie Bresnahan

2.7 四組BDNF、MBP 和GAP-43 蛋白表達比較

模型組BDNF、MBP 與和GAP-43 蛋白表達量低于假手術(shù)組，差異均有統(tǒng)計學意義（均P<0.05）。定向誘導組BDNF、MBP 和GAP-43 蛋白表達量高于模型組和普通細胞組；普通細胞組BDNF、MBP 和GAP-43 蛋白表達量高于模型組，差異均有統(tǒng)計學意義（均P<0.05）。見圖5、表6。

圖5 Western blot 法檢測各組BDNF、MBP和GAP-43 蛋白表達差異

表6 Western blot 法檢測各組BDNF、MBP和GAP-43 蛋白表達量（，n=20）

表6 Western blot 法檢測各組BDNF、MBP和GAP-43 蛋白表達量（，n=20）

注：與假手術(shù)組，aP <0.05；與模型組，bP <0.05；與普通細胞組，cP <0.05。BDNF：腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子；MBP：髓磷脂堿性蛋白；GAP-43：生長關(guān)聯(lián)蛋白43

3 討論

BM-MSCs 因其來源方便，能實現(xiàn)體外增殖和培養(yǎng)，同時又具有多向分化潛能，并且避免了倫理沖突[14]，在臨床上具有很大的疾病治療潛力。其主要作用機制在于通過誘導神經(jīng)營養(yǎng)因子的分泌，直接促進軸突生長，與靶細胞重新建立聯(lián)系；或間接誘導星形膠質(zhì)細胞活化，進而促進神經(jīng)再生和修復(fù)[15]；此外BM-MSCs也具備橫向分化潛能，在神經(jīng)營養(yǎng)因子誘導作用下，少部分BM-MSCs 在體內(nèi)可分化為神經(jīng)外胚層樣細胞，但是仍有大部分BM-MSCs 分化為星形膠質(zhì)細胞[16]。因此在應(yīng)用BM-MSCs 時，體外成功將其定向分化的技術(shù)至關(guān)重要，這在很大程度上影響疾病的治療效果。目前，國內(nèi)外學者主要采用化學誘導法（β-巰基乙醇、全反式視黃酸）和Transwell 小室共培養(yǎng)法將BMMSCs在體外定向誘導分化成神經(jīng)元樣細胞[17]。本研究利用β-巰基乙醇，全反式視黃酸和Transwell 小室共培養(yǎng)3 種誘導方式誘導7 d 后，各組BM-MSCs逐漸向典型神經(jīng)元的形態(tài)特征發(fā)生變化，提示3 種誘導方式都可以成功誘導BM-MSCs 向神經(jīng)元樣細胞表型轉(zhuǎn)化，形成軸突和樹突。但是通過免疫組化法檢測不同誘導條件下神經(jīng)元特異性烯醇化酶陽性表達率發(fā)現(xiàn)，β-巰基乙醇誘導分化組神經(jīng)元特異性烯醇化酶陽性表達率高于其他三組（P<0.05），故而選擇β-巰基乙醇定向誘導分化7 d 后的BM-MSCs 用于后續(xù)動物實驗。

全反式視黃酸是維生素A 的主要活性代謝產(chǎn)物[18]。本研究結(jié)果顯示，在3 種誘導方法下，全反式視黃酸誘導分化的神經(jīng)元所占比例最低，與其在大鼠骨髓基質(zhì)細胞的成骨分化作用中類似[19-20]。全反式視黃酸誘導分化骨髓間充質(zhì)干細胞的作用原理可能與激活BMP 信號通路有關(guān)。其通過上調(diào)負責成脂分化的BMP 受體IA 的表達，從而促進骨髓間充質(zhì)干細胞的成脂化，所以降低了向神經(jīng)元樣細胞的分化[21]。Transwell 小室共培養(yǎng)法是通過細胞與神經(jīng)細胞之間的相互接觸、相互支持的特異空間結(jié)構(gòu)促進骨髓間充質(zhì)干細胞分化為神經(jīng)細胞。本研究中，Transwell 小室共培養(yǎng)法誘導分化的神經(jīng)元比例較高，這可能是因為共培養(yǎng)中神經(jīng)細胞分泌的各種細胞因子[22]、神經(jīng)遞質(zhì)[23]等促進了BM-MSCs 向神經(jīng)元樣細胞的分化。共培養(yǎng)法的機制使骨髓間充質(zhì)干細胞置于一種更接近人體的微環(huán)境中，誘導其向神經(jīng)細胞分化。β-巰基乙醇是研究較早且較為成熟的一種分化誘導劑，通過提高胞質(zhì)內(nèi)抗氧化成分-谷胱甘肽的水平降低氧自由基的生成量以達到誘導細胞分化的目的[24]。關(guān)寧等[25]研究顯示，β-巰基乙醇組神經(jīng)元特異性烯醇化酶陽性率和微管相關(guān)蛋白分化率更高，說明相較于神經(jīng)生長因子，β-巰基乙醇能夠更好地促進BM-MSCs 向神經(jīng)元樣細胞分化。本研究結(jié)果顯示，β-巰基乙醇通過提高神經(jīng)分化標志物GFAP、NT3、MAP2、Tau、CXCR4、N200、NESTIN、UBIQUITIN、TUBULIN Ⅲ等特異性蛋白的表達量，刺激胞體和樹突發(fā)育，提高神經(jīng)元存活數(shù)量，與鄰近的細胞間形成突觸連接，進而形成穩(wěn)定的神經(jīng)元細胞。

此外本研究進一步通過大鼠實驗證實，普通細胞組和定向誘導組大鼠運動功能較模型組大鼠明顯改善，無論是注射BM-MSCs 還是注射神經(jīng)元樣向誘導分化的BM-MSCs，都具有恢復(fù)大鼠坐骨神經(jīng)電生理學特性和拉伸力學性能的作用。而且坐骨神經(jīng)損傷處神經(jīng)生長相關(guān)因子（BDNF、MBP、GAP-43 蛋白）的表達水平明顯升高。定向誘導組大鼠SFI 指數(shù)、BBB 評分、肌濕重恢復(fù)率高于普通細胞組（均P<0.05），提示BM-MSCs 可以向神經(jīng)損傷點傳遞有助于功能恢復(fù)的關(guān)鍵信號，進而改變細胞行為或轉(zhuǎn)移某些細胞因子以減輕損傷。而且神經(jīng)元樣定向誘導分化的BM-MSCs更有利于坐骨神經(jīng)損傷的恢復(fù)。

綜上，β-巰基乙醇可定向誘導BM-MSCs 向神經(jīng)元樣細胞分化，能夠獲得穩(wěn)定的神經(jīng)元細胞。在坐骨神經(jīng)損傷處注射定向誘導為神經(jīng)元樣細胞的BMMSCs 具有明顯的神經(jīng)損傷修復(fù)作用，可促進神經(jīng)元再生。從而證實利用成體干細胞（大鼠BM-MSCs）誘導神經(jīng)元樣定向分化作為一種簡便的治療方法用于周圍神經(jīng)系統(tǒng)疾病的可能性。