蛋白多肽類(lèi)藥物和單抗藥物免疫原性評(píng)價(jià)方法及研究進(jìn)展

王慧敏，聞鎳，王曉霞，劉麗，劉會(huì)芳

·綜述·

蛋白多肽類(lèi)藥物和單抗藥物免疫原性評(píng)價(jià)方法及研究進(jìn)展

王慧敏，聞鎳，王曉霞，劉麗，劉會(huì)芳

071028 保定，河北大學(xué)藥學(xué)院（王慧敏、劉會(huì)芳）；100176 北京，中國(guó)食品藥品檢定研究院國(guó)家藥物安全評(píng)價(jià)監(jiān)測(cè)中心藥物非臨床安全評(píng)價(jià)研究北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（聞鎳、王曉霞、劉麗）

免疫原性是指藥物刺激機(jī)體產(chǎn)生特異性抗體或致敏淋巴細(xì)胞的性質(zhì)[1]。許多生物藥物在體內(nèi)都具有免疫原性，對(duì)動(dòng)物或人給予蛋白多肽類(lèi)藥物或單克隆抗體（簡(jiǎn)稱(chēng)單抗）藥物后可能會(huì)引起機(jī)體產(chǎn)生抗藥物抗體（anti-drug antibody，ADA）。ADA 會(huì)對(duì)藥物暴露、藥物代謝動(dòng)力學(xué)特征、藥效、藥物毒性作用等造成影響，主要包括：ADA 與藥物結(jié)合，可能增加或減少藥物的清除、影響血漿半衰期和組織分布、改變藥物的暴露水平和藥代動(dòng)力學(xué)特征；ADA 降低藥物暴露水平可能使非臨床毒理研究中藥物毒性作用被部分掩蓋，影響對(duì)藥物毒性作用的評(píng)價(jià)及對(duì)臨床研究中起始劑量的評(píng)估；中和抗體（neutralizing antibody，NAb）會(huì)中和藥物的活性，降低藥物的藥效作用；ADA 與藥物及內(nèi)源性同系蛋白結(jié)合后，可能會(huì)導(dǎo)致該蛋白缺陷綜合征，引起相應(yīng)毒性作用；對(duì)藥物的免疫應(yīng)答可能會(huì)導(dǎo)致過(guò)敏反應(yīng)、自身免疫等，ADA-藥物免疫復(fù)合物沉積可能引起免疫病理變化和相關(guān)不良反應(yīng)。因此，在非臨床藥代動(dòng)力學(xué)、藥理和毒理研究中評(píng)價(jià)免疫原性有助于對(duì)研究結(jié)果作出更加合理的解釋?zhuān)巧锼幧陥?bào)臨床試驗(yàn)的重要內(nèi)容。同樣，免疫原性評(píng)價(jià)也是蛋白多肽類(lèi)藥物和單抗藥物臨床研究中重要的評(píng)價(jià)項(xiàng)目，是監(jiān)管部門(mén)關(guān)注的重要內(nèi)容。在生物類(lèi)似藥物研發(fā)中，也是進(jìn)行相似性比對(duì)的主要指標(biāo)之一。EMA、FDA、NMPA 相關(guān)技術(shù)指導(dǎo)原則中都要求檢測(cè)此類(lèi)藥物的免疫原性，檢測(cè)的要求越來(lái)越嚴(yán)。

蛋白多肽類(lèi)和單抗藥物免疫原性評(píng)價(jià)主要包括判定 ADA 的存在與否、ADA 水平（抗體滴度）、是否具有中和能力、抗體產(chǎn)生比例和發(fā)展變化情況等。有多種方法和技術(shù)可用于 ADA 檢測(cè)。蛋白多肽類(lèi)和單抗藥物由于給藥劑量大、半衰期長(zhǎng)，循環(huán)中的高濃度藥物給免疫原性的評(píng)估帶來(lái)了很大挑戰(zhàn)。另外，可溶性靶標(biāo)的存在也會(huì)給單抗藥物免疫原性檢測(cè)帶來(lái)較大干擾。如何減少這些干擾，保證檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性、靈敏度、特異性和可靠性是當(dāng)前 ADA 和 NAb 檢測(cè)方法亟需解決的問(wèn)題。本文對(duì)常用的 ADA 和 NAb 檢測(cè)方法、檢測(cè)中存在的問(wèn)題、已有解決方法及其研究進(jìn)展進(jìn)行綜述，為蛋白多肽類(lèi)藥物和單抗藥物研究開(kāi)發(fā)和應(yīng)用中免疫原性的評(píng)價(jià)提供方法參考。

