外泌體在甲狀腺癌診療中的研究進展

甲狀腺癌占所有惡性腫瘤的1%～5%，近年來，全世界人口不斷增加，人們生活水平迅速提高，甲狀腺癌發(fā)病率隨之上升，伴有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者數(shù)量也在迅速增加[1]。根據(jù)美國癌癥中心發(fā)布的2020年腫瘤調(diào)查數(shù)據(jù)顯示，預(yù)計2020年女性甲狀腺癌新發(fā)人數(shù)在新發(fā)腫瘤總?cè)藬?shù)中的占比可上升至4%[2]。我國癌癥中心最新公布的2019年相關(guān)數(shù)據(jù)表明，2015年我國女性甲狀腺癌發(fā)病率高達8.49%，已成為女性人群第4大常見腫瘤。按照病理組織學(xué)分類，甲狀腺癌分為甲狀腺乳頭狀癌(PTC)、甲狀腺髓樣癌(MTC)、甲狀腺濾泡狀腺癌(FTC)和甲狀腺未分化癌(ATC)。PTC是最常見的類型，約占85%，相對于其他病理類型，PTC的病灶可侵襲至甲狀腺以外的組織器官并可發(fā)生局部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。研究顯示，約有1/3患者會發(fā)生術(shù)后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移，且大部分于術(shù)后10年內(nèi)發(fā)生。所以，必須長期隨訪甲狀腺癌患者，實時監(jiān)測腫瘤的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移。

目前，主要通過超聲引導(dǎo)下細針穿刺細胞學(xué)檢查(FNAC)診斷甲狀腺癌，同時結(jié)合頸部超聲進一步明確是否存在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。通過術(shù)前FNAC，仍有10%～30%甲狀腺結(jié)節(jié)性質(zhì)無法明確，加之侵入性的有創(chuàng)穿刺檢查患者接受度普遍較低，臨床上的拓展、普及力度受限；科研工作中，由于FNAC獲取的樣本量偏少，難以滿足后續(xù)的研究需求，并且有限的樣本量檢測結(jié)果不能覆蓋異質(zhì)性腫瘤的全貌。因此，針對臨床診療關(guān)注的難題和相關(guān)研究工作展開的需求，并基于對PTC發(fā)生、發(fā)展分子機制的認知，從PTC相關(guān)生物標(biāo)志物的角度出發(fā)，有可能是解決PTC臨床早期診療難題和相關(guān)研究工作展開需求的關(guān)鍵。

外泌體來源于體內(nèi)多種活細胞，其直徑30～150 nm，是具備穩(wěn)定雙層質(zhì)膜的囊泡，廣泛分布于各種體液中，并且攜帶有多種核酸、蛋白質(zhì)、脂質(zhì)等物質(zhì)，是細胞間信息物質(zhì)交流的重要載體[2-3]。癌細胞源性外泌體在甲狀腺癌的進程中發(fā)揮至關(guān)重要的作用。外泌體及其加工產(chǎn)物在甲狀腺癌的治療中也具有一定的應(yīng)用潛能。近年來外泌體檢測在甲狀腺癌診療中的研究越來越多，其有可能成為較為理想的可供PTC臨床診療應(yīng)用的生物標(biāo)志物。

1 外泌體概述

PAN等[4]1983年首次在綿羊成熟的網(wǎng)織紅細胞中發(fā)現(xiàn)了一種外排的多形性囊泡樣小體。淋巴細胞、內(nèi)皮細胞、成纖維細胞、間充質(zhì)干細胞及腫瘤細胞等均可分泌外泌體，并且其幾乎存在于所有體液中，如血清、膽汁、腦脊液等[5-9]。生物信息學(xué)資料顯示，目前來自不同生物和細胞類型的外泌體含有41 860種蛋白質(zhì)，1 164種脂類，4 946種mRNAs和2 838種miRNAs。細胞分泌的外泌體，被受體細胞通過胞飲或細胞的特異性受體等方式攝取，進而獲取其攜帶的生物信息，發(fā)揮細胞間通訊載體的作用。外泌體源性蛋白質(zhì)及miRNA等核酸物質(zhì)，可通過細胞間相互傳遞，參與信息交流，調(diào)控機體正常的生理過程，與多種炎性疾病、腫瘤的發(fā)生及進展有密切關(guān)系[3]。由于外泌體的細胞來源不同，其所攜帶的內(nèi)容物信息量巨大，加之生物學(xué)功能的多樣化，近年來，外泌體在多種疾病發(fā)生、發(fā)展進程中所發(fā)揮的作用備受關(guān)注。

