凋亡抑制蛋白介導(dǎo)泛素化在惡性黑素瘤發(fā)生發(fā)展過(guò)程中的作用

蔡桂月，鄒銳濤，陳嶸祎 （1.廣東醫(yī)科大學(xué)，廣東湛江 523023；2.南方醫(yī)科大學(xué)皮膚病醫(yī)院，廣東廣州 510091）

泛素是一個(gè)由76 個(gè)氨基酸殘基組成的多肽，具有高度保守性，可對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行翻譯后修飾，泛素修飾的蛋白質(zhì)可被蛋白酶體識(shí)別并降解，從而改變其定位、影響其活性、促進(jìn)或干擾蛋白質(zhì)之間的相互作用[1]。凋亡抑制蛋白（inhibitor of apoptosis proteins，IAPs)是一類(lèi)存在于多種組織與細(xì)胞中具有抗凋亡活性的蛋白，與多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展、化學(xué)耐藥和預(yù)后等密切相關(guān)。在惡性黑素瘤（MM）中，多種凋亡抑制蛋白家族表達(dá)上調(diào)，具有RING 結(jié)構(gòu)域的IAPs具有泛素連接酶（E3）活性，通過(guò)泛素化過(guò)程調(diào)節(jié)多種在MM發(fā)展中起重要作用的蛋白和信號(hào)通路參與MM 的發(fā)生、發(fā)展。本文對(duì)IAPs 通過(guò)泛素蛋白酶體系統(tǒng)在MM發(fā)生發(fā)展過(guò)程的作用機(jī)制作一綜述。

1 泛素化過(guò)程在MM發(fā)生發(fā)展過(guò)程中的作用

泛素化是一個(gè)調(diào)控蛋白質(zhì)表達(dá)的多步驟可逆反應(yīng)，作為一種蛋白質(zhì)翻譯后修飾，它在細(xì)胞周期、細(xì)胞凋亡與DNA 損傷修復(fù)等多個(gè)胞內(nèi)反應(yīng)中發(fā)揮作用。異常的泛素化會(huì)使胞內(nèi)生理過(guò)程的正常調(diào)節(jié)發(fā)生變化，從而廣泛參與腫瘤的發(fā)生發(fā)展過(guò)程[2]。

泛素化修飾需要泛素活化酶（E1）、泛素結(jié)合酶（E2）、泛素連接酶（E3）依次發(fā)揮作用。E3 的作用是在泛素化過(guò)程中識(shí)別底物進(jìn)行泛素化，決定了泛素化特異性，在包括MM 的多種腫瘤中均檢測(cè)到E3 的突變或者表達(dá)差異。有研究發(fā)現(xiàn)神經(jīng)前體細(xì)胞表達(dá)發(fā)育下調(diào)蛋白4-1(Nedd4-1)基因在MM 中高表達(dá)，將其敲除后，細(xì)胞內(nèi)表達(dá)同源性磷酸酶-張力蛋白，磷酸化AKT 表達(dá)水平下調(diào)，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡增加，表明Nedd4-1 在MM 中可能起癌基因作用[3]。同樣，研究者還發(fā)現(xiàn)Nedd4L 基因和Smad 泛素化調(diào)節(jié)因子2 的表達(dá)也可能促進(jìn)MM 細(xì)胞的增殖[4-5]。鼠雙微粒體2(MDM2)作為調(diào)節(jié)抑癌基因p53 的泛素連接酶，通過(guò)泛素化過(guò)程降解移入細(xì)胞質(zhì)的p53。在原發(fā)MM 中，MDM2 表達(dá)水平與腫瘤體積及侵襲性呈正相關(guān)[6]，且同時(shí)抑制MDM2和絲裂原活化蛋白激酶/細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶表達(dá)，可以抑制MM 細(xì)胞增殖[7]。MDMX 作為MDM2的同源類(lèi)似物，同樣具有泛素化降解p53的作用,可作為MM 聯(lián)合治療的有潛力的靶點(diǎn)之一[8]。最近有文獻(xiàn)報(bào)道稱(chēng)E3 酶RING 也可以靶向p53 使其降解[1]。p27 為另一個(gè)重要的抑癌基因，SKP2 的上調(diào)通過(guò)泛素化降解p27、p57、p21 等抑癌基因，促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)。研究發(fā)現(xiàn)，從黑素細(xì)胞到色素痣再逐步發(fā)展成為轉(zhuǎn)移性MM 的過(guò)程中，SKP2表達(dá)水平逐漸增加，而p27 水平逐漸降低，沉默SKP2 后，MM 細(xì)胞的增殖受到抑制[9-10]。泛素化是一個(gè)多種酶共同完成的過(guò)程，目前關(guān)于E3在MM 發(fā)生發(fā)展過(guò)程中的作用研究快速發(fā)展，但尚未有成熟的靶向藥物報(bào)道。在MM 發(fā)生發(fā)展過(guò)程中，其他異常表達(dá)的抑癌基因和癌基因翻譯的蛋白質(zhì)是否也受泛素化過(guò)程調(diào)控，需要進(jìn)一步研究。

