單純皰疹病毒2型gD蛋白-結(jié)核桿菌熱休克蛋白70 DNA疫苗的免疫效應(yīng)研究

樊建勇，田 晨，王興旺，張功愷，高 睿，籍麗玥，陳韋君，楊慧蘭

生殖器皰疹（GH）是由單純皰疹病毒(HSV)感染泌尿生殖器及肛周皮膚黏膜而導(dǎo)致的一種慢性、復(fù)發(fā)性、難治愈的性傳播疾病[1]。在病毒感染性疾病的防治中，疫苗是有效的治療方法。HSV糖蛋白是HSV的主要免疫原，按照HSV糖蛋白引起的抗體反應(yīng)及保護(hù)性免疫分析，其免疫原性強(qiáng)弱順序?yàn)椋篻D，gB，gC，gE，gG，gI，gH。作為抗 HSV 感染中重要的保護(hù)性抗原，gD能抑制潛伏感染的發(fā)生[2]，其具有成為HSV疫苗研究靶點(diǎn)的優(yōu)勢(shì)。筆者以往構(gòu)建的HSV2gD DNA疫苗由于免疫原性較弱，所以需要通過聯(lián)合抗原載體分子或免疫佐劑來增強(qiáng)其免疫激活作用[3]。結(jié)核桿菌熱休克蛋白70（Hsp70）具有強(qiáng)的免疫原性，有免疫佐劑的作用，能增強(qiáng)抗原誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生細(xì)胞免疫和體液免疫的能力[4]。本研究使用實(shí)驗(yàn)室自行構(gòu)建的HSV2型gD蛋白、結(jié)核桿菌熱休克蛋白70（Hsp70-HSV2gD）DNA疫苗[5]免疫BALB/c小鼠，研究其對(duì)小鼠免疫反應(yīng)的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)小鼠雌性BALB/c鼠，5周齡,購(gòu)于南方醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物中心。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)試劑 羊抗gD多抗（SANTA CRUZ），兔抗羊HRP-IgG抗體（廣州威佳公司），F(xiàn)ITC標(biāo)記CD4+、CD8+，PE標(biāo) 記CD3+細(xì)胞單克隆抗體（Invitrogen公司）；MTT（Sigma公司）；干擾素（IFN）-γ、白細(xì)胞介素（IL）-4、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）試劑盒（湖北武漢博士德公司），1640培養(yǎng)液、胎牛血清等（廣州威佳公司）。pVAX-gD、pVAXHsp70和pVAX-Hsp70- HSV2gD質(zhì)粒由本實(shí)驗(yàn)室自行構(gòu)建保存。

1.2 方法

1.2.1 免疫動(dòng)物 40只雌性Balb/c小鼠隨機(jī)分為4組，每組10只：第1組：注射pVAX空質(zhì)粒組，第2組：注射pVAX-HSV2gD組，第3組：注射pVAXHSV2gD+pVAX-Hsp70組（pVAX-HSV2gD質(zhì)粒和pVAX-Hsp70質(zhì)?；旌献⑸洌?，第4組：注射pVAXHsp70-HSV2gD組[3]。4組小鼠均于雙側(cè)脛前肌注射，總?cè)萘繛?00 μl (1 μg/μl)的各種質(zhì)粒DNA溶液，每周免疫1次，共3次。最后1次注射后4周，取小鼠血清及處死后取脾細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)研究。

1.2.2 血HSV-2gD抗體的測(cè)定 免疫完成后從小鼠眼眶取血，用ELISA法測(cè)定小鼠血清中HSV-2gD IgG。以HSV-2gD為包被抗原，實(shí)驗(yàn)小鼠血清為一抗，羊抗鼠HRP-IgG為二抗，顯色后用酶標(biāo)儀波長(zhǎng)450 nm測(cè)OD值。

1.2.3 檢測(cè)脾細(xì)胞培養(yǎng)上清IFN-γ、IL-4濃度小鼠頸椎脫臼處死，分離脾，制備單細(xì)胞懸液，分別用200目、400目絲網(wǎng)過濾細(xì)胞懸液，重懸淋巴細(xì)胞調(diào)整濃度為5×106/ml。100 μl細(xì)胞懸液加入96孔板，再加入50 μl（10 μg/ml）的HSV-2gD糖蛋白，細(xì)胞培養(yǎng)72 h后，離心后取上清測(cè)定IFN-γ、IL-4濃度。

1.2.4 小鼠脾細(xì)胞增殖測(cè)定100 μl終濃度為5 ×106/ml的脾淋巴細(xì)胞加入96孔板，再加入50 μl（10μg/ml）的 HSV-2gD蛋白，培養(yǎng)72 h后，加入 20 μl MTT，37℃溫育4 h，離心去上清，加入150 μl 二甲基亞砜，振蕩10 min，用酶標(biāo)儀490 nm測(cè)定，脾細(xì)胞增殖刺激指數(shù)(SI) =A490實(shí)驗(yàn)孔/A490點(diǎn)對(duì)照孔。