2 外泌體與甲狀腺癌

甲狀腺癌的具體發(fā)病機制尚處于探索階段，已經(jīng)闡明的相關(guān)發(fā)病機制，包括絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)通路、磷脂酰肌醇-3-激酶和蛋白激酶B(PI3K-AKT)途徑、基因突變、基因拷貝數(shù)目增加和基因發(fā)生甲基化等[10]。隨著外泌體生物學(xué)功能的進一步揭示和甲狀腺癌發(fā)生、發(fā)展分子機制研究的深入，外泌體與甲狀腺癌診療的相關(guān)研究成為近期醫(yī)學(xué)研究的熱點。

2.1外泌體調(diào)控甲狀腺癌的發(fā)生、發(fā)展 腫瘤微環(huán)境(TME)在惡性腫瘤的進展過程中發(fā)揮至關(guān)重要的作用。腫瘤細胞、炎性細胞、周圍基質(zhì)細胞、細胞外基質(zhì)等組分共同構(gòu)成TEM。腫瘤細胞與TME的相互作用決定腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移和耐藥。腫瘤細胞源性外泌體參與構(gòu)成TME，其含有豐富的miRNA，參與癌細胞與癌旁細胞的相互作用，從而促進TME的重塑。WU等[11]研究發(fā)現(xiàn)，在缺氧條件下甲狀腺癌細胞源性外泌體中miRNA-21-5p表達上調(diào)，miRNA-21-5p靶向性的抑制TGFBI蛋白和Ⅳ型膠原基因 COL4A1,從而促進內(nèi)皮血管的形成。腫瘤生長、進展、侵襲對營養(yǎng)物質(zhì)的需求量較大，腫瘤血管是其主要的供應(yīng)來源。腫瘤細胞源性外泌體通過轉(zhuǎn)運血管生成相關(guān)的miRNAs和蛋白質(zhì)等物質(zhì)，促使腫瘤組織中微血管生成，同時明顯增加其通透性，從而調(diào)控腫瘤的發(fā)生和轉(zhuǎn)移。

外泌體miRNA通過不同機制在乳腺癌[12]、肺癌[13]、胃癌[14]的侵襲轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要作用，而其對甲狀腺癌侵襲進程的影響目前尚不完全明確。具有黏附性的上皮通過特定的轉(zhuǎn)化程序，轉(zhuǎn)變?yōu)槟軌蚯秩爰毎饣|(zhì)的單個遷移細胞過程被稱為上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)[15]。研究顯示，EMT過程與腫瘤干細胞的生成及腫瘤發(fā)生遠處侵襲具有密切關(guān)系，腫瘤細胞發(fā)生EMT，導(dǎo)致腫瘤細胞間黏附作用明顯減退，遷徙能力顯著增強，從而促使腫瘤細胞發(fā)生遠端轉(zhuǎn)移[16]。有研究發(fā)現(xiàn)，甲狀腺干細胞外泌體可以通過轉(zhuǎn)移非編碼RNA(LncRNA)調(diào)控EMT，進而促進腫瘤干細胞(CSCs)產(chǎn)生，CSCs具有多種潛能，可以誘發(fā)腫瘤并誘導(dǎo)癌細胞對放療或化療抵抗，是惡性腫瘤復(fù)發(fā)、侵襲的關(guān)鍵機制[17]。同時，有研究指出，甲狀腺乳頭狀癌患者血清中miRNA423-5p表達上調(diào)，外泌體可能將miRNA423-5p導(dǎo)入癌細胞，進而加快癌細胞侵襲進程[18]。參與甲狀腺癌侵襲轉(zhuǎn)移的潛在標(biāo)志物不僅局限于外泌體miRNA、LncRNA等核酸物質(zhì)。LUO等[19]研究以發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移為基準，將甲狀腺癌患者分為2組，采用液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜分析技術(shù)，比較其血清外泌體蛋白質(zhì)表達譜，結(jié)果發(fā)現(xiàn)697個差異表達蛋白，其中SRC、TLN1、ITGB2、CAPNS1等蛋白呈過表達，與甲狀腺癌細胞的轉(zhuǎn)移有明確關(guān)聯(lián)。馬艷梅等[20]研究發(fā)現(xiàn)，PTC患者外泌體中晚期糖基化終末產(chǎn)物受體RAGE可通過激活Wnt/β-catenin信號通路，以上調(diào)Vimentin和下調(diào)E-cadherin的模式，促使細胞發(fā)生EMT，進而加強惡性腫瘤遠處浸潤遷徙的能力。此外，劉靜等[21]研究提取甲狀腺切除術(shù)后引流液中的外泌體，完善蛋白標(biāo)記識別和細胞外囊泡鑒定，從而證明術(shù)后引流液中富含外泌體顆粒，同時繪制結(jié)節(jié)性甲狀腺腫和PTC差異表達外泌體miRNA聚類熱圖，研究提示術(shù)后引流液中外泌體miRNA表達譜存在明顯差異，hsa-miRNA-609的表達差異最明顯，進一步生物信息分析顯示，外泌體hsa-miRNA-609靶基因與PTC的發(fā)生緊密相關(guān)。以上研究均說明，在甲狀腺癌的病程中，外泌體miRNA、LncRNA和蛋白質(zhì)等表達譜存在顯著差異，差異表達的物質(zhì)在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移和耐藥過程中可能發(fā)揮重要作用。