1 ADA 的檢測(cè)

ADA 的檢測(cè)和表征常采用多層次方法。檢測(cè)通常包括篩選試驗(yàn)和特異性確證試驗(yàn)；表征試驗(yàn)一般包括抗體滴度測(cè)定、亞型測(cè)定和中和抗體檢測(cè)。

ADA 檢測(cè)試驗(yàn)需要兩個(gè)關(guān)鍵的決策參數(shù)，分別為篩選臨界點(diǎn)和特異性臨界點(diǎn)[2]。篩選臨界點(diǎn)即篩選試驗(yàn)中判斷樣品為陰性或陽(yáng)性的響應(yīng)水平[3]，等于或高于篩選臨界點(diǎn)的樣品為陽(yáng)性樣品。相反地，若低于篩選臨界點(diǎn)，則判斷該樣品為陰性樣品。一個(gè)有效的篩選臨界點(diǎn)需要在預(yù)研究驗(yàn)證階段對(duì)一系列樣品測(cè)定值進(jìn)行系統(tǒng)性的統(tǒng)計(jì)分析，然后才能確定。一般情況下，一定比例的假陽(yáng)性結(jié)果比沒(méi)有假陽(yáng)性結(jié)果好，可以允許約 5% 的篩選試驗(yàn)陽(yáng)性結(jié)果為假陽(yáng)性，以保證可以檢測(cè)出弱陽(yáng)性樣品。同時(shí)，要求所使用的樣品可代表使用目標(biāo)群體或受試者。特異性臨界點(diǎn)是可以區(qū)別抗藥抗體與藥物是否特異性結(jié)合的值，其有效性非常關(guān)鍵，必須客觀評(píng)估。不建議使用 50% 信號(hào)抑制等主觀標(biāo)準(zhǔn)，信號(hào)略高于臨界點(diǎn)的抗藥抗體弱陽(yáng)性樣品的評(píng)價(jià)尤為重要。

抗藥抗體的表征試驗(yàn)中抗體滴度的測(cè)定，一般表示為，能夠產(chǎn)生陽(yáng)性結(jié)果的最低濃度，或者說(shuō)最大稀釋倍數(shù)；亞型測(cè)定即檢測(cè)抗藥抗體所屬 IgA、IgD、IgE、IgG 以及 IgM 中的哪一種亞型；中和抗體的檢測(cè)即為檢測(cè) ADA 中是否有可以中和藥物活性的抗體。

1.1 ADA 檢測(cè)分析方法

1.1.1 ADA 檢測(cè)常用分析方法 常用方法包括酶聯(lián)免疫法（ELISA）、放射免疫沉淀法（RIPA）、表面等離子體共振法（SPR）、電化學(xué)發(fā)光法（ECL）、全自動(dòng)納升級(jí)免疫分析工作站（Gyrolab）等。

免疫原性篩選通常使用操作方便快捷、能夠高通量測(cè)定的 ELISA 方法。橋式 ELISA 方法最為常用，該方法是利用包被在酶標(biāo)板上的抗體藥物捕獲血清樣品中的 ADA，然后加入生物素標(biāo)記的抗體藥物，使其與 ADA 結(jié)合。接著用鏈霉親和素-辣根過(guò)氧化物酶偶聯(lián)試劑作為檢測(cè)試劑，加入酶反應(yīng)底物顯色后，再利用酶標(biāo)儀進(jìn)行檢測(cè)。此法的優(yōu)點(diǎn)是能檢測(cè)各類(lèi)抗體的亞型，可高通量檢測(cè)。但此法不易檢測(cè)到低親和力的抗體，在包被或標(biāo)記藥物時(shí)可能會(huì)掩蓋或者改變藥物的抗原表位，而且檢測(cè)時(shí)也容易受到藥物本身的干擾[4-5]。