1.2.5 檢測(cè)CD4+、CD8+T細(xì)胞亞群 取脾細(xì)胞懸液0.6 ml（5×106/ml）加入EP管，500×g離心5 min，1 ml洗液洗滌脾淋巴細(xì)胞3次，然后分為相等的2份，一份加入PE-CD3+單抗、FITC-CD4+單抗50 μl，另一份加入PE-CD3+單抗、FITC-CD8+單抗50 μl，4℃反應(yīng)30 min，再次用1 ml洗液洗滌脾淋巴細(xì)胞3次，各加入0.5 ml保存液，流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 gD抗體測(cè)定

測(cè)定結(jié)果表明，gD組、gD+Hsp70組和Hsp70-gD核酸疫苗組血gD特異性抗體濃度較pVAX空質(zhì)粒組高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；Hsp70-gD組血清特異性抗體濃度較gD+Hsp70組、gD組高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。說明疫苗免疫小鼠后可誘導(dǎo)gD抗體的產(chǎn)生，Hsp70-gD疫苗組比gD+Hsp70組、gD組能更好地誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生特異性gD抗體（圖1）。

圖1 血HSV-2gD IgG抗體檢測(cè)水平

2.2 培養(yǎng)上清中IL-4的測(cè)定

IL-4可作為一個(gè)反映體液免疫水平的指標(biāo)。gD組、gD+Hsp70組 和Hsp70-gD組IL-4濃度高于pVAX組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；Hsp70-gD組的IL-4濃度較gD+Hsp70組和gD組高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。提示gD、gD+Hsp70、Hsp70-gD DNA疫苗免疫小鼠后均可誘導(dǎo)體液免疫應(yīng)答，Hsp70-gD誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生的體液免疫效應(yīng)比gD+Hsp70、gD更強(qiáng)（圖2）。

圖2 脾淋巴細(xì)胞培養(yǎng)上清中IL-4的檢測(cè)水平

2.3 培養(yǎng)上清中IFN-γ的測(cè)定

IFN-γ可作為一個(gè)反映細(xì)胞免疫水平的指標(biāo)。gD組、gD+Hsp70組 和Hsp70-gD組IFN-γ水平高于pVAX組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；Hsp70-gD組IFN-γ水平高于gD+Hsp70組、gD組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）（圖3）。

圖3 脾淋巴細(xì)胞培養(yǎng)上清中IFN-γ的檢測(cè)水平

2.4 脾細(xì)胞增殖刺激指數(shù)（SI）檢測(cè)

淋巴細(xì)胞的刺激增殖反應(yīng)能力是細(xì)胞免疫應(yīng)答的一個(gè)重要指標(biāo)。結(jié)果顯示，gD組、gD+Hsp70組和Hsp70-gD疫苗組比pVAX組的脾細(xì)胞SI指數(shù)高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；Hsp70-gD疫苗組的脾細(xì)胞SI指數(shù)高于gD+Hsp70組、gD組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）（圖4）。

圖4 免疫小鼠脾淋巴細(xì)胞SI測(cè)定

2.5 CD4+、CD8+ T細(xì)胞亞群的檢測(cè)

gD組、gD+Hsp70組 和Hsp70-gD組CD4+T細(xì)胞與CD8+T細(xì)胞數(shù)量及CD4+/CD8+T細(xì)胞比值均高于pVAX空質(zhì)粒組。Hsp70-gD組CD4+T細(xì)胞亞群測(cè)值、CD8+T細(xì)胞亞群測(cè)值高于其他3組，而且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），但gD組、gD+Hsp70組和Hsp70-gD組的CD4+/CD8+T細(xì)胞比值差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（表1）。

表1 CD4+、CD8+ T細(xì)胞亞群測(cè)定結(jié)果 （±s）

表1 CD4+、CD8+ T細(xì)胞亞群測(cè)定結(jié)果 （±s）

注：與 pVAX組比較，a P＜0.05；與pVAX- HSV2gD和pVAX-HSV2gD+pVAXHsp70組比較，bP＜0.05

組 別 CD4+T細(xì)胞(%)CD8+T細(xì)胞(%)CD4+T細(xì)胞/CD8+T細(xì)胞pVAX 12.48±1.32 8.52±0.82 1.47±0.13 pVAX- HSV2gD 19.96±1.67a 11.97±1.13a 1.67±0.10a pVAX-HSV2gD 20.58±1.63a 12.20±1.12a 1.69±0.13a+pVAX-Hsp70 pVAX-Hsp70-26.36±2.36ab 15.46±1.25ab 1.72±0.13a HSV2gD

3 討論

DNA疫苗也就是人們常說的核酸疫苗或基因疫苗，就是用含有編碼蛋白翻譯需要的全套調(diào)控元件的質(zhì)粒核酸，通過注射等方式導(dǎo)入動(dòng)物體內(nèi)，誘導(dǎo)免疫動(dòng)物產(chǎn)生靶向該序列編碼蛋白質(zhì)的免疫反應(yīng)。DNA疫苗有以下優(yōu)點(diǎn)：①制備簡(jiǎn)便；②導(dǎo)入的疫苗基因長(zhǎng)期持續(xù)表達(dá)，免疫功能維持時(shí)間長(zhǎng)久；③疫苗表達(dá)的抗原蛋白與自然狀態(tài)更相似[6,7]。已有文獻(xiàn)證實(shí)，核酸疫苗有很好的免疫原性，既可以保護(hù)機(jī)體避免初次感染，起到預(yù)防作用，又可以降低已感染者的復(fù)發(fā)率[8-10]。雖然DNA疫苗可以誘發(fā)免疫應(yīng)答，但在研究中也發(fā)現(xiàn)單獨(dú)采用某一抗原刺激機(jī)體出現(xiàn)的免疫效應(yīng)較弱，為了解決這一問題，常使用的方法就是抗原蛋白聯(lián)合適當(dāng)?shù)拿庖咦魟?，從而達(dá)到增強(qiáng)抗原蛋白的免疫激活效應(yīng)，特別是增強(qiáng)在抗病毒免疫中發(fā)揮主要作用的細(xì)胞免疫活性[11]。

HSV-2由30多種蛋白組成病毒結(jié)構(gòu)蛋白，這些蛋白在保護(hù)病毒核酸、病毒對(duì)機(jī)體的致病過程和刺激機(jī)體產(chǎn)生免疫反應(yīng)中發(fā)揮作用。其中，被認(rèn)為有免疫原性并能誘發(fā)免疫保護(hù)作用的是病毒的gD蛋白。該蛋白在HSV-2增殖和刺激機(jī)體產(chǎn)生中和抗體的過程中起著重要的作用，是機(jī)體發(fā)揮體液免疫及細(xì)胞免疫效應(yīng)的一個(gè)主要靶點(diǎn)。Hsps存在于所有的真核細(xì)胞和原核細(xì)胞中，其結(jié)構(gòu)高度保守。研究表明[12-15]，Hsp70免疫原性強(qiáng)，可作為較理想的免疫佐劑，其可能機(jī)制有：①Hsps可以作為一種免疫“危險(xiǎn)”信號(hào)，直接刺激機(jī)體免疫反應(yīng)。因此，無論是細(xì)菌的Hsps或者由于細(xì)胞的損傷而釋放的自身的Hsps均能刺激免疫系統(tǒng)產(chǎn)生炎癥反應(yīng)。②從細(xì)胞中釋放的Hsp-多肽復(fù)合物，能夠被抗原提呈細(xì)胞（APC）捕獲，激活特異性T淋巴細(xì)胞反應(yīng)，從而誘發(fā)有效的免疫效應(yīng)。盡管大多數(shù)外源性的抗原進(jìn)入主要組織相容性復(fù)合物（MHC）-Ⅱ類分子途徑，從而激活CD4+T細(xì)胞反應(yīng)，但是Hsps-肽段復(fù)合物能夠誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生特異性的CD8+T細(xì)胞反應(yīng)，說明Hsp-肽段復(fù)合物能夠進(jìn)入MHC-Ⅰ類分子提呈途徑。因此，Hsps-肽段復(fù)合物的免疫刺激作用必須依賴于APC。這些研究結(jié)果也提示將外源性抗原傳遞進(jìn)入內(nèi)源性抗原加工途徑可能是Hsps的一種特殊功能，從而誘發(fā)更強(qiáng)的細(xì)胞免疫效應(yīng)。

在 本 實(shí) 驗(yàn) 中 用pVAX-gD、pVAX-Hsp70和pVAX-Hsp70-gD免疫小鼠后，pVAX-gD組、pVAXgD+ pVAX-Hsp70組和pVAX-Hsp70-gD組均可以誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生靶向HSV-2gD蛋白的抗體，刺激小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖并在培養(yǎng)上清中產(chǎn)生IFN-γ、IL-4，刺激CD4+T細(xì)胞與CD8+T細(xì)胞數(shù)量及CD4+/CD8+T細(xì)胞比值升高。其中，pVAX-Hsp70-gD疫苗組在血清HSV-2gD蛋白抗體產(chǎn)生水平升高，脾淋巴細(xì)胞SI、培養(yǎng)上清中IFN-γ和IL-4濃度均顯著高于pVAX-gD組、pVAX-gD+ pVAX-Hsp70組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。IFN-γ是Th1型細(xì)胞因子，主要介導(dǎo)細(xì)胞免疫應(yīng)答；IL-4是Th2型細(xì)胞因子，主要介導(dǎo)體液免疫應(yīng)答，這兩種細(xì)胞因子也常作為粗略反映細(xì)胞免疫和體液免疫的指標(biāo)。本研究結(jié)果提示，構(gòu)建的pVAX-Hsp70-HSV2gD DNA疫苗可以誘導(dǎo)免疫小鼠產(chǎn)生有效的體液和細(xì)胞免疫應(yīng)答，為其在臨床的應(yīng)用打下基礎(chǔ)。