2.2外泌體在甲狀腺癌篩查診斷中的研究進展 目前，甲狀腺癌的診斷主要依靠FNAC技術(shù)。資料顯示，10%～30%的甲狀腺結(jié)節(jié)通過FNAC無法明確其性質(zhì)，部分患者可能遭受非必須的甲狀腺切除，并需要終身服藥治療。加之對侵入性的穿刺檢查方法患者接受度較低，臨床上的推廣應(yīng)用效果欠佳。近年來，臨床檢驗診斷學(xué)技術(shù)、方法日新月異，各種組織或器官特異性腫瘤生物標(biāo)志物不斷涌現(xiàn)，有力地推動了腫瘤診斷學(xué)科水平的提升。外泌體含有多種細胞來源的特征性核酸、蛋白等物質(zhì)，通過檢測外泌體內(nèi)相關(guān)特征性物質(zhì)，可能為甲狀腺癌的協(xié)助診斷、靶向治療、預(yù)后評估提供實驗參考依據(jù)及新的研究方向[22]。作為腫瘤診治過程潛在理想的標(biāo)志物，外泌體具有以下優(yōu)勢：(1)分布廣泛，取材方便；(2)具有磷脂雙層膜結(jié)構(gòu)，性狀穩(wěn)定；(3)納米尺寸避免被單核吞噬系統(tǒng)吞噬；(4)內(nèi)容物來自母源細胞，具有細胞特異性。有研究顯示，甲狀腺癌患者的外泌體miRNA譜較健康人群有特異性的改變，miRNA-31、miRNA-21在PTC患者血清外泌體中表達顯著上調(diào)，其中miRNA-21可用于良性結(jié)節(jié)和PTC的鑒別診斷[21]。DAI等[23]研究指出,血清外泌體miRNA-485-3p和miRNA-4433a-5p可作為PTC的臨床檢驗診斷指標(biāo)，miRNA-485-3p可評估腫瘤分化的風(fēng)險性。LEE等[24]研究顯示，miRNA-146b和miRNA-222在甲狀腺癌細胞外泌體中顯著上調(diào)。PAN等[25]繪制了PTC和結(jié)節(jié)性甲狀腺腫血漿外泌體miRNAs差異表達譜,其中miRNA-5189-3p、miRNA-3163等在PTC患者血漿外泌體中顯著上調(diào)。因此，差異表達外泌體miRNA可用于甲狀腺惡性腫瘤和結(jié)節(jié)性甲狀腺腫塊的鑒別診斷。

甲狀腺癌診斷的潛在標(biāo)志物不僅局限于外泌體源性的miRNA，YANG等[26]研究篩選出PTC和良性甲狀腺腫患者22個差異表達的環(huán)狀RNA，其中3個在PTC患者血清中上調(diào)，19個下調(diào)，進一步完善基因富集分析，結(jié)果提示上述差異表達的基因與16條信號通路有關(guān)，包括甲狀腺激素信號通路、AMPK信號通路，為深入闡明甲狀腺癌的具體發(fā)病機制提供了全新的切入點。此外，有研究指出，尿液中外泌體甲狀腺球蛋白是監(jiān)測甲狀腺癌復(fù)發(fā)的理想生物標(biāo)志物[27]。上述研究均說明，甲狀腺癌源性外泌體中的miRNA、環(huán)狀RNA、蛋白質(zhì)等物質(zhì)可能是甲狀腺癌早期診斷、預(yù)后評估和復(fù)發(fā)監(jiān)測的潛在生物標(biāo)志物。目前，外泌體在應(yīng)用過程中仍有很多問題，如尚未明確高效統(tǒng)一的外泌體提取純化及鑒定方法，缺氧、炎癥、腫瘤、應(yīng)激等機體狀態(tài)可影響外泌體的動態(tài)改變。因此，外泌體在甲狀腺癌篩查診斷中的臨床應(yīng)用尚需進一步研究和探索。