RIPA 法是以放射性標(biāo)記的抗原或抗體通過(guò)免疫沉淀檢測(cè) ADA。優(yōu)點(diǎn)是中等或高通量水平，通常靈敏度高、特異性強(qiáng)、操作簡(jiǎn)便、樣品及試劑用量少。但缺點(diǎn)是該方法中標(biāo)記抗原的比活度和放化純度必須足夠高，而且所使用放射性同位素的半衰期也必須足夠長(zhǎng)，否則有部分抗體無(wú)法被檢測(cè)到，導(dǎo)致定量不準(zhǔn)。而且同位素具有潛在放射性危害，同位素標(biāo)記還會(huì)影響表位的暴露，標(biāo)記藥物非特異性地夾帶在沉淀物中，相對(duì)于固相表面，結(jié)合力較弱。

SPR 技術(shù)是將藥物偶聯(lián)在傳感器芯片上，其可與樣品中的抗藥抗體結(jié)合[6]，使傳感器能夠間接檢測(cè)到抗藥抗體，最后通過(guò)系統(tǒng)擬合的結(jié)合曲線對(duì) ADA 進(jìn)行定量分析。該方法的優(yōu)點(diǎn)是可實(shí)現(xiàn)實(shí)時(shí)、無(wú)標(biāo)記檢測(cè)，而且快速、靈敏、操作簡(jiǎn)便，能檢測(cè)到不同親和力的抗體和各抗體亞型；缺點(diǎn)是所用試劑通用性差，通量低。

ECL 是一種在電極表面由電化學(xué)引發(fā)的特異性化學(xué)發(fā)光反應(yīng)，可用磁珠或者石墨電極板作為反應(yīng)載體。將生物素標(biāo)記的藥物與鏈霉親和素包被的微磁珠或石墨電極板相結(jié)合，利用該藥物去捕獲樣品中的 ADA，然后再加入釕標(biāo)記的藥物，使其與 ADA結(jié)合。形成免疫復(fù)合物后，以磁珠為載體的試驗(yàn)利用磁場(chǎng)吸附磁珠，并用 ProCell（在免疫分析系統(tǒng)中產(chǎn)生電化學(xué)信號(hào)的系統(tǒng)溶液）溶液將結(jié)合了磁珠的免疫復(fù)合物與未結(jié)合的組分分離，最后施加電壓?jiǎn)?dòng)反應(yīng)，激發(fā)釕發(fā)出光信號(hào)，通過(guò)采集光信號(hào)，并將光信號(hào)轉(zhuǎn)化成 ADA 濃度，得以實(shí)現(xiàn)對(duì) ADA 的定量。而以石墨電極板作為反應(yīng)載體的試驗(yàn)，將電極表面通電后，通過(guò)電化學(xué)作用激發(fā)釕標(biāo)記物發(fā)出強(qiáng)光，同樣通過(guò)檢測(cè)光信號(hào)進(jìn)行 ADA 的定量[7]。ECL 法精密度高、靈敏度高、線性范圍寬、檢測(cè)時(shí)間短、反應(yīng)體系可控、樣品用量少、通量高，缺點(diǎn)是需制備 2 種標(biāo)記物（生物素標(biāo)記的藥物和釕標(biāo)記的藥物），需要保證標(biāo)記物足夠穩(wěn)定，所用試劑通用性差。

使用 Gyrolab 平臺(tái)進(jìn)行免疫原性檢測(cè)，采用自動(dòng)化進(jìn)樣方式，將傳統(tǒng)的雙抗夾心大分子檢測(cè)方法與微流控 CD 技術(shù)結(jié)合在一起，CD 微結(jié)構(gòu)中裝有鏈霉親和素包裹的微珠填料，通過(guò)生物素捕捉試劑，與樣本特異性相結(jié)合，再與帶熒光團(tuán)的檢測(cè)試劑結(jié)合，用工作站中的激光激發(fā)熒光，并用檢測(cè)器對(duì)吸附在樣本上的熒光標(biāo)記物進(jìn)行讀數(shù)。該技術(shù)已經(jīng)被廣泛用于生物分析中的配體結(jié)合試驗(yàn)[8]。該技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)是自動(dòng)化、通量高、節(jié)省時(shí)間、試劑盒樣品用量少、檢測(cè)范圍廣、基質(zhì)效應(yīng)低。專(zhuān)用的 Gyrolab ADA 軟件還可以幫助確定篩選臨界點(diǎn)和確證臨界點(diǎn)。

