柞蠶蛹抗菌肽的研究進(jìn)展

鄭冰姝，李少凡，王佳月，沈 楠，李松巖

(吉林醫(yī)藥學(xué)院，吉林 吉林 132013)

自然界螟、蠅、蠶等多種生物體內(nèi)都廣泛存在抗菌肽。自然情況下，柞蠶生長環(huán)境惡劣，常被外來病毒、細(xì)菌侵襲，卻依然能頑強(qiáng)存活，其原因主要與柞蠶體內(nèi)獨(dú)特抗菌物質(zhì)及強(qiáng)大的免疫能力有關(guān)。研究表明，柞蠶蛹有提高小鼠外周血細(xì)胞數(shù)量,促進(jìn)T、B淋巴細(xì)胞增殖分化等功效[1]。在不同物質(zhì)的刺激下，蠶蛹體內(nèi)會(huì)產(chǎn)生不同的抗菌肽。隨著刺激強(qiáng)度發(fā)生改變，柞蠶蛹抗菌肽體內(nèi)合成的含量也會(huì)有所不同[2]，但它們都有分子量小、免疫反應(yīng)迅速、有較強(qiáng)的耐酸抗熱能力、抗菌防病毒種類廣且強(qiáng)度大、對正常細(xì)胞無毒副作用等特點(diǎn)。因此，柞蠶蛹抗菌肽有獨(dú)特的作用與發(fā)展前景，值得繼續(xù)探索研究。

1 柞蠶蛹抗菌肽的抗菌作用

細(xì)菌在生活中無處不見，并對人類和動(dòng)植物產(chǎn)生著重要影響。長期以來，由于抗生素的濫用，細(xì)菌耐藥性逐年增加，有些細(xì)菌已進(jìn)化為“超級細(xì)菌”，人類逐漸陷入無藥可用的尷尬境地。而柞蠶蛹抗菌肽天然存在于動(dòng)物體內(nèi)，具有抗菌譜廣、抗菌效果顯著的特點(diǎn)，或可為未來抑菌藥物的研發(fā)開辟新的道路。

張倩[3]等對大腸桿菌E.coli的ATCC25922、ATCC35218菌株進(jìn)行培養(yǎng)，并用透射電子顯微鏡和流式細(xì)胞儀等技術(shù)手段對重組柞蠶抗菌肽AD的抗菌作用機(jī)制進(jìn)行初步研究。發(fā)現(xiàn)重組柞蠶抗菌肽AD對兩種菌株均有破壞細(xì)菌胞膜完整性、抑制物質(zhì)交換功能、使胞內(nèi)Ca2+濃度增高的作用,表明柞蠶蛹抗菌肽有一定的抗菌作用。馬淑慧[4]等用通過誘導(dǎo)柞蠶蛹產(chǎn)生抗菌肽，提取并測定抗菌肽對仔豬腹瀉常見病原菌的抑菌效果。結(jié)果表明在一定酸性與高溫條件下，柞蠶抗菌肽依然能保持良好的生物活性，能夠較強(qiáng)地抑制大腸桿菌、金黃色葡萄球菌。張玉玉[5]等對柞蠶抗菌肽Moricin基因的生物活性進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)抗菌肽Moricin能夠不同程度的地抑制大腸桿菌、腸炎沙門氏菌、副豬嗜血桿菌、豬鏈球菌和金黃色葡萄球菌。臨床分離菌株可形成12～21 mm直徑的抑菌圈。表明抗菌肽具有較強(qiáng)的抑菌活性，對臨床耐藥菌株的抑菌作用尤其明顯。

2 柞蠶蛹抗菌肽的防病毒作用

柞蠶蛹抗菌肽不僅可以抑制細(xì)菌生長，對病毒也有一定的滅活作用。于婷婷[6]選擇柞蠶桿狀病毒對柞蠶滯育蛹進(jìn)行誘導(dǎo)，發(fā)現(xiàn)抗菌蛋白6-Tox對病毒入侵有明顯的應(yīng)答反應(yīng)，可以在柞蠶蛹表皮、脂肪體、中腸等部位進(jìn)行表達(dá)。黃亞東[7]等對柞蠶抗菌肽D基因進(jìn)行改造、克隆及序列分析，插入重組的病毒載體后，對重組病毒進(jìn)行篩選和鑒定。結(jié)果顯示，柞蠶抗菌肽D基因可以在苜蓿丫紋夜蛾幼蟲體內(nèi)形成高表達(dá),所產(chǎn)生的表達(dá)產(chǎn)物被證實(shí)具有抑制細(xì)菌生長的作用。

3 柞蠶蛹抗菌肽對腫瘤細(xì)胞的作用

柞蠶蛹抗菌肽不但可以通過增加人體免疫力起到降低腫瘤發(fā)生率的作用，而且還對腫瘤細(xì)胞有一定的抑制和殺傷作用。張衛(wèi)民等[8-9]對柞蠶抗菌肽進(jìn)行體外實(shí)驗(yàn)。發(fā)現(xiàn)柞蠶蛹抗菌肽可選擇性殺傷人結(jié)腸癌細(xì)胞株，使其分裂速度減慢，減少對機(jī)體的致癌作用。另外，柞蠶蛹抗菌肽可以預(yù)防二甲肼在大鼠體內(nèi)誘導(dǎo)形成大腸癌。癌細(xì)胞在抗菌肽作用下，DNA合成受到抑制，發(fā)生細(xì)胞代謝能力異常，細(xì)胞膜通透性改變等變化。凌斌勛[10]等發(fā)現(xiàn)，柞蠶抗菌肽對人鼻咽癌細(xì)胞株有殺傷作用。在一定濃度范圍內(nèi)，抗菌肽對癌細(xì)胞株抑制率和濃度呈正向關(guān)聯(lián)。柞蠶蛹抗菌肽可通過改變細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)，使癌細(xì)胞膜完整性發(fā)生破壞。受損傷的線粒體能量供給不足，加速癌細(xì)胞凋亡，使癌細(xì)胞進(jìn)一步失去致病能力。從體內(nèi)實(shí)驗(yàn)結(jié)果來看，柞蠶抗菌肽能夠較強(qiáng)地抑制荷人鼻咽癌裸鼠體內(nèi)的腫瘤，癌細(xì)胞壞死程度嚴(yán)重，炎細(xì)胞浸潤增多，以淋巴細(xì)胞為主。閆琦濤[11]等發(fā)現(xiàn)，一定濃度的柞蠶蛹蛋白多肽液能使小鼠肉瘤細(xì)胞(S180)和肝癌細(xì)胞(H22)的存活率顯著下降，腫瘤細(xì)胞內(nèi)總蛋白質(zhì)含量與多肽液濃度呈負(fù)相關(guān)，可使腫瘤分裂出現(xiàn)周期性阻滯情況。另外還有報(bào)道顯示，在一定濃度范圍內(nèi)，蠶蛹蛋白模擬消化多肽表現(xiàn)出一定的抗腫瘤活性，可使乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231、肝癌細(xì)胞HepG2、前列腺癌細(xì)胞PC-3的增殖受到明顯影響[12]。通過酶解法制備蠶蛹蛋白生物活性肽,可表現(xiàn)出良好的溶解性、耐熱性與乳化性，對人肝癌細(xì)胞HepG-2、人肺癌細(xì)胞A549、人胃腺癌細(xì)胞MGC-803的增殖也有明顯的抑制效果[13]。

4 對哺乳動(dòng)物細(xì)胞的影響

將柞蠶蛹抗病活性物質(zhì)進(jìn)行毒理學(xué)實(shí)驗(yàn)，對實(shí)驗(yàn)動(dòng)物無有害副作用，且可以促進(jìn)生長發(fā)育。應(yīng)用于臨床乙型肝炎患者進(jìn)行治療，患者肝痛、黃疸等臨床癥狀逐漸消失，無不良影響[14]。說明抗菌肽具有選擇性殺傷病毒的能力，并且促進(jìn)正常細(xì)胞及器官的生理功能，起到營養(yǎng)及保護(hù)作用。方紹亮[15]用大腸桿菌誘導(dǎo)柞蠶蛹產(chǎn)生抗菌肽，經(jīng)過人工化學(xué)合成可得到pro-ApCec2(含前肽和成熟肽)和M-ApCec(成熟肽)兩個(gè)肽。通過研究發(fā)現(xiàn)M-ApCec對大腸桿菌K12和枯草桿菌有明顯作用，可以通過損壞細(xì)菌細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)，使細(xì)胞完整性破壞，從而殺死細(xì)菌的作用。而將M-ApCec作用于小鼠新鮮血細(xì)胞，不同濃度的抗菌肽溶液均沒有造成溶血現(xiàn)象。證明抗菌肽對人體正常細(xì)胞無毒副作用，可以安全地應(yīng)用于臨床。

5 柞蠶蛹抗菌肽在農(nóng)業(yè)的應(yīng)用

中國為傳統(tǒng)農(nóng)業(yè)大國，將柞蠶蛹抗菌肽應(yīng)用在農(nóng)業(yè)領(lǐng)域中是利國利民的好事。資料顯示，抗菌肽在轉(zhuǎn)基因植物中以孟德爾法則進(jìn)行遺傳，具有良好的穩(wěn)定性。將抗菌肽B和抗菌肽BD基因轉(zhuǎn)化于水稻、柑橘、桑樹、桉樹等農(nóng)作物，均可以產(chǎn)生良好的抗病能力[16]。意味著柞蠶蛹抗菌肽增強(qiáng)農(nóng)作物自身抵御能力以及減少未來農(nóng)藥使用成為了可能。

董春[17]等用剪葉法對秧期和孕穗期的水稻進(jìn)行白葉枯病毒的接種，并用柞蠶蛹誘導(dǎo)后產(chǎn)生抗菌肽的免疫淋巴血與菌液混合形成對照。在電鏡下觀察可發(fā)現(xiàn)，抗菌肽可使病毒細(xì)胞膜發(fā)生破壞，菌體細(xì)胞壁破裂，內(nèi)容物流出，延緩水稻發(fā)病進(jìn)程，對水稻的致病作用減弱,表明柞蠶蛹抗菌肽對水稻白葉枯病毒有明顯的抑制作用。鄧小娟等[18]以胡蘿卜軟腐病菌、黃瓜角斑病菌、馬鈴薯青枯病菌等植物病原菌為對象，研究柞蠶蛹抗菌肽的抗菌能力，結(jié)果發(fā)現(xiàn)抗菌肽對以上病原體均有明顯抑制作用，證明柞蠶蛹抗菌肽的殺菌特性是廣譜的。

6 柞蠶蛹抗菌肽在養(yǎng)殖業(yè)的應(yīng)用

已有資料顯示，柞蠶蛹蛋白可添加于海膽、仔魚、仔豬等的生物飼料中。由于柞蠶蛹蛋白中含有豐富的抗菌肽，添加于基礎(chǔ)餌料中可以增強(qiáng)腸道免疫力，促進(jìn)動(dòng)物生長發(fā)育與抗病能力，降低致病菌對腸道的炎性作用。孫永欣[19]等在凡納濱對蝦飼料中添加含有抗菌活性物質(zhì)的柞蠶蛹粉，對對蝦生長速率、成活率等方面進(jìn)行監(jiān)控，結(jié)果顯示柞蠶蛹抗菌肽的攝入可以使對蝦體內(nèi)免疫因子含量增加，腸道內(nèi)菌群結(jié)構(gòu)進(jìn)一步優(yōu)化，對蝦增重明顯，在有病原菌入侵時(shí)，表現(xiàn)出更強(qiáng)的生存能力。Ma[20]等在海參飼料中添加柞蠶蛹抗菌肽，發(fā)現(xiàn)海參生長速率明顯大于基礎(chǔ)飼料組與抗生素組，腸道菌群計(jì)量結(jié)果顯示，抗菌肽能使海參產(chǎn)桿菌量增加6倍、產(chǎn)乳酸菌量增加10倍，通過腸道內(nèi)益生菌數(shù)量的增加殺死致病菌，提高生存率。在肉仔雞基礎(chǔ)飼料中加入柞蠶蛹免疫活性蛋白，蛋白內(nèi)的抗菌肽等物質(zhì)可很快顯示出對生長速率、免疫能力等方面的影響。肉仔雞脾臟、法氏囊、胸腺發(fā)育更加完全，血清中IgG、IgM、C3、C4等含量有所提高[21]。證明柞蠶蛹免疫活性蛋白可以使動(dòng)物自身免疫力有所提高，從而更好地抵御外界致病菌對機(jī)體的影響。

蠶蛹抗菌肽對革蘭陽性菌、革蘭陰性菌等有廣譜的殺菌作用，對腫瘤細(xì)胞亦有影響其增殖分化的能力，而對于人體正常組織，則無毒副作用。這意味著抗生素濫用的今天，柞蠶蛹抗菌肽的應(yīng)用可為抗菌防病毒、治療腫瘤提供新的治療方法。在農(nóng)業(yè)方面，柞蠶蛹抗菌肽可以提高植物對病蟲害的抵御能力，為減少化學(xué)農(nóng)藥的使用提供了可能。另外，抗菌肽良好的遺傳穩(wěn)定性可以應(yīng)用于農(nóng)作物的基因改造中，使農(nóng)作物減少由于生長環(huán)境在而產(chǎn)生的減產(chǎn)情況。在畜牧業(yè)、養(yǎng)殖業(yè)等領(lǐng)域，柞蠶蛹抗菌肽可以促進(jìn)動(dòng)物免疫系統(tǒng)發(fā)育，在病原體入侵時(shí)有更高的生存率。生長速率快、死亡率低的優(yōu)勢可以為農(nóng)業(yè)生產(chǎn)創(chuàng)造更大的經(jīng)濟(jì)利益。