類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎中的外泌體及其作用研究進(jìn)展

孫 勇 趙 創(chuàng) 劉志丹

1.上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬曙光醫(yī)院寶山分院康復(fù)醫(yī)學(xué)科，上海 201999；2.上海市寶山區(qū)中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院康復(fù)醫(yī)學(xué)科，上海 201999；3.上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬曙光醫(yī)院寶山分院針灸科，上海 201999

近些年來(lái)，外泌體越來(lái)越受到研究者們的關(guān)注。最初，它們被認(rèn)為是無(wú)用的細(xì)胞代謝廢物，但在隨后的研究中逐漸發(fā)現(xiàn)外泌體能通過(guò)轉(zhuǎn)移蛋白、脂質(zhì)、編碼RNA、非編碼RNA 等物質(zhì)至靶細(xì)胞或分子發(fā)揮作用。對(duì)于類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎（rheumatoid arthritis，RA）而言，外泌體既可以是致病原因，也可以是疾病的生物標(biāo)志物，還可以是治病的工具和手段。本文就這幾方面問(wèn)題進(jìn)行了回顧和梳理。

1 RA 的生物標(biāo)志物

近年研究發(fā)現(xiàn)：外泌體的內(nèi)容物包括核酸、蛋白質(zhì)、各種微RNA（microRNA，miRNA）、DNA 及多種脂質(zhì)物質(zhì)，例如神經(jīng)酰胺、鞘磷脂-髓磷脂、磷脂酰膽堿、磷脂酰絲氨酸、磷脂酰乙醇胺和膽固醇等。外泌體攜帶的一部分內(nèi)容能反映親代細(xì)胞的生理或病理狀況[1]，因此外泌體可作為疾病診斷的生物標(biāo)志物。

研究顯示，RA 中外泌體來(lái)源的miR-424[2]、miR-221-3p[3]、miR-223-3p[4]高表達(dá)，miR-548a-3p[5]、miR-1915-3p[6]低表達(dá)，均可作為本病的潛在標(biāo)志物。RA患者血液?jiǎn)魏思?xì)胞和血清外泌體中同源框轉(zhuǎn)錄反義RNA（homehox transcript antisense RNA，HOTAIR）高表達(dá)[7]，導(dǎo)致活躍的巨噬細(xì)胞遷移；相反，在分化的破骨細(xì)胞和滑膜細(xì)胞中檢測(cè)到顯著較低水平的HOTAIR。蛋白質(zhì)質(zhì)譜分析[8]在活動(dòng)性RA 患者中鑒定出的Toll 樣受體3 則呈現(xiàn)異常的高表達(dá)，提示RA 血清外泌體中含炎癥相關(guān)蛋白，在RA 發(fā)病過(guò)程中有重要作用。

2 促炎作用

2.1 分泌促炎性細(xì)胞因子

機(jī)體的炎癥過(guò)程受致炎和抑炎細(xì)胞的動(dòng)態(tài)平衡調(diào)節(jié)。外泌體介導(dǎo)了細(xì)胞與細(xì)胞間交流，促進(jìn)了炎癥因子的分泌，從而引起了炎癥的發(fā)生。

研究顯示，RA 患者體內(nèi)的外泌體可抑制CD8+T細(xì)胞、B 細(xì)胞、自然殺傷細(xì)胞的增殖，促進(jìn)Treg 細(xì)胞的分化，抵御巨噬細(xì)胞引起的炎癥反應(yīng)，促進(jìn)Th1細(xì)胞的增殖[9]。血小板來(lái)源的外泌體[10]和膠原蛋白、膠體蛋白相互作用后可以表達(dá)白細(xì)胞介素（interleukin，IL）-1，從而導(dǎo)致成纖維樣滑膜細(xì)胞（fibroblast-like synoviocyte，F(xiàn)LS）釋放的IL-6 和IL-8 增加。PEV 進(jìn)入發(fā)炎關(guān)節(jié)后，其磷脂膜被轉(zhuǎn)化成促炎介質(zhì)12 羥基二十碳四烯酸，再次加劇炎癥。同時(shí)，外泌體將血小板磷脂膜釋放的花生四烯酸運(yùn)輸?shù)窖“搴蛢?nèi)皮細(xì)胞，從而誘導(dǎo)環(huán)氧化酶2 和凝血素A2 的生成，同時(shí)活化血小板、促進(jìn)合成前列腺環(huán)素-2，進(jìn)一步加重RA 進(jìn)程。RA 患者滑膜液和滑膜成纖維細(xì)胞的外泌體中含有大量的DNA 結(jié)合/分化抑制因子1，它能促進(jìn)成纖維細(xì)胞增生、抑制IL-6 和IL-8 的分泌，參與RA 的發(fā)病機(jī)制[11]。