1.1.2 ADA 檢測(cè)新興分析技術(shù) 為滿(mǎn)足越來(lái)越嚴(yán)格的評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)的要求，涌現(xiàn)出一些新興ADA 檢測(cè)分析技術(shù)。

免疫 PCR 法（Im-PCR），首先將 ADA 與固相上的藥物及生物素化藥物結(jié)合，從而形成“藥物-ADA-生物素化藥物”的橋梁，然后加入抗生物素-DNA 復(fù)合物作為檢測(cè)試劑，通過(guò)擴(kuò)增 DNA，間接對(duì) ADA 進(jìn)行檢測(cè)[9-10]。該方法也是在 ELISA 的基礎(chǔ)上建立起的，用 PCR 擴(kuò)增代替 ELISA 的酶催化底物顯色[11]。PCR 具有很強(qiáng)的放大能力，可以檢測(cè)稀釋后的 ADA，不僅可減少基質(zhì)效應(yīng)，還具有非常高的靈敏度和特異性。與對(duì)應(yīng)的 ELISA 比較，Im-PCR 可使 ADA 檢測(cè)的靈敏度提高約 1000 倍，而且本法中僅僅采用稀釋的方法就可以消除生物樣品中基質(zhì)的干擾[11]。

Singulex Erenna 是基于單分子檢測(cè)技術(shù)（SMC）的免疫檢測(cè)系統(tǒng)，原理與傳統(tǒng)的 ELISA 很相似，只是在捕獲和檢測(cè)步驟，藥物將每個(gè) ADA 轉(zhuǎn)化成信號(hào)。在洗脫步驟，熒光素標(biāo)記的檢測(cè)抗體從免疫復(fù)合物中解離下來(lái)，洗脫物被送入 Erenna 系統(tǒng)的毛細(xì)管中，毛細(xì)管上有一個(gè)非常微小的檢測(cè)空間可供激光照射。通過(guò)檢測(cè)空間時(shí)，單個(gè)的熒光素標(biāo)記抗體可以產(chǎn)生熒光閃爍，從而被檢測(cè)到。SMC 技術(shù)在獲得最優(yōu)化的免疫檢測(cè)效力的同時(shí)，操作流程相對(duì)更為簡(jiǎn)便，該技術(shù)通過(guò)整合獨(dú)特的洗脫步驟和靈敏的數(shù)字化檢測(cè)，相較于傳統(tǒng)免疫檢測(cè)技術(shù)，信噪比有了很顯著的改善，實(shí)現(xiàn)了可以在一個(gè)系統(tǒng)里同時(shí)檢測(cè)低水平和高水平的 ADA。

SQI SquidLite 技術(shù)可以在活化的玻璃表面上打印藥物的微陣列斑點(diǎn)[12]，加入待測(cè)樣品后，ADA 就會(huì)與藥物結(jié)合，再用熒光標(biāo)記的抗體結(jié)合 ADA，通過(guò)檢測(cè)熒光強(qiáng)度對(duì) ADA 進(jìn)行分析。該平臺(tái)實(shí)現(xiàn)了在同一孔中進(jìn)行 ADA 及其亞型的檢測(cè)，可以避免多次檢測(cè)帶來(lái)的樣本量的損耗。該技術(shù)與 ELISA 或 ECL 相比，有更高的敏感性和耐藥性。它的主要優(yōu)勢(shì)體現(xiàn)在，當(dāng)需要進(jìn)行檢測(cè)抗體分型時(shí)能夠多路復(fù)用，自動(dòng)化系統(tǒng)還具有高通量特性。然而該平臺(tái)使用專(zhuān)用緩沖器，前期需要大量成本。