2 IAPs的結(jié)構(gòu)與功能

2.1 IAPs的結(jié)構(gòu)特征

IAPs 是一類(lèi)在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)結(jié)構(gòu)具有同源性的蛋白分子，目前已發(fā)現(xiàn)的人IAPs 家族蛋白包括XIAP、cIAP-1、cIAP-2、ML-IAP、Survivin、NAIP、ILP-2 和BRUCE。IAPs 結(jié)構(gòu)特征表現(xiàn)為三個(gè)結(jié)構(gòu)域：N 末端桿狀病毒IAP 重復(fù)子(baculoviral inhibitor of apoptosis repeats，BIR)、C 末端環(huán)鋅指結(jié)構(gòu)（ring zine-finger，RING)和Caspase 募集結(jié)構(gòu)域(caspase recruitment domain，CARD)。所有IAPs 家族成員均含有BIR 結(jié)構(gòu)域，BIR 通過(guò)與活化Caspase的N 端IBM 結(jié)合，在抑制細(xì)胞凋亡中發(fā)揮關(guān)鍵作用。某些IAPs 分子（如c-IAP1、c-IAP2、XIAP、ML-IAP 和ILP-2）C 端包含一個(gè)指環(huán)結(jié)構(gòu)RING，RING 具有E3 活性，含有RING 結(jié)構(gòu)域的IAPs 分子可以通過(guò)泛素蛋白酶體系統(tǒng)使自身或靶蛋白泛素化降解[11]。cIAP-1/2 含有CARD 結(jié)構(gòu)域，此結(jié)構(gòu)位于BIR 與RING 之間，由6 個(gè)α 螺旋構(gòu)成，通過(guò)與其他包含此結(jié)構(gòu)的蛋白分子形成寡聚體,調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡。

2.2 IAPs的抗凋亡機(jī)制

IAPs 分子主要通過(guò)與Caspase 結(jié)合，抑制其催化活性阻止細(xì)胞凋亡[12]，但各IAPs 家族成員分別介導(dǎo)不同信號(hào)通路發(fā)揮其抗凋亡功能。研究發(fā)現(xiàn)XIAP為最強(qiáng)的Caspase抑制劑，可直接抑制Caspase-3/7/9，阻止細(xì)胞凋亡，ML-IAP 分子N 端的BIR 和cIAP-1/2 的BIR2結(jié)構(gòu)域參與調(diào)節(jié)活化的Caspase-3/7,cIAP-1/2的BIR3 與活化的Caspase-8 結(jié)合,阻止Caspase與底物結(jié)合,抑制其催化活性[13]。IAPs 亦可通過(guò)非Caspase 蛋白依賴(lài)途徑抵抗凋亡，如XIAP、NAIP和ML-IAP可激活TAK1/JNK1 信號(hào)通路以抵抗腫瘤壞死因子α(TNF-α)誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，XIAP 還可通過(guò)活化TNF-α受體進(jìn)而激活核因子κB (nuclear factor kappa-lightchain-enhancer of activated B cells，NF-κB) 調(diào)控抗凋亡基因表達(dá)[14]，cIAP-1/2 可與TNF-α 受體相關(guān)因子2(TNFa receptor associated factor 2,TRAF2)結(jié)合，并且作為E3酶靶向受體相互作用蛋白1(receptor-interacting protein,RIP1)通過(guò)TAK1(TGF-beta activated kinase 1)信號(hào)途徑激活NF-kB 進(jìn)而抑制細(xì)胞凋亡[15]。

2.3 IAPs在MM組織中的功能

IAPs 最初被認(rèn)為只對(duì)細(xì)胞凋亡有抑制作用，但隨著研究的深入，人們發(fā)現(xiàn)多種具有RING 結(jié)構(gòu)域的IAPs（包括XIAP、cIAP-1、cIAP-2、ML-IAP和ILP-2)具有E3活性，并且在細(xì)胞遷移、炎癥反應(yīng)和免疫應(yīng)答等多方面發(fā)揮作用。

有研究者采用cDNA 微陣列研究顯示，在MM 組織中有多種IAPs 家族成員的表達(dá)較黑素細(xì)胞痣高，包括ML-IAP、cIAP-l、cIAP-2、XIAP 等[16]。后續(xù)實(shí)驗(yàn)中，該研究者又采用HIC、CISH 和RT-qPCR 檢測(cè)MM和黑素細(xì)胞痣組織中的ML-IAP,發(fā)現(xiàn)ML-IAP 在惡性黑色素瘤中的陽(yáng)性率(47.6%～70.6%)明顯高于其在黑素細(xì)胞痣中的陽(yáng)性率(21.4%～25.0%)，提示ML-IAP可能在MM 發(fā)生發(fā)展中起重要作用，但在原發(fā)和轉(zhuǎn)移性MM 之間，ML-IAP 陽(yáng)性率無(wú)明顯差異，提示MLIAP 在MM 的轉(zhuǎn)移中作用較小[17]。Mousavi-Shafaei等[18]用寡核苷酸M706 下調(diào)ML-IAP 蛋白在MM 細(xì)胞中的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)腫瘤細(xì)胞對(duì)化療敏感性增高。Ayachi等[19]證實(shí)XIAP在轉(zhuǎn)移性黑素瘤和侵襲性黑素瘤細(xì)胞系中表達(dá)增高，敲除XIAP基因后，MM 細(xì)胞的遷移和纖維連接蛋白層表面細(xì)胞邊緣的局灶性粘連的形成顯著減少。此外，有研究顯示，IAPs家族成員survivin水平在MM 組織中表達(dá)增高,抑制survivin 的表達(dá)可以使腫瘤細(xì)胞凋亡增加[20]。Zhou 等[21-22]分別研究了ML-IAP 和XIAP 作為免疫原性靶點(diǎn)在MM 中的潛在作用，發(fā)現(xiàn)MM 患者對(duì)兩者均有較高頻率的免疫應(yīng)答，且細(xì)胞和體液免疫反應(yīng)與良好的免疫治療效果相關(guān)。有趣的是，有研究者發(fā)現(xiàn)XIAP、cIAP-1/2 和MLIAP 通過(guò)泛素化降解CARF 蛋白激酶促進(jìn)細(xì)胞凋亡，抑制MM 細(xì)胞的遷移和侵襲[23]。兩種截然相反的研究結(jié)果說(shuō)明IAPs 可能在MM 發(fā)展的不同階段調(diào)控不同的分子和信號(hào)通路或其自身也被不同分子調(diào)控，從而導(dǎo)致這種抑制凋亡或促進(jìn)凋亡效應(yīng)的差異性，進(jìn)一步揭示IAPs 在MM 發(fā)生發(fā)展中起著舉足輕重的作用。Rac1屬RhoGTP 酶家族，與MM的增殖、侵襲、惡性進(jìn)展有關(guān)，與良性痣皮損比較MM 病灶存在Rac1高表達(dá)，且惡性程度高的MM 細(xì)胞系Rac1 活性也明顯增高[24]。Oberoi-Khanuja 等[25]發(fā)現(xiàn)IAPs 可以發(fā)揮E3 酶活性靶向Rac1，使其通過(guò)泛素化過(guò)程被蛋白酶體降解。IAPs 依賴(lài)自身的E3 活性參與MM 細(xì)胞凋亡、細(xì)胞遷移、炎癥反應(yīng)和免疫應(yīng)答等生理過(guò)程，但其具體的信號(hào)通路和分子機(jī)制尚未明了，進(jìn)一步闡明IAPs 如何調(diào)控MM 細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲，從而影響MM 的發(fā)生發(fā)展，對(duì)MM 患者的治療及預(yù)后至關(guān)重要。