2.2 表達(dá)特殊的膜蛋白

在過(guò)去的20 年里，大多數(shù)外泌體的研究都集中在核酸組成和鄰近細(xì)胞轉(zhuǎn)移。然而，外泌體也攜帶特殊的膜蛋白，可以識(shí)別其親代細(xì)胞的生理和病理狀態(tài)。有研究[12]顯示：膜結(jié)合形式的腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor，TNF）-α 存在于RA 患者滑膜成纖維細(xì)胞外泌體中，而在骨關(guān)節(jié)炎患者滑膜成纖維細(xì)胞外泌體中未見(jiàn)膜結(jié)合形式的TNF-α。RA 滑膜成纖維細(xì)胞外泌體被抗CD3 激活的T 細(xì)胞有效地吸收，激活蛋白激酶和核因子κB，誘導(dǎo)膠原酶-1 產(chǎn)生，從而促進(jìn)炎癥，并使這些活化的T 細(xì)胞具有抗凋亡的能力。

2.3 釋放促炎miRNA

miRNA 不僅存在于細(xì)胞內(nèi)發(fā)揮著生物學(xué)功能，也存在于細(xì)胞分泌的外泌體中；細(xì)胞內(nèi)的miRNA 也可以跟隨外泌體的釋放進(jìn)入或影響其他細(xì)胞，從而發(fā)揮生物學(xué)功能。

例如：外泌體來(lái)源的miR-21 和miR-29a 能夠通過(guò)與這些細(xì)胞中的Toll 樣受體7 相互作用激活小膠質(zhì)細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和神經(jīng)元，從而導(dǎo)致促炎性細(xì)胞因子如TNF-α 和IL-6 的分泌，加重RA 炎癥[13]；樹突狀細(xì)胞來(lái)源的外泌體miR-155 及miR-146a 可介導(dǎo)FLS 與其他免疫細(xì)胞間的信息交流與物質(zhì)交換，從而調(diào)控RA 的疾病進(jìn)程[14]；巨噬細(xì)胞和FLS 釋放含有miR-let-7b 的外泌體，進(jìn)入發(fā)炎關(guān)節(jié)的髓樣細(xì)胞連接Toll樣受體后，誘導(dǎo)髓樣細(xì)胞分化為M1 巨噬細(xì)胞，進(jìn)而釋放TNF、IL-1、IL-6 等一些促炎性細(xì)胞因子，加重RA 關(guān)節(jié)炎癥[15]；外泌體攜帶的miR-17通過(guò)抑制轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子受體Ⅱ表達(dá)來(lái)抑制Treg 細(xì)胞的分化，促進(jìn)RA 的發(fā)展[16]。

3 骨破壞作用

骨代謝是一個(gè)機(jī)體中破骨效應(yīng)和成骨效應(yīng)此消彼長(zhǎng)的過(guò)程。RA 中的骨破壞作用主要體現(xiàn)在軟骨組織的破壞、破骨細(xì)胞的增多從而影響骨形成和促進(jìn)骨吸收兩方面。

破骨效應(yīng)方面，有研究[17]顯示，RA 機(jī)體中軟骨組織和軟骨細(xì)胞中丙酮酸脫氫酶激酶4（pyruvate dehydrogenase kinase 4，PDK4）低表達(dá)，miR-106b 是PDK4的上游調(diào)控因子，且在RA 滑膜成纖維細(xì)胞和滑膜成纖維細(xì)胞衍生的外泌體中高表達(dá)。miR-106b通過(guò)外泌體從SFs 傳遞到軟骨細(xì)胞，抑制軟骨細(xì)胞增殖和遷移，加速細(xì)胞凋亡，并通過(guò)下調(diào)PDK4 影響核因子κB配體/RANK/骨保護(hù)素系統(tǒng)。

在骨形成和吸收方面，據(jù)報(bào)道[18]，破骨細(xì)胞miR-214-3p 的增加與老年骨折女性血清miR-214-3p 升高及卵巢切除小鼠的骨形成減少有關(guān)，靶向抑制破骨細(xì)胞miR-214-3p 可促進(jìn)老齡卵巢切除大鼠的骨形成。表明含有miR-214 的破骨細(xì)胞衍生外泌體能抑制成骨細(xì)胞活性，在破骨細(xì)胞中抑制miR-214-3p可能是治療諸多骨形成減少的骨骼疾病的一種策略。