Genalyte Maverick 系統(tǒng)也可以實(shí)現(xiàn)同時(shí)檢測(cè) ADA 及其亞型。該技術(shù)平臺(tái)，將藥物捕獲探針印刷在硅光子生物傳感器表面，樣品中的 ADA 會(huì)被藥物捕獲，使用結(jié)合在鏈霉親和素包被珠上的生物素化藥進(jìn)行檢測(cè)，由于珠子的加入改變了原樣品溶液的折射率，然后根據(jù)折射率的變化，就可以測(cè)定 ADA[8]。該系統(tǒng)能夠檢測(cè)所有免疫球蛋白亞型，包括單價(jià)的 IgG4。然而該平臺(tái)要求樣品進(jìn)行酸解離預(yù)處理，然后用包被在 96 孔板上的藥物親和捕獲 ADA，ADA 要在低 pH 下洗脫和中和。SQI SquidLite 技術(shù)和Genalyte Maverick 系統(tǒng)均有可自動(dòng)化的優(yōu)勢(shì)，但是后者不需要標(biāo)記，而且可以進(jìn)行實(shí)時(shí)動(dòng)態(tài)讀取結(jié)果，而前者只有最終的結(jié)果讀數(shù)，并且目前使用較少。

1.2 ADA 檢測(cè)中主要干擾因素及解決方法

1.2.1 樣品基質(zhì)中循環(huán)藥物的干擾及解決方法 免疫原性檢測(cè)，會(huì)受到樣品基質(zhì)中循環(huán)藥物的干擾，過(guò)量的藥物與 ADA 結(jié)合，會(huì)造成 ADA 檢測(cè)假陰性結(jié)果。目前 ADA 分析中有多種方法來(lái)提高藥物耐受性，減少或避免由于游離藥物的存在造成的假陰性結(jié)果，防止對(duì) ADA 的低估。

由于 ADA 在樣品中會(huì)有兩種存在形式，即游離ADA 和ADA-藥物復(fù)合物[13]。游離的ADA 相對(duì)比較容易檢測(cè)到，想要同時(shí)檢測(cè)與藥物結(jié)合的 ADA，單獨(dú)利用上述某一種方法或技術(shù)平臺(tái)難以實(shí)現(xiàn)。為了克服 ADA 檢測(cè)過(guò)程中受到的各種干擾，需要對(duì)樣品進(jìn)行預(yù)處理，目前主要的預(yù)處理方法有吸附小柱去除游離藥物、酸解離或堿解離（絕大多數(shù)情況下為酸解離）、磁珠提取和酸解離（BEAD）、固相提取和酸解離（SPEAD）等方法。

1.2.1.1 吸附小柱去除游離藥物 吸附小柱可與藥物特異性結(jié)合的物質(zhì)（抗人 IgG 單克隆抗體或多克隆抗體）與固相載體（瓊脂糖樹(shù)脂、磁性顆粒、芯片或微流體）偶聯(lián)，該物質(zhì)不與樣品中除游離藥物之外的其他成分反應(yīng)，可特異性地結(jié)合待測(cè)樣品中的游離藥物，可以使其后的 ADA 檢測(cè)中（如使用橋接 ELISA 法）避免游離藥物與標(biāo)記試劑競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合待檢測(cè)的 ADA 所致的干擾，包括對(duì) ADA 檢測(cè)的低估或假陰性結(jié)果[14]。這個(gè)方法不僅有效地減少了藥物對(duì)抗藥抗體檢測(cè)的干擾，同時(shí)還提高了檢測(cè)靈敏度。但該方法只是去除樣品中游離的藥物，而已經(jīng)與 ADA 結(jié)合的藥物難以去除，藥物-ADA 復(fù)合物依舊會(huì)影響檢測(cè)結(jié)果。

1.2.1.2 酸解離 酸解離是較為常見(jiàn)的預(yù)處理手段[5]。具體地說(shuō)，酸解離是通過(guò)酸化樣品來(lái)實(shí)現(xiàn)將 ADA-藥物復(fù)合物解離成 ADA 和藥物，但這僅是在酸性條件下的存在形式，酸化后的樣品需要在 pH 回到中性時(shí)方可被用于 ADA 的檢測(cè)。此時(shí)，樣品中的部分藥物和抗藥抗體又重新形成 ADA-藥物復(fù)合物。而且，酸處理可以分解藥物-靶點(diǎn)復(fù)合物，可能會(huì)將游離靶點(diǎn)釋放到樣品基質(zhì)中，導(dǎo)致假陽(yáng)性結(jié)果。但酸解離的最大目的是使得原來(lái)已與藥物結(jié)合的抗藥抗體至少有部分可以被檢測(cè)到，如果不采用酸解的話，可能檢測(cè)不到 ADA。在使用酸解離處理樣品的 ECL 檢測(cè)方法中，即使酸化后樣品中的抗藥抗體在中性 pH 條件下，僅僅只有部分會(huì)同時(shí)與電極板微孔中生物素化的藥物以及釕標(biāo)記的藥物結(jié)合，但仍然可被檢測(cè)出來(lái)。在所用酸解試劑不影響 ADA 性質(zhì)的前提下，此方法簡(jiǎn)單，易操作。