2.3外泌體在甲狀腺癌治療中的研究進展 腫瘤細胞分泌的外泌體參與TME的構(gòu)成，而TME的重塑可促進腫瘤的發(fā)生、發(fā)展。因此，干預(yù)腫瘤外泌體的釋放和轉(zhuǎn)移，有可能開啟一種全新的腫瘤治療模式。WU等[11]研究顯示，通過抑制PTC外泌體miRNA-21-5p，可減少其介導(dǎo)的腫瘤血管生成。同期的另一項研究也證實，PTC細胞外泌體中miRNA423-5p沉默可抑制PTC細胞的遠處侵襲能力[18]。ZHANG等[28]通過體外細胞實驗和反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)證實，miRNA-145可通過直接抑制RAB5C蛋白表達，進而阻礙腫瘤的遷移，誘導(dǎo)細胞凋亡過程。因此，miRNA-145和RAB5C可能是PTC的潛在治療靶點。

以外泌體作為靶向載體，輸送外源性藥物用于腫瘤治療也是近年來研究的一個熱點?；谕饷隗w的納米尺寸范圍(30～150 nm)，設(shè)計可供其攜帶的納米級藥物，可避免被單核吞噬系統(tǒng)吞噬，且易于通過腫瘤周圍的高滲透性血管，進而將藥物安全、有效地運到腫瘤組織。此種以外泌體為載體的給藥方式，具有獨特的生物相容性、低免疫原性、高穩(wěn)定性等特點。目前，有關(guān)外泌體作為載體，靶向輸送外源性藥物的研究比較多。通過超速離心、聚乙二醇沉淀、磁珠吸附、免疫親和捕獲等分離純化方法可獲取高純度外泌體；采用超高分辨電子顯微鏡評估其結(jié)構(gòu)大小及表面分子，繼而輔予：(1)質(zhì)譜、Western blot和酶聯(lián)免疫吸附試驗進行蛋白分析；(2)2代測序和PCR技術(shù)進行RNA分析，進而評估優(yōu)化外泌體。在藥物與載體嵌合層面,主要通過直接混合、孵育、超聲、渦流、電穿孔、轉(zhuǎn)染等方法，將外源性藥物或分子裝載到外泌體進而輸送至靶細胞發(fā)揮作用。以上外泌體分離提取、分析評估和藥物裝載輸送的流程完善詳盡，但是此種藥物轉(zhuǎn)載輸送方式是否會破壞外泌體囊泡的完整性、穩(wěn)定性及是否會影響其生物學(xué)功能，目前尚不清楚[29]。SANCHO-ALBERO等[30]研究發(fā)現(xiàn)，常規(guī)抗癌藥物缺乏細胞特異性，是導(dǎo)致腫瘤患者化療期間產(chǎn)生各種不良反應(yīng)的主要原因。KIBRIA等[29]將鈀催化劑通過外泌體直接轉(zhuǎn)送至腫瘤細胞的內(nèi)部，催化劑可將非活性抗癌藥物帕比司他轉(zhuǎn)化為有活性的形式，使腫瘤細胞自身內(nèi)部瓦解而不破壞周圍正常組織。有研究證實，巨噬細胞源性的外泌體裝載小分子化學(xué)治療藥物如紫杉醇，可在肺癌轉(zhuǎn)移部位富集藥物，并有很好的治療效果[31]。以上研究提示，外泌體可作為一種靶向治療工具用于甲狀腺癌的治療，雖需大量動物實驗和臨床研究進一步驗證其在臨床診療過程中的應(yīng)用價值，但不可否認這是未來研究的新方向。

3 展 望

外泌體的相關(guān)研究為甲狀腺癌的早期診療帶來新的思路和廣闊的應(yīng)用前景，但目前尚有諸多因素影響和制約其在臨床的普及。一方面，尚未明確統(tǒng)一的外泌體提取、純化及鑒定方法，現(xiàn)行的方法，如差速離心法、磁珠吸附法、聚乙二醇沉淀法、免疫親和法等，難以確保所提取囊泡的純度。另一方面，雖然國內(nèi)外有關(guān)外泌體在甲狀腺癌診療中的研究報道，內(nèi)涵豐富、切入點明確，但受限于諸多因素，實驗設(shè)計不盡完善，如僅對外泌體所包含物質(zhì)進行初步的生物信息學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)差異表達miRNA、環(huán)狀RNA等物質(zhì)，而對目標(biāo)物質(zhì)缺乏深入研究，而且相關(guān)研究成果缺乏大規(guī)模的臨床應(yīng)用和循證醫(yī)學(xué)驗證。既往的經(jīng)驗表明，樣本量較小的實驗發(fā)現(xiàn)的候選標(biāo)志物，需要通過大量的人群樣本進行驗證，從而證實其可靠性。此外，目前外泌體與甲狀腺癌的相關(guān)研究主要局限于miRNA等核酸物質(zhì)，外泌體含有的特征性蛋白與甲狀腺癌發(fā)生、發(fā)展的關(guān)聯(lián)性尚需進一步挖掘和明確。