4 抑炎作用

除了上述促炎作用，外泌體及其衍生物在不同環(huán)境條件下，還可能起抑炎作用。

首先，一部分外泌體可分泌miRNA 抑制炎癥。例如：含有miR-150-5p 的間充質(zhì)干細(xì)胞（mesenchymal stem cell，MSC）衍生的外泌體能下調(diào)基質(zhì)金屬蛋白酶14 和血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子的表達(dá)，通過(guò)下調(diào)滑膜細(xì)胞增殖和血管生成來(lái)減少關(guān)節(jié)破壞[19]；miR-320a 的MSC 源性外泌體顯著抑制RA-FLS 的激活、遷移和侵襲，并減輕膠原誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)炎（collagen-induced arthritis，CIA）小鼠的關(guān)節(jié)炎和骨損傷[20]；RA 患者的血清外泌體中miR-6089 顯著降低，而miR-6089 可抑制炎癥細(xì)胞因子如IL-6、IL-29 和TNF-α 的分泌，間接介導(dǎo)了炎癥反應(yīng)[21]；外泌體來(lái)源的miR-192-5p 可通過(guò)靶向RAC2 在體外抑制炎癥和減輕RA 癥狀[22]。

另外，部分外泌體本身能抑制炎癥因子或效應(yīng)性T 細(xì)胞。例如：MSCs 來(lái)源的外泌體可以抑制CD4+和CD8+T 細(xì)胞的增殖，可在遲發(fā)型過(guò)敏小鼠模型中發(fā)揮抗炎效應(yīng)，同樣在CIA 模型中也能減緩炎癥[23]；來(lái)自轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子基因修飾的樹突狀細(xì)胞的免疫抑制性外泌體能夠減弱小鼠Th17 介導(dǎo)的炎癥[24]，全身注射該類型外泌體是一種有效的治療，有研究已建立的鼠類CIA 治療方法[25]；來(lái)自人MSC 的外泌體對(duì)T 細(xì)胞分化和激活具有抑制作用，并能減少γ 干擾素釋放[26]，對(duì)適應(yīng)性免疫和先天性免疫均具有抑制和調(diào)節(jié)作用，從而促進(jìn)關(guān)節(jié)組織修復(fù)。

5 軟骨修復(fù)作用

RA 的主要特征是關(guān)節(jié)滑膜的炎癥和軟骨、骨進(jìn)行性破壞，如果能有效阻止骨破壞、促進(jìn)軟骨修復(fù)，則將有益于RA 的轉(zhuǎn)歸。

RA-FLS 衍生的外泌體中miR-486-5p 靶向Tob1，并激活成骨細(xì)胞中的BMP/Smad信號(hào)通路，促進(jìn)成骨細(xì)胞分化。含有miR-486-5p 的RA-FLS 衍生的外泌體通過(guò)降低CIA 誘導(dǎo)的小鼠中的Tob1 表達(dá)來(lái)減輕RA 的骨質(zhì)破壞[27]。

大鼠股骨遠(yuǎn)端滑車溝的軟骨缺損處注射人胚胎MSC 來(lái)源的外泌體可以完全修復(fù)軟骨及軟骨下骨[28]，恢復(fù)透明軟骨良好的表面規(guī)則性，使其與鄰近軟骨完全結(jié)合。這說(shuō)明該外泌體作為一種現(xiàn)成的、無(wú)細(xì)胞的治療方法可以替代基于細(xì)胞的MSC 治療。

使用患者脂肪干細(xì)胞（adipose-derived stem cell，ADSC）分離外泌體與活化的滑膜成纖維細(xì)胞共培養(yǎng)[29]，結(jié)果顯示促炎的IL-6、核因子κB 和TNF-α 表達(dá)下調(diào)；外泌體處理可保護(hù)關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞免受過(guò)氧化氫誘導(dǎo)的凋亡。此外，外泌體處理促進(jìn)骨膜細(xì)胞的軟骨生成，增加軟骨生成標(biāo)志物，包括Ⅱ型膠原和β-catenin并表達(dá)較高水平的miR-145 和miR-221。這說(shuō)明患者來(lái)源的ADSCs 產(chǎn)生的外泌體，可作為潛在的用于軟骨再生和治療骨關(guān)節(jié)炎的工具。

6 遞送藥物的載體

為了在恰當(dāng)?shù)臅r(shí)機(jī)將適量的藥物遞送到正確的位置，目前研究者正積極探索在空間、時(shí)間及劑量上調(diào)控藥物生物體內(nèi)分布的技術(shù)體系，即藥物遞送系統(tǒng)，以增加藥物的利用效率、提高療效、降低成本、減少毒副作用。近年來(lái)，多種納米尺度載藥體被用于臨床，但因?yàn)椴牧虾洼d體的安全性、免疫原性及網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)或單核吞噬細(xì)胞系統(tǒng)的快速清除作用，導(dǎo)致應(yīng)用上的局限。

外泌體是一種有前途的治療方法[30]，其具有天然、體積小、穩(wěn)定性好、生物活性高、體內(nèi)生物相容性好、靶向性強(qiáng)、毒性或免疫原性低、長(zhǎng)期可維護(hù)性、免疫排斥反應(yīng)低的優(yōu)點(diǎn)。外泌體作為細(xì)胞間通信的主要參與者，不同的材料（例如蛋白質(zhì)、miRNA、mRNA 等）可有效地包裝在外泌體中并轉(zhuǎn)移到其他細(xì)胞中。

例如，為了克服糖皮質(zhì)激素全身給藥后分布不明確、長(zhǎng)期給藥時(shí)出現(xiàn)嚴(yán)重不良反應(yīng)的問(wèn)題，有研究者設(shè)計(jì)了以葉酸-聚乙二醇-膽固醇復(fù)合物修飾表面的仿生外泌體包埋地塞米松磷酸鈉的納米顆粒FPCExo/Dex[31]，并建立主動(dòng)靶向給藥系統(tǒng)。體外實(shí)驗(yàn)顯示：該系統(tǒng)通過(guò)抑制促炎性細(xì)胞因子和增加抗炎細(xì)胞因子，增強(qiáng)了對(duì)RAW264.7 細(xì)胞的內(nèi)吞作用和抗炎作用。FPC-Exo/Dex 能有效地在炎癥部位聚集，體內(nèi)生物分布實(shí)驗(yàn)表明：FPC-Exo/Dex 能較好地保護(hù)CIA 小鼠的骨和軟骨，并能顯著減輕關(guān)節(jié)炎。體內(nèi)安全性評(píng)價(jià)表明，這種仿生給藥系統(tǒng)沒(méi)有明顯的肝毒性，具有良好的生物相容性。

單核細(xì)胞來(lái)源的髓樣細(xì)胞在炎癥相關(guān)的自身免疫/炎癥性疾病和癌癥中起著重要作用。有研究報(bào)道[32]：外泌體可以在體內(nèi)向激活的髓樣細(xì)胞傳遞諸如姜黃素之類的抗炎藥。這項(xiàng)技術(shù)為諸如姜黃素等藥物提供了一種手段，既可以針對(duì)炎癥細(xì)胞，也可以避免不必要的非靶向效應(yīng)。且利用外泌體作為傳遞載體，可以在血液中提供更穩(wěn)定、更高濃度的姜黃素。

用編碼FasL 的重組腺病毒體外轉(zhuǎn)染DC 可促進(jìn)外泌體的產(chǎn)生，該外泌體具有抑制DTH 模型中炎癥進(jìn)展并減輕CIA 動(dòng)物模型的癥狀。以類似的方式，從表達(dá)IL-4 的DC 中分離出的外泌體能夠抑制DTH 小鼠模型中已建立的CIA 癥狀并減輕炎癥的嚴(yán)重程度。此外，與親代DC 比較，DC 的外泌體產(chǎn)生了相似或改善的治療結(jié)果。這些結(jié)果表明，外泌體是用于遞送治療炎性疾病的生物試劑的有效納米載體[33]。

另外在遞送miRNA 方面，研究顯示：B 細(xì)胞衍生的外泌體是遞送miRNA-155 抑制劑的理想候選藥物[34]；人MSC 產(chǎn)生的高表達(dá)miRNA-124a 的外泌體，能夠抑制細(xì)胞增殖、遷移并促進(jìn)成纖維樣滑膜細(xì)胞株的凋亡[35]。這都說(shuō)明外泌體是遞送治療性miRNA 的理想載體，有望為治療RA 提供新的方法。

7 小結(jié)

外泌體在RA 中的“一正一反”的兩種不同作用逐漸被人們認(rèn)識(shí)和重視，作為細(xì)胞間的“通信兵”，它也在RA 的診斷和治療中顯示出廣闊的前景。外泌體蛋白和核酸等活性物質(zhì)可以作為疾病診斷的標(biāo)志物，為將來(lái)的體外診斷奠定了基礎(chǔ)，但是究竟哪些是最佳的標(biāo)志物、如何優(yōu)選高效的外泌體分離方法并降低其經(jīng)濟(jì)成本是未來(lái)需要攻克的難題。

外泌體作為可以運(yùn)輸靶向藥物的天然載體，具有穩(wěn)定性好、生物活性成分高、靶向性強(qiáng)、毒性或免疫原性較低等優(yōu)點(diǎn)，在RA 治療領(lǐng)域大展拳腳并逐漸走向臨床。來(lái)自人脂肪MSC 的外泌體已表現(xiàn)出對(duì)T 細(xì)胞分化和激活的抑制作用，人母乳中的外泌體可以在體外誘導(dǎo)Treg 細(xì)胞并抑制效應(yīng)T 細(xì)胞活化從而治療RA，這讓人們看到了人工合成品甚至是天然獲得的外泌體在治療RA 方面的美好前景。