1.2.1.3 BEAD 和 SPEAD BEAD 法與 SPEAD 法原理相似，兩者均是在載體上包被鏈霉親和素以結(jié)合生物素-藥物偶聯(lián)物，差別在于 BEAD 法提取 ADA 的載體是磁珠，SPEAD 法提取 ADA 的載體是鏈霉親和素包被的石墨電極板或酶標(biāo)板[15-18]。在這兩種方法中，藥物-ADA 復(fù)合物在低 pH 條件下解離，當(dāng)溶液中和后，加入生物素-藥物偶聯(lián)物，與游離藥物競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合 ADA，生物素-藥物偶聯(lián)物與 ADA 結(jié)合后被捕獲在鏈霉親和素包被的載體（磁珠或板）上。捕獲的 ADA 再次在低 pH 條件下處理洗脫，然后進(jìn)行檢測(cè)。相對(duì)而言，SPEAD 法具有操作簡(jiǎn)單和材料價(jià)格較低的優(yōu)勢(shì)，但與磁珠相比，板的結(jié)合能力相對(duì)較低。根據(jù)本實(shí)驗(yàn)室經(jīng)驗(yàn)，同樣條件下，BEAD 法得到的檢測(cè)結(jié)果相對(duì)穩(wěn)定，易重復(fù)。

1.2.1.4 沉淀和酸解離 Zoghbi 等[19]開(kāi)發(fā)了一種突破性的新方法，即采用沉淀和酸解離（PandA）相結(jié)合的方法來(lái)克服 ADA 檢測(cè)中的藥物干擾。該方法的原理是將過(guò)量的藥物添加到含 ADA 的血清樣品中并孵育，以形成 ADA-藥物復(fù)合物。初次孵育后，在樣品中添加 PEG 并孵育以使復(fù)合物沉淀。對(duì)沉淀進(jìn)行一系列洗滌，最后一次洗滌后，將沉淀用乙酸解離，使 ADA-藥物復(fù)合物解離成 ADA 和藥物，并直接包被到石墨電極板上。孵育后，將板封閉，然后加入釕標(biāo)記的藥物與包被的 ADA 結(jié)合，通過(guò) ECL 方法對(duì) ADA 進(jìn)行檢測(cè)。在他們的方法中，分別使用了人源化 IgG1、全人源 IgG4 和人源化 IgG4 單抗藥物進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，均證明了該方法的適用性。然而本實(shí)驗(yàn)室在實(shí)際應(yīng)用該方法時(shí)發(fā)現(xiàn)，由于操作步驟較多，分離沉淀和上清液難度也較大，而 PEG 的濃度也會(huì)影響靈敏度和特異性，因此不確定因素較多，導(dǎo)致重復(fù)性較差。

1.2.2 基質(zhì)中可溶性靶標(biāo)的干擾及解決方法 對(duì)于單抗藥物，可溶性靶標(biāo)的干擾也是一個(gè)特別具有挑戰(zhàn)性的問(wèn)題。可溶性的二聚體或多聚體藥物靶標(biāo)可以在兩個(gè)標(biāo)記藥物分子之間形成橋梁，容易導(dǎo)致 ADA 假陽(yáng)性結(jié)果。

單克隆抗體藥物 ADA 檢測(cè)中，對(duì)于可溶性靶標(biāo)的干擾問(wèn)題，目前通常采用的解決方法是將基質(zhì)中的可溶性靶點(diǎn)進(jìn)行清除，通?？梢杂冒悬c(diǎn)抑制劑（一般為相應(yīng)的抗靶點(diǎn)抗體）去結(jié)合靶點(diǎn)，可去除靶點(diǎn)的干擾作用，提高靶點(diǎn)耐受性[20]。

