基于轉(zhuǎn)錄組學(xué)技術(shù)研究老年原發(fā)性高血壓腎氣虧虛證的理論探討*

孫儀萱，張 磊，戴 霞

(1.山東中醫(yī)藥大學(xué) 2018級碩士研究生，山東 濟南 250000； 2.山東中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院心內(nèi)科，山東 濟南 250000; 3.山東中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)養(yǎng)生學(xué)教研室，山東 濟南 250355)

心腦血管健康是人體健康的重要組成部分，一旦出現(xiàn)相關(guān)疾病，就會使患者的生命健康受到極大威脅。原發(fā)性高血壓是誘發(fā)心腦血管疾病的危險因素之一，是較常見的慢性疾病，其中老年原發(fā)性高血壓是原發(fā)性高血壓的基本臨床亞型之一。我國公民原發(fā)性高血壓患病率為25.2%，全國每年因其致死的人數(shù)有二百余萬，其中老年患者占66.6%[1-4]。動脈硬化、器官功能受損等導(dǎo)致老年原發(fā)性高血壓患者血壓波動大，易產(chǎn)生復(fù)雜的并發(fā)癥，從而給機體造成不可逆的損傷，病死率高，嚴(yán)重威脅著老年人的生命健康。同時，老年原發(fā)性高血壓遷延難愈、難以控制，加重了患者的醫(yī)療負(fù)擔(dān)；其普遍性亦加重了社會醫(yī)療保障體系的經(jīng)濟壓力，給社會的發(fā)展和進步帶來不利影響。因此，對老年原發(fā)性高血壓的發(fā)病機制和治療進行研究刻不容緩。目前，已有多種技術(shù)應(yīng)用于原發(fā)性高血壓的研究。邵澤[5]采用超高效液相色譜與四極桿飛行時間質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)(UHPLC-Q-TOF/MS)探討原發(fā)性高血壓陰虛陽亢證的代謝組學(xué)特征，最終找到38個差異代謝物，為明確原發(fā)性高血壓陰虛陽亢證的生物標(biāo)志物提供了可能性。夏立立[6]應(yīng)用極速脈搏波技術(shù)分析中藥潛陽育陰顆粒對老年原發(fā)性高血壓晝夜節(jié)律異?；颊呦嚓P(guān)中醫(yī)證候的改善及對血管彈性的影響，對老年原發(fā)性高血壓的治療及預(yù)后提供了思路。吳靜等[7]應(yīng)用組織多普勒成像技術(shù)于心尖四腔觀獲取右心室側(cè)壁右房室瓣環(huán)處心肌運動頻譜圖，用以評價老年原發(fā)性高血壓患者右心室功能，為原發(fā)性高血壓并發(fā)癥的研究開拓了新思路。但是，轉(zhuǎn)錄組學(xué)應(yīng)用于老年原發(fā)性高血壓的相關(guān)研究相對匱乏，故對其做下述分析。

1 轉(zhuǎn)錄組學(xué)技術(shù)概述

隨著后基因組時代的來臨與發(fā)展，相關(guān)研究成果日益涌現(xiàn)。有學(xué)者于2001年提出系統(tǒng)生物學(xué)，即探究生物體的基因、蛋白質(zhì)及代謝物在一些特定因素(如遺傳、化學(xué)、外部環(huán)境等)干預(yù)之下會有何種變化，構(gòu)建相關(guān)數(shù)學(xué)模型，從而實現(xiàn)對生命體生命活動及生物功能的認(rèn)知和預(yù)測。它包含了轉(zhuǎn)錄組學(xué)、基因組學(xué)、蛋白組學(xué)及代謝組學(xué)等學(xué)科，其中，轉(zhuǎn)錄組學(xué)率先發(fā)展起來且應(yīng)用最為廣泛[8]。轉(zhuǎn)錄組學(xué)是在整體水平上研究生物體特定生理條件下或某一階段中某一細(xì)胞或組織所有基因轉(zhuǎn)錄情況及基因調(diào)控規(guī)律的學(xué)科[9]。它的研究對象為轉(zhuǎn)錄組，轉(zhuǎn)錄組的概念由Victor等[10]在1997年研究酵母基因的表達(dá)時提出。轉(zhuǎn)錄組可分為廣義與狹義兩個層面。廣義的轉(zhuǎn)錄組指在一個活細(xì)胞中經(jīng)由基因轉(zhuǎn)錄出的所有核糖核酸(ribonucleic acid，RNA)的總和，在這些RNA中包含信使核糖核酸(messenger RNA， mRNA)和非編碼核糖核酸(non-coding RNA，ncRNA)兩種。狹義的轉(zhuǎn)錄組是指mRNA，其作用是編碼蛋白質(zhì)。遺傳學(xué)著名的中心法則揭示了生物體內(nèi)的mRNA將脫氧核糖核酸(deoxyribonucleic acid，DNA)上的遺傳信息傳遞到蛋白質(zhì)，此過程即為轉(zhuǎn)錄，完成了由DNA到蛋白質(zhì)之間的信息傳遞，實現(xiàn)了基因?qū)ι矬w生理機能的調(diào)控。

