大鼠發(fā)育期熱性驚厥后海馬microRNA差異表達譜的相關(guān)研究*

徐健，李曉東，孫明強，何小華，高振忠

[1.濰坊醫(yī)學院婦幼保健院（濰坊市婦幼保健院），山東 濰坊261011；2.武漢大學 基礎(chǔ)醫(yī)學院，湖北 武漢430071]

熱性驚厥在嬰兒和兒童中很常見，約占2%，是兒童最常見的神經(jīng)系統(tǒng)疾病[1]。根據(jù)美國兒科學會的定義，熱性驚厥是一種無代謝異常或顱內(nèi)感染，與發(fā)熱性疾病相關(guān)的驚厥，可分為單純型驚厥和復雜型驚厥[2]，與體溫達39℃或更高有關(guān)。另有研究發(fā)現(xiàn)，急性電解質(zhì)失衡、發(fā)育遲緩、病毒感染、有發(fā)燒痙攣家族史[3-4]，以及鐵、鋅的缺乏可能是導致熱性驚厥的潛在危險因素[5]。臨床研究表明，單純退熱治療對預(yù)防熱性驚厥復發(fā)無效，與苯巴比妥聯(lián)合使用可有效預(yù)防熱性驚厥的復發(fā)[6]。由于這些藥物潛在的毒性已遠遠超過了兒童熱性驚厥造成的危害，因此迫切需要尋找更多新的生物標志物來預(yù)測、診斷和治療熱性驚厥。

近年來，隨著對非編碼RNA 的深入研究，microRNA（miRNA）在神經(jīng)系統(tǒng)疾病中的作用，尤其是與大腦發(fā)育的關(guān)系越來越受到重視[7-9]。miRNA屬于一個非編碼的微小RNA 家族，是一種重要的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控因子，可以抑制mRNA 翻譯或直接降解靶mRNA[10]。miRNA 對神經(jīng)元的正常發(fā)育至關(guān)重要，與許多神經(jīng)系統(tǒng)疾病有關(guān)，其機制仍有待研究。例如miRNA 在涉及大腦發(fā)育和成人神經(jīng)可塑性的基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中具有重要作用[9]。miR-124a 和miR-9 能夠調(diào)節(jié)胚胎干細胞向神經(jīng)元或膠質(zhì)細胞的分化[11]，而腦特異性miR-9 在調(diào)節(jié)干細胞衍生的神經(jīng)前體細胞的細胞行為中起關(guān)鍵作用。miRNA 作為一種表觀遺傳學調(diào)控方式，在驚厥、癲癇等神經(jīng)系統(tǒng)疾病中發(fā)揮非常重要的作用。

本研究首先通過經(jīng)典熱水浴誘導驚厥的方法復制反復熱性驚厥大鼠模型。隨后利用大鼠miRNA表達譜芯片比較分析大鼠發(fā)育期反復熱性驚厥后海馬和健康大鼠海馬中差異表達的miRNA，并采用多種生物信息學方法如分級聚類分析、功能分類、基因網(wǎng)絡(luò)分析、靶基因預(yù)測分析等對芯片數(shù)據(jù)進行深入挖掘和分析，以獲取大量生物信息。這些候選的易感miRNA 及潛在的芯片數(shù)據(jù)信息對研究熱性驚厥的發(fā)病機制及其與癲癇的發(fā)生、發(fā)展的關(guān)系具有重要的作用，為發(fā)現(xiàn)新的熱性驚厥臨床分子生物靶標提供重要依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 反復熱性驚厥模型的復制

選取10 只SPF 級14 d日齡健康SD 大鼠，通過經(jīng)典熱水浴誘導驚厥，復制熱性驚厥動物模型，連續(xù)熱水浴7 d，按照熱性驚厥的5 級行為學評分標準[12]，選取熱性驚厥行為綜合評分最高的3 只SD 大鼠進行miRNA 表達譜基因芯片分析，同時選取3只健康SD 大鼠。實驗動物生產(chǎn)許可證號：SCXK（鄂）2014-0012；實驗動物使用許可證號：SYXK（鄂）2014-0067。

1.2 實驗方法

1.2.1 miRNA 表達譜基因芯片將兩組大鼠海馬組織樣本送至上?？党苫蚬?，按照安捷倫miRNA 表達譜芯片（大鼠）標準化操作流程進行芯片分析。

1.2.2 差異表達miRNA的篩選從miRNA 表達譜基因芯片中獲得標準化數(shù)據(jù)，首先以隨機方差模型和Limma 算法作為差異鑒別方法，以P<0.05，F(xiàn)C>1.5 為差異基因標準，篩選出兩組間存在差異表達的miRNA。

1.2.3 miRNA靶基因預(yù)測成熟的miRNA 序列均來 自miRBase（http://www.mirbase.org）。分別利用TargetScan（http://www.targetscan.org）和miRDB（http://www.mirdb.org）2 個在線數(shù)據(jù)庫預(yù)測miRNA 的潛在靶基因，并取兩者的交集作為最終候選靶基因。

1.2.4 差異表達miRNA 靶基因的生物信息分析通過生物信息學對上述篩選的候選靶基因進行GO 功能注釋分析。通過計算其P值（Fisher 確切概率法）、富集分數(shù)，可獲得顯著富集的GO 類別。通過GO 功能分析可聚焦具有顯著差異的功能集群，篩選并鑒定感興趣的靶基因與何種基因功能相關(guān)[13]。通過聯(lián)合KEGG 等多種數(shù)據(jù)庫，利用Fisher 精確概率法對候選靶基因的Pathway 進行顯著性富集分析。通過信號通路分析可以篩選及鑒定候選靶基因所參與的Pathway，進而研究靶基因與哪些細胞信號通路的改變相關(guān)。蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)分析是利用STRING 數(shù)據(jù)庫結(jié)合Cytoscape 軟件分析miR-148a-3p 靶基因（蛋白）之間的相互作用關(guān)系。

1.2.5 實時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（qRT-PCR）驗證基因芯片數(shù)據(jù)采用qRT-PCR 驗證差異表達miRNA。通過提取海馬組織總RNA，逆轉(zhuǎn)錄獲得cDNA，并以此為模板。根據(jù)miRNA 序列設(shè)計PCR引物，并檢測其相對表達量；按照Qiagen 試劑盒說明書進行操作。選取U6基因為內(nèi)參基因。根據(jù)公式2-△△Ct=[Ct（target）-Ct（U6）]A-[Ct（target）-Ct（U6）]B，計算miRNA 相對表達量。引物序列見表1。

表1 qRT-PCR引物序列

1.3 統(tǒng)計學方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 11.0 統(tǒng)計軟件。計量資料以均數(shù)±標準差（±s）表示，兩樣本差異分析用t檢驗，多組間比較用單因素方差分析。P<0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 差異表達miRNA聚類分析

分級聚類主要根據(jù)基因表達譜數(shù)據(jù)的相似性，利用Pearson 相關(guān)系數(shù)作為相似性度量，最后將個體樣本進行集群分析。經(jīng)過分級聚類分析，所有實驗樣本被分為2 個主要的不同集群，符合筆者預(yù)期的實驗分組結(jié)果。以P<0.05，F(xiàn)C >1.5 為篩選標準，篩選獲得31個差異表達miRNA，其中包括21個上調(diào)miRNA 和10 個下調(diào)miRNA（見圖1A）。

2.2 qRT-PCR驗證差異表達miRNA

為進一步證實基因芯片數(shù)據(jù)的可靠性，隨機挑選9 個差異表達miRNA。結(jié)果顯示，qRT-PCR 的驗證結(jié)果與基因芯片的結(jié)果相符，證明基因芯片數(shù)據(jù)可靠（見圖1B）。

圖1 差異表達miRNA熱圖和qRT-PCR驗證實驗

2.3 差異表達miRNA的靶基因GO功能和Path‐way分析

為進一步分析篩選得到的差異表達miRNA 的靶基因的GO 功能，利用miRNA 靶基因預(yù)測數(shù)據(jù)庫TargetScan 和miRDB 預(yù)測出3 247 個交集靶基因。利用生物信息學方法對靶基因進行GO 功能分類。以P<0.01 為閾值，獲得顯著差異的GO 功能集群，主要包括基因轉(zhuǎn)錄、神經(jīng)元分化、大腦及海馬發(fā)育等。見圖2。

圖2 31個差異表達miRNA的GO功能分析

同時，以P<0.05 為篩選標準，對差異表達基因參與的顯著性Pathway 進行分析。獲得具有顯著差異的TOP 10 信號通路，主要包括：顯著富集的Pathway 主要包括癌癥相關(guān)、FoxO信號通路、PI3K/Akt信號通路、多巴胺突觸通路等，這些信號通路均與癲癇等神經(jīng)系統(tǒng)疾病的發(fā)病機制密切相關(guān)。見圖3。

圖3 31個差異表達miRNA信號通路分析

2.4 miR-148a-3p靶基因預(yù)測分析

根據(jù)生物信息及文獻檢索分析，筆者選定miR-148a-3p 作為候選易感miRNA 進行后續(xù)研究。首先通過miRNA 靶基因預(yù)測數(shù)據(jù)庫TargetScan 和miRDB 進行靶基因預(yù)測篩選，共獲得186個靶基因，其中120 個靶基因（紅色）參與神經(jīng)、免疫、表觀遺傳等功能，其是驚厥、癲癇等的重要影響因素。見圖4。

2.5 miR-148a-3p靶基因GO功能和Pathway分析

為進一步分析篩選得到的miR-148a-3p 靶基因的GO 功能，利用miRNA 靶基因預(yù)測數(shù)據(jù)庫TargetScan 和miRDB 共預(yù)測186 個交集靶基因（見圖4）。結(jié)合AmiGO 多個數(shù)據(jù)庫的信息對186 個靶基因進行GO 功能分析。以P<0.05 為閾值，獲得具有顯著差異GO 功能分類，包括神經(jīng)元生成及分化、大腦發(fā)育、轉(zhuǎn)化生長因子結(jié)合、組蛋白修飾等多種與神經(jīng)、免疫及表觀遺傳相關(guān)的功能，這些因素與驚厥及癲癇有著非常密切的聯(lián)系（見圖5A～C）。

圖4 miR-148a-3p靶基因預(yù)測結(jié)果

同時，以P<0.05 為閾值，對186 個靶基因所參與的顯著性Pathway 進行分析，獲得具有顯著差異的TOP 10 信號通路，主要包括：FoxO信號通路、PI3K-Akt信號通路、TGF-β信號通路、Hippo信號通路等，這些信號通路都與驚厥和癲癇疾病的發(fā)病機制密切相關(guān)。見圖5D。

2.6 miR-148a-3p 靶基因的蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)分析

通常情況下，基因不是單獨起作用，而是多個基因形成相互作用的復雜的分子網(wǎng)絡(luò)從而控制機體的生物進程。為進一步探索靶基因之間的網(wǎng)絡(luò)關(guān)系，筆者選取186 個交集靶基因，利用STRING 數(shù)據(jù)庫進行靶基因蛋白相互作用分析，結(jié)果表明分子網(wǎng)絡(luò)中紅顏色的基因（Ube2d1、Ube2d2、Ube3b、Skp1、Fbxl19、Ccnf、Smurf2）位于網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的中心，被認為是在該網(wǎng)絡(luò)中起關(guān)鍵調(diào)控作用的基因。見圖6。

2.7 miR-148a-3p的靶基因NCOA1

通過生物信息分析及文獻搜索，筆者發(fā)現(xiàn)NCOA1的功能與神經(jīng)、免疫系統(tǒng)有著密切的聯(lián)系，因此確定NCOA1作為候選靶基因進行驗證。通過TargetScan 數(shù)據(jù)庫分析發(fā)現(xiàn)，NCOA1基因上存在miR-148a-3P 的靶基因作用位點（見圖7）。通過雙熒光素酶報告實驗進一步驗證NCOA1是否為miR-148a-3p 的真正靶基因。將構(gòu)建成功的WT-pGL3-NCOA13'-UTR 載 體、MUT-pGL3-NCOA13'-UTR 載體，分別與miRNA-148a-3p mimics或?qū)φ召|(zhì)粒共轉(zhuǎn)染海馬神經(jīng)元細胞，48 h 后檢測熒光素酶活性。實驗結(jié)果顯示，對照組、miR-148a-3p mimics 組、共轉(zhuǎn)染組的螢火蟲熒光素酶活性分別為（0.96±0.01）、（0.13±0.00）、（0.98±0.10），經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計學意義（F=224.899，P=0.000）。與對照組比較，miR-148a-3p mimics 組和共轉(zhuǎn)染組的熒光素酶活性受到抑制（P<0.05），而miR-148a-3p mimics 組與共轉(zhuǎn)染組比較，差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。實驗結(jié)果表明，miR-148a-3p 與NCOA1的靶位點共同存在時，才能抑制熒光素酶基因表達，將靶位點部分堿基突變后，則不能發(fā)揮抑制作用。實驗表明NCOA1是miR-148a-3p 作用的靶基因，下一步可進行其功能機制的研究。

圖5 miR-148a-3p預(yù)測靶基因的GO功能和Pathway分析

圖6 miR-148a-3p 靶基因蛋白網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)圖

圖7 TargetScan數(shù)據(jù)庫預(yù)測靶基因位點示意圖

3 討論

熱性驚厥在0～5 歲幼兒和兒童中常見，多種因素可能會增加熱性驚厥風險[10]。不同種類的miRNA 在大腦中表達，并在驚厥及癲癇等神經(jīng)疾病中發(fā)揮關(guān)鍵作用。其中miR-148a-3p 參與免疫系統(tǒng)的發(fā)育和動態(tài)平衡，且參與多種類型的癌癥、自身免疫性疾病、炎癥疾病及其他病理過程。鑒于以上原因，本研究利用miRNA 表達譜基因芯片技術(shù)，探討miRNA 在熱性驚厥中的作用機制，以期更好地研究熱性驚厥的病理機制。

本研究首先復制熱性驚厥大鼠模型，利用miRNA 表達譜基因芯片技術(shù)對驚厥和健康大鼠海馬組織miRNA 表達進行深入分析。根據(jù)分級聚類分析的結(jié)果，6 組實驗樣本被分成2 個不同集群，由此可推斷出實驗樣本分類是可靠的，與預(yù)期結(jié)果相符。經(jīng)過信息分析，獲得31個差異表達miRNA 及相關(guān)的功能信息。21 個miRNA 顯著上調(diào)，包括miR-542-5p、miR-499-5p、miR-148a-3p、miR-451-5p。11個miRNA顯著下調(diào)，其中以miR-207、miR-130b-3p下調(diào)最為顯著。這些差異表達miRNA 是否參與熱性驚厥的發(fā)生、發(fā)展過程需要進一步研究。同時，為驗證基因芯片數(shù)據(jù)的可靠性，選取10 個差異表達miRNA，利用qRT-PCR 進行驗證，結(jié)果與芯片結(jié)果相符，為后續(xù)表達譜基因芯片的分析提供可靠的基礎(chǔ)。

隨后，經(jīng)過信息綜合分析發(fā)現(xiàn)miR-148a-3p 在海馬組織的表達水平升高，與qRT-PCR 結(jié)果一致，因此選取miR-148a-3p 進行深入研究和分析。差異表達miR-148a-3p 的功能與神經(jīng)免疫、細胞凋亡都有密切聯(lián)系。最新研究表明，在缺血性腦卒中疾病中，miR-148a-3p 可以與lncRNA-h19和ROCK2基因形成作用路徑，進而調(diào)節(jié)由于缺血性腦卒中造成的氧化應(yīng)激[14]。另外，miR-148a-3p 可以靶向KLF6基因，調(diào)節(jié)骨骼肌細胞的增殖和凋亡[15]。miR-148a 作為miR-148a-3p 的前體，與其有著同樣的活性，并且可以調(diào)控多種神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育相關(guān)的蛋白因子。在帕金森和阿爾茨海默病等神經(jīng)系統(tǒng)疾病中，miR-148a 的表達存在顯著異常。生物信息分析篩選獲得的其他差異表達的miRNA 也值得去研究，其功能都與神經(jīng)免疫等因素有緊密的聯(lián)系。研究表明，在缺血缺氧性腦病中，miR-499-5p可以通過調(diào)節(jié)C 反應(yīng)蛋白的表達水平發(fā)揮神經(jīng)保護作用[16]。miR-207 可能參與了OSA 誘導的認知障礙。另外，miR-130b-3p 可以抑制eCIRP 誘導的炎癥反應(yīng)[17]。

筆者通過TargetScan 和miRDB 數(shù)據(jù)庫預(yù)測miR-148a-3p 的靶基因，獲得交集靶基因186 個。利用相關(guān)數(shù)據(jù)庫信息構(gòu)建靶基因關(guān)系圖。在網(wǎng)絡(luò)關(guān)系圖中發(fā)現(xiàn)KLF6基因被證實是miR-148a-3p 的靶基因，并且可以促進神經(jīng)元的軸突再生[18]。同時,在預(yù)測的靶基因中，發(fā)現(xiàn)多個靶基因與神經(jīng)免疫功能密切相關(guān)。例如，NCOA1、NOG、NPTN等。NCOA1又名SRC-1，可以影響大鼠海馬突觸可塑性和空間學習記憶能力，并且可以影響下丘腦神經(jīng)元的功能。隨后筆者通過雙熒光素酶報告實驗驗證NCOA1是miR-148a-3p 調(diào)節(jié)的靶基因。另有研究發(fā)現(xiàn)，基因NOG拮抗劑可以恢復海馬神經(jīng)干細胞的數(shù)量和神經(jīng)生成，同時可以促進髓鞘的修復[19]。Neuronplastin（NPTN）作為一種多功能的神經(jīng)元黏附分子，與長時程的突觸可塑性密切相關(guān)[20]。

選取miR-148a-3p 的186 個候選靶基因進行GO功能和Pathway 分析。分析結(jié)果提示熱性驚厥與神經(jīng)免疫炎癥關(guān)系密切，為研究免疫炎癥在熱性驚厥中的作用提供了重要線索。例如，顯著GO 功能包括神經(jīng)元分化、大腦發(fā)育、突觸發(fā)生等。在差異顯著Pathway 中，F(xiàn)oxO信號通路存在顯著差異。在癲癇狀態(tài)下，通過激活FoxO信號通路可引起驚厥誘導的神經(jīng)元的死亡[21]。同時，F(xiàn)oxO信號通路家族可以參與多種病理條件下的細胞死亡[22]。FoxO1和FoxO2在免疫細胞的發(fā)育、分化中起重要作用。FoxO1和FoxO3可以促進調(diào)節(jié)性T 細胞的形成，抑制Th1 和Th17 細胞的形成[23]。

最新研究表明，miRNA 與神經(jīng)系統(tǒng)疾病中海馬神經(jīng)元的凋亡密切相關(guān)[24-25]。miR-223 表達上調(diào)可以抑制驚厥大鼠的海馬神經(jīng)元凋亡和大腦損傷[26]。miR-421 可以通過TLR 受體信號通路進而抑制癲癇大鼠的海馬神經(jīng)元凋亡[27]。沉默miR-134 可以減輕癲癇大鼠的海馬神經(jīng)元損傷及自發(fā)驚厥頻率[28]。另有研究表明，miR-148a-3p 與細胞凋亡關(guān)系密切。miR-148a-3p 與DNMT1 形成調(diào)控路徑，促進腫瘤的增生[29]。另有研究表明，在急性胰腺炎疾病中，miR-148a-3p 可以通過靶向PTEN 來抑制細胞壞死[30]。上調(diào)miR-210-3p 可以抑制缺氧誘導的海馬神經(jīng)元凋亡[31]。miR-34a 抑制劑可以通過Wnt信號通路調(diào)節(jié)海馬神經(jīng)元細胞凋亡[32]。在前面的研究中，課題組采用miRNA 表達譜芯片及qRT-PCR證實大鼠發(fā)育期反復驚厥后海馬miR-148a-3p 顯著上調(diào)，提示miR-148a-3p 可能參與驚厥的發(fā)生、發(fā)展。其可能通過分析結(jié)果中預(yù)測的某個靶基因或者信號通路參與驚厥的發(fā)生、發(fā)展過程。

綜上所述，本研究通過對反復驚厥大鼠海馬miRNA 表達譜基因芯片進行分析，獲得一系列的差異表達miRNA 和候選預(yù)測靶基因的GO 及Pathway等相關(guān)信息。這些豐富的數(shù)據(jù)對于后期研究熱性驚厥的發(fā)病機制起重要的提示作用，為發(fā)現(xiàn)新的熱性驚厥臨床分子靶標提供有利的證據(jù)。