1.2.3 基質(zhì)中類(lèi)風(fēng)濕因子的干擾及解決辦法 類(lèi)風(fēng)濕因子（RF）是以變性的 IgG 的 Fc 片段為靶抗原的自身抗體，RF 不僅可與變性的 IgG 結(jié)合，也與自身 IgG 或異體 IgG 反應(yīng)，常對(duì)免疫檢測(cè)造成干擾。在檢測(cè) ADA 時(shí)，如果用的捕獲抗體和檢測(cè)抗體均為 IgG，樣本基質(zhì)中的 RF 能同時(shí)與二者結(jié)合，形成捕獲抗體-RF-檢測(cè)抗體復(fù)合物，從而產(chǎn)生 ADA 假陽(yáng)性。而當(dāng) RF 只能與其中一種抗體結(jié)合時(shí)，又會(huì)造成空間位阻，導(dǎo)致假陰性結(jié)果的產(chǎn)生。對(duì)于存在 RF 干擾的樣本，可通過(guò)對(duì)樣本進(jìn)行前處理以消除或盡可能降低其干擾。常用的方法包括：分析前在樣本中加入動(dòng)物血清或 IgG，或加入封閉阻斷試劑；用包被 IgG 的固體顆粒吸附；使用阻斷試管采集樣本等[21]。

前文所述的檢測(cè)方法和平臺(tái)多數(shù)都較為傳統(tǒng)，通常都是在前處理過(guò)程中將 ADA-藥物復(fù)合物分開(kāi)，然后單獨(dú)檢測(cè) ADA。是否可以實(shí)現(xiàn)在 ADA-藥物復(fù)合物不分開(kāi)的情況下檢測(cè) ADA，值得進(jìn)一步探究。

2 NAb 的檢測(cè)

藥物的中和抗體指能夠中和藥物活性的抗藥抗體，單抗藥物的中和抗體是與單抗互補(bǔ)決定區(qū)（CDR）特異性結(jié)合的抗藥抗體[22]。在某些情況下，NAb 還可以與內(nèi)源性對(duì)應(yīng)物發(fā)生交叉反應(yīng)，從而導(dǎo)致一些正常生理功能受損和危及生命的副作用。因此 NAb 的表征已經(jīng)成為評(píng)估生物技術(shù)藥物安全性和有效性的重要要素。

2.1 NAb 檢測(cè)方法

NAb 檢測(cè)通常分為兩類(lèi)：基于細(xì)胞的分析檢測(cè)（CBA）和競(jìng)爭(zhēng)性配體結(jié)合分析檢測(cè)（CLBA）[23]。CBA 方法使用表達(dá)藥物預(yù)定靶點(diǎn)的細(xì)胞，樣品中的 NAb 阻止了藥物與其靶點(diǎn)結(jié)合產(chǎn)生的細(xì)胞效應(yīng)，從而根據(jù)細(xì)胞效應(yīng)減弱的程度進(jìn)行 NAb 分析；CLBA 方法是通過(guò)評(píng)價(jià)可溶性靶點(diǎn)和樣品中NAb 對(duì)藥物的競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合，再結(jié)合 ELISA 或 ECL 平臺(tái)進(jìn)行 NAb 檢測(cè)。

對(duì)于 NAb 檢測(cè)，監(jiān)管機(jī)構(gòu)推薦基于細(xì)胞的分析檢測(cè)作為首選方法，因?yàn)榧?xì)胞反應(yīng)更能反映 NAb 在體內(nèi)對(duì)藥物的影響[3]。抗體依賴(lài)性細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性（ADCC）是一種常見(jiàn)的治療性抗體藥物的作用機(jī)制。Wu等[23]建立、優(yōu)化了一種基于 ADCC 的 NAb 檢測(cè)方法，用該方法來(lái)檢測(cè)貝那利珠單抗給予人后誘導(dǎo)的 NAb。其原理是貝那珠單抗與靶細(xì)胞上的人 IL-5R 結(jié)合，并且貝那珠單抗的 Fc 區(qū)通過(guò) CD16 與效應(yīng)細(xì)胞結(jié)合，從而誘導(dǎo)靶細(xì)胞的 ADCC。ADCC 活性與熒光素酶報(bào)告基因的激活密切相關(guān)。在含有 NAb 的血清樣品中，ADCC 就會(huì)被 NAb 抑制，導(dǎo)致熒光素酶信號(hào)（RLU 值）降低。產(chǎn)生的熒光素酶信號(hào)與樣品中存在的 NAb 數(shù)量成反比。雖然該方法藥物耐受性和靈敏度都不是很高，但用于檢測(cè)臨床樣本是可行的。