3 以IAPs為靶點(diǎn)治療MM

目前，MM 的治療包括手術(shù)治療、放療和化療等傳統(tǒng)方式以及近十年研究熱點(diǎn)免疫治療和靶向治療，雖然治療方式多樣，但MM 患者生存率仍未得到明顯改善，因此，尋找安全有效的治療靶點(diǎn)成為重要課題。

IAPs 對(duì)MM 進(jìn)展的作用研究結(jié)果表明，它們可能是治療干預(yù)MM 的有價(jià)值的靶點(diǎn)。目前研究人員已開(kāi)發(fā)出多種單價(jià)和二價(jià)IAPs 拮抗劑，它們能誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡和/或使癌細(xì)胞對(duì)其他凋亡誘導(dǎo)療法敏感。這些抑制劑中大多數(shù)可以同時(shí)抑制多個(gè)IAPs 家族成員，稱(chēng)為泛抑制劑，與之對(duì)應(yīng)的特異性抑制單個(gè)IAPs的稱(chēng)為選擇性抑制劑[26-27]。研究表明選擇性抑制劑對(duì)于誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的作用有限，提示各個(gè)IAPs 家族成員之間可能具有協(xié)同作用[28]。單獨(dú)抑制survivin 或ML-IAP 在臨床實(shí)驗(yàn)中均未取得良好療效，但利用ML-IAP 具有高度免疫原性的特點(diǎn)，用免疫療法靶向ML-IAP陽(yáng)性的腫瘤可以改善療效[29]。有研究小組發(fā)現(xiàn)使用單鏈反義寡核苷酸靶向XIAP，使之選擇性被拮抗后可能具有一定抗腫瘤活性，然而同時(shí)抑制XIAP 和cIAP 可以獲得更好的療效[30-31]。單獨(dú)抑制IAPs 可能是其他凋亡誘導(dǎo)方式的促進(jìn)劑，Enges?ter等[32]用siRANA將XIAP敲低后，MM細(xì)胞對(duì)凋亡誘導(dǎo)劑TRAIL 誘導(dǎo)凋亡的敏感性增強(qiáng)；Yuan 等[33]發(fā)現(xiàn)腫瘤靶向傳遞TNFα和IAPs抑制劑LCL161聯(lián)合運(yùn)用可顯著抑制黑素瘤異種移植小鼠的腫瘤生長(zhǎng)和存活，并且比單獨(dú)使用兩者中任何一種藥物都更有效。有趣的是，在對(duì)具有BRAF 蛋白激酶突變的MM 患者研究中發(fā)現(xiàn)，IAPs抑制劑birinapant和TNFα聯(lián)合治療在對(duì)BRAF 抑制劑具有獲得性耐藥性的黑素瘤細(xì)胞中有效，表明IAP 抑制劑對(duì)具有耐藥性的患者可能有益[34]。愈來(lái)愈多IAPs 抑制劑進(jìn)入了臨床研究階段，但對(duì)于黑素瘤有明顯療效且具有安全性的藥物待進(jìn)一步研究。我們已經(jīng)闡述了IAPs 可能在黑素瘤不同階段發(fā)揮不同作用，希望能在不久的將來(lái)，科研工作者可以揭示出IAPs 隱藏的奧秘，為黑素瘤患者們帶去福音。

4 小結(jié)

大量證據(jù)表明IAPs 家族成員通過(guò)泛素化蛋白酶體系統(tǒng)調(diào)控相關(guān)蛋白和信號(hào)通路，在黑素瘤的發(fā)病機(jī)制中具有重要作用。通過(guò)研究黑素瘤中異常的IAPs表達(dá)及泛素化過(guò)程，有助于尋找遏制MM 不斷惡化的治療靶點(diǎn)。此外，不管是削弱抑癌基因表達(dá)的蛋白質(zhì)泛素化降解或是加強(qiáng)原癌基因表達(dá)的蛋白質(zhì)泛素化降解都是腫瘤治療中有潛力的研究方向，值得科研工作者進(jìn)行深入探討。