近十幾年來，隨著分子生物學(xué)技術(shù)及高通量技術(shù)的快速發(fā)展，尤其是下一代測序(next-generation sequencing，NGS)平臺的市場化，轉(zhuǎn)錄組學(xué)測序技術(shù)以其成熟的整體性、系統(tǒng)性、個體組織差異性、時間獨立性等優(yōu)勢徹底改進了轉(zhuǎn)錄組學(xué)的思維方式，更好地推動了轉(zhuǎn)錄組學(xué)的研究。目前，轉(zhuǎn)錄組學(xué)測序技術(shù)包括RNA測序(RNA sequencing,RNA-seq)、基因表達(dá)系列分析技術(shù)(serial analysis of gene expression,SAGE)、序列標(biāo)簽技術(shù)(expressed sequence tags,EST)，以及大規(guī)模平行測序技術(shù)(massively parallel signature sequencing,MPSS)[11]。在這些技術(shù)之中，EST是作為先驅(qū)而較早發(fā)展。隨著相關(guān)研究的不斷發(fā)展、相關(guān)技術(shù)的不斷進步，在高通量測序條件下出現(xiàn)了RNA-seq、SAGE和MPSS等新興轉(zhuǎn)錄組學(xué)的研究方法。其中，基于NGS技術(shù)發(fā)展起來的RNA-seq測序技術(shù)，相比于其他方法，測序通量更高，測序速度更快，同時兼具信噪比高和價格低等優(yōu)勢，成為目前轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析的主要手段。

轉(zhuǎn)錄組學(xué)作為近年來新興起的臨床科研熱點，主要研究目的包括：對所有轉(zhuǎn)錄組進行分類，確定基因的轉(zhuǎn)錄結(jié)構(gòu)、剪接形式及其他轉(zhuǎn)錄后修飾等；對細(xì)胞或組織在不同情況下的基因表達(dá)水平進行量化分析，從而有助于進一步的臨床研究。通過轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析，可以揭示內(nèi)在的基因表達(dá)與外在的生命現(xiàn)象之間的聯(lián)系，以便更加深刻地理解機體發(fā)育和生理病理機制。在目前的臨床科研中，轉(zhuǎn)錄組學(xué)在針對疾病的基因突變規(guī)律、發(fā)生的機制及致病基因控制的關(guān)鍵靶點等領(lǐng)域已經(jīng)發(fā)揮了重要的作用，對于疾病預(yù)防、診斷、個性化治療及預(yù)后等方面具有重要的指導(dǎo)意義。

2 轉(zhuǎn)錄組學(xué)在中醫(yī)證候研究中的應(yīng)用

證候是中醫(yī)學(xué)理論中隨著疾病的發(fā)生發(fā)展而變化的、揭示人體在疾病中的病理本質(zhì)的概念，包含了病位、病因、病性及正邪強弱關(guān)系等信息，是中醫(yī)學(xué)整體觀念的集中體現(xiàn)，也是中醫(yī)認(rèn)識疾病和辨證論治的基礎(chǔ)。在整個中醫(yī)學(xué)術(shù)界的研究問題之中，證候研究是一個重點、難點問題，需要對其加以更大的關(guān)注度和研究力度。中醫(yī)的證候是由望、聞、問、切四診合參所獲得的癥狀與體征的信息匯總而來，具有模糊性與主觀性，無法用微觀的量化標(biāo)準(zhǔn)去衡量，局限了中醫(yī)與現(xiàn)代科學(xué)的結(jié)合，阻礙了中醫(yī)藥理論國際化發(fā)展。因此，只有采用與證候復(fù)雜性相適應(yīng)的系統(tǒng)生物學(xué)理論及思維方法對其進行研究，將外在證候與疾病本質(zhì)有機地整合起來，才有可能揭示其科學(xué)內(nèi)涵。而轉(zhuǎn)錄組學(xué)的時間性與整體性與中醫(yī)證候理論中隨疾病轉(zhuǎn)歸而變化的辨證方法不謀而合，同時其微觀性特點彌補了中醫(yī)學(xué)理論在微觀領(lǐng)域的不足。此外，目前中醫(yī)證候?qū)W基礎(chǔ)研究[12]在分子領(lǐng)域是以探尋證候物質(zhì)——生物標(biāo)志物群基礎(chǔ)為目的，通過對基因組、蛋白組，以及作為兩者之間樞紐的轉(zhuǎn)錄組進行研究來發(fā)現(xiàn)其中的表達(dá)異常和特異代謝組分。研究轉(zhuǎn)錄組可以解讀基因組功能元件以揭示細(xì)胞或組織的分子成分，也可以理解細(xì)胞、組織生長和疾病發(fā)展的過程[13]，有利于解釋證候的發(fā)生發(fā)展機制。

隨著轉(zhuǎn)錄組學(xué)技術(shù)的發(fā)展及中醫(yī)證候?qū)W理論研究的深入，近年來已有不少學(xué)者將轉(zhuǎn)錄組學(xué)成功運用于中醫(yī)證候分析與藥物治療中，并取得了良好進展。羅琦等[14]對腸易激綜合征脾虛腹瀉患者進行研究，發(fā)現(xiàn)患者結(jié)腸黏膜中的5-羥色胺受體使核糖核酸出現(xiàn)異常表達(dá)，此有可能是致病原因。廖江銓等[15]運用高通量測序技術(shù)和實時聚合酶鏈反應(yīng)(real-time PCR)技術(shù)篩選血瘀型冠心病相關(guān)差異表達(dá)長鏈非編碼RNA(long noncoding RNA,lncRNA)，發(fā)現(xiàn)血瘀型冠心病組39個lncRNA差異表達(dá)(Fold change>2，p-value<0.05)，上調(diào)和下調(diào)的lncRNA分別為3個和36個。楊嬋娟等[16]采用Aglient表達(dá)譜芯片篩選了正常人表達(dá)基因與慢性乙型肝炎患者表達(dá)基因的不同點，在選擇出其中的表達(dá)基因之后，通過數(shù)據(jù)庫的數(shù)據(jù)資料對這部分表達(dá)基因進行分析，并構(gòu)建其動態(tài)網(wǎng)絡(luò)。經(jīng)過上述研究，最終找到最具有顯著差異的9個表達(dá)基因(LOC340508、HIST2H2BE、MPL、FLJ22536、TUBA8、NT5M、EGFL7、PTPRF、TSPAN33)，而這幾種表達(dá)基因廣泛應(yīng)用于細(xì)胞生長、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、免疫反應(yīng)、炎癥反應(yīng)及DNA損傷等領(lǐng)域。王東生等[17]使用大黃蟲丸對動脈栓塞患者進行了治療，并將藥物干預(yù)前后血小板中的基因進行了對比，最終篩選出了243個差異基因。

3 基于轉(zhuǎn)錄組學(xué)技術(shù)研究老年原發(fā)性高血壓腎氣虧虛證的理論探索

中醫(yī)學(xué)認(rèn)為，老年人因本虛標(biāo)實而罹患老年原發(fā)性高血壓。本虛即正氣虛，先天之精不足，而腎納先天之精，主骨生髓。髓海為腦，髓海失去腎精濡養(yǎng)，腦與腎上下俱虛，遂發(fā)為眩暈。此為老年原發(fā)性高血壓腎氣虧虛證的基本病機，在臨床實踐中得到了印證。如：劉志軍等[18]將515例原發(fā)性高血壓患者進行辨證分型，發(fā)現(xiàn)腎氣虧虛證患者最多(69例，占13.4%)，提示腎氣虧虛證是老年原發(fā)性高血壓的主要證型；于杰等[19]采用益腎降壓方藥治療老年女性原發(fā)性高血壓腎氣虧虛證，結(jié)果提示益腎降壓方可調(diào)節(jié)老年女性原發(fā)性高血壓腎氣虧虛的特征性激素指標(biāo)E2的釋放，有效減少及延緩合并癥，保護靶器官，從而改善患者的身體狀況、提高生活質(zhì)量。故筆者對基于轉(zhuǎn)錄組學(xué)技術(shù)研究老年原發(fā)性高血壓腎氣虧虛證的可行性進行了探討。

首先，理論可行。老年原發(fā)性高血壓腎氣虧虛證具有整體性與動態(tài)性，靶點多，病機復(fù)雜，無法通過單一的微觀定量分析進行研究。現(xiàn)代生物數(shù)學(xué)觀點認(rèn)為：有大量的非線性現(xiàn)象出現(xiàn)在生命科學(xué)的研究之中。對于這些非線性現(xiàn)象規(guī)律的解釋，可以通過引入類似人腦辨析思維的“神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)”及非線性動力學(xué)為主的理論和方法，并建立相關(guān)數(shù)學(xué)模型來實現(xiàn)。轉(zhuǎn)錄組學(xué)反映的是在整體水平上生物體某一階段或特定生理條件下某一細(xì)胞或組織所有基因轉(zhuǎn)錄情況及基因調(diào)控規(guī)律，對其進行研究可以從整體的角度捕捉細(xì)胞及生物體的生理、病理活動的動態(tài)性。而原發(fā)性高血壓腎氣虧虛證的外在癥狀與內(nèi)在機制會隨著疾病進程的推進而不斷發(fā)展變化。兩者的理論特性不謀而合。同時，轉(zhuǎn)錄組學(xué)的微觀性特點彌補了中醫(yī)學(xué)理論中老年原發(fā)性高血壓腎氣虧虛證在微觀領(lǐng)域認(rèn)知的不足。除此之外，轉(zhuǎn)錄組作為基因組與蛋白組聯(lián)系的中間樞紐，對其進行研究可以反映基因組功能元件的作用，揭示細(xì)胞、組織的生長過程及疾病產(chǎn)生、發(fā)展更根源的問題，進一步探索老年原發(fā)性高血壓腎氣虧虛證的更微觀的病理機制，對疾病發(fā)展中的潛在危險進行預(yù)測，與中醫(yī)“上工治未病”的思想觀念更吻合，可為中醫(yī)治未病思想及臨床科學(xué)用藥提供理論依據(jù)。

第二，技術(shù)可行。首先，隨著高通量的RNA-seq技術(shù)的出現(xiàn)與發(fā)展，轉(zhuǎn)錄組學(xué)技術(shù)逐漸成熟與完善，被廣泛應(yīng)用于生物學(xué)及醫(yī)學(xué)領(lǐng)域。其在醫(yī)學(xué)界的逐步普及證明了其應(yīng)用于醫(yī)學(xué)研究的可行性。目前，研究者們已開辟出了成熟的技術(shù)路線，有大量系統(tǒng)的研究思路可以借鑒。其次，在中醫(yī)學(xué)研究中，中醫(yī)證候?qū)W研究一直是熱點，也是一直以來阻礙中醫(yī)學(xué)與現(xiàn)代科學(xué)接軌、走向世界的一大難點問題，急需尋找一個可同時與中醫(yī)證候?qū)W、現(xiàn)代科學(xué)思路相吻合的研究方法，轉(zhuǎn)錄組學(xué)應(yīng)用于中醫(yī)證候?qū)W研究即是其中的一個新思路。

第三，目前，轉(zhuǎn)錄組學(xué)技術(shù)應(yīng)用于老年原發(fā)性高血壓腎氣虧虛證的相關(guān)研究欠缺。通過檢索大量文獻(xiàn)可知，目前轉(zhuǎn)錄組學(xué)應(yīng)用于中醫(yī)臨床多個領(lǐng)域。田蕾等[20]基于轉(zhuǎn)錄組學(xué)測序技術(shù)分析肝失疏泄人群的差異表達(dá)基因，發(fā)現(xiàn)肝失疏泄人群與肝主疏泄組相比有55個顯著差異基因，其中上調(diào)基因35個，下調(diào)基因有20個。趙利南等[21]運用RNA-seq技術(shù)篩選活血化瘀治法干預(yù)下大鼠乳腺癌的關(guān)鍵基因，得出：PBCRS可能通過干預(yù)乳腺癌組織中的FBPI的表達(dá)從而抑制乳腺癌發(fā)生的結(jié)論。王階等[22]運用差異顯示法、實時聚合酶鏈反應(yīng)、半點雜交法、高通量芯片、測序等方法對312例冠心病血瘀證患者外周血進行研究，確立了冠心病長鏈非編碼核糖核酸-微小核糖核酸-信使核糖核酸3個層面的潛在生物標(biāo)志物。但是，針對老年原發(fā)性高血壓腎氣虧虛證患者的轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析研究欠缺，成果鮮有報道，老年原發(fā)性高血壓腎氣虧虛證在轉(zhuǎn)錄組學(xué)層面的生物學(xué)本質(zhì)尚未探明，亟需開展相關(guān)研究。

4 小 結(jié)

綜上所述，基于轉(zhuǎn)錄組學(xué)技術(shù)研究老年原發(fā)性高血壓腎氣虧虛證具有良好的可行性，能夠從基因表達(dá)層面了解機體的代謝變化，為闡釋老年原發(fā)性高血壓腎氣虧虛證提供更根源的理論基礎(chǔ)，形成更系統(tǒng)的病理分析，從而更好地揭示老年原發(fā)性高血壓腎氣虧虛證的生物學(xué)本質(zhì)，為臨床治療與新藥研發(fā)提供新思路、新靶點。