美國(guó)瑞澤恩制藥公司發(fā)明了用于檢測(cè)中和抗體的競(jìng)爭(zhēng)性配體結(jié)合法[24]，該方法簡(jiǎn)單來(lái)說(shuō)包括以下步驟，首先要獲取樣品，然后在捕獲試劑（一般為生物素標(biāo)記的治療性蛋白藥物）存在下孵育樣品，最后加入檢測(cè)試劑。其中相對(duì)于對(duì)照樣品降低的信號(hào)指示針對(duì)蛋白多肽或單抗藥物的中和抗體存在。該方法靈敏度較高，特異性較強(qiáng)，動(dòng)態(tài)范圍較廣，檢測(cè)時(shí)間較短，有相對(duì)更高的藥物耐受性。

Wu等[23]曾通過(guò)檢測(cè)貝那利珠單抗的中和抗體對(duì)比了 CBA 與 CLBA 兩種方法在檢測(cè) NAb 時(shí)精密度、靈敏度以及藥物耐受性等方面的差異。CLBA 與 CBA 批內(nèi)變異相當(dāng)，與 CBA 相比，CLBA 批間變異相對(duì)小得多，因此 CLBA 比 CBA 精密度更高。CLBA 對(duì)單克隆ADA 陽(yáng)性對(duì)照及多克隆 ADA 陽(yáng)性對(duì)照的檢測(cè)靈敏度也相對(duì)較高。另外，盡管兩種方法的藥物耐受性都是有限的，但 CLBA 藥物耐受性約為 2.5倍（可檢測(cè)到的 NAb 濃度與藥物濃度比），而 CBA 則只有 1.6 倍，因此 CLBA 藥物耐受性同樣相對(duì)較高。Hu 等[25]在 3 項(xiàng)臨床研究中也進(jìn)行了 CBA 和 CLBA 法的對(duì)比，其中兩項(xiàng)研究結(jié)果表明 CBA 和 CLBA 檢測(cè)中和抗體的能力相當(dāng)，在第三項(xiàng)研究中，CLBA 表現(xiàn)相對(duì)較差。由此可見(jiàn)，無(wú)論是 CBA 還是 CLBA，都有自身的優(yōu)勢(shì)和局限性，應(yīng)根據(jù)每一種藥物獨(dú)特的作用機(jī)制、免疫風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估以及技術(shù)可行性評(píng)估去選擇和設(shè)計(jì) NAb 檢測(cè)方法。

2.2 NAb 檢測(cè)中常見(jiàn)的干擾因素及解決辦法

在 CBA 分析中，同樣存在著樣品基質(zhì)對(duì)檢測(cè)的干擾，樣本基質(zhì)中高濃度的循環(huán)藥物可與 NAb 結(jié)合，并導(dǎo)致假陰性結(jié)果；樣品基質(zhì)中的可溶性靶點(diǎn)與藥物結(jié)合，阻止了藥物介導(dǎo)的細(xì)胞依賴(lài)的生物活性作用，導(dǎo)致產(chǎn)生假陽(yáng)性結(jié)果。而在 CLBA 分析中，游離的可溶性靶標(biāo)可以阻止標(biāo)記的靶標(biāo)與檢測(cè)板上包被的藥物結(jié)合，從而產(chǎn)生假陽(yáng)性結(jié)果。

為了避免假性結(jié)果的出現(xiàn)，可采用各種方法來(lái)減輕循環(huán)藥物及可溶性靶點(diǎn)對(duì) NAb 分析的干擾。用于解決 ADA 檢測(cè)干擾問(wèn)題的預(yù)處理方法同樣適用于 NAb 的檢測(cè)，例如酸解離、循環(huán)藥物的去除、從樣品基質(zhì)中分離 ADA 或使用抗靶點(diǎn)抗體抑制藥物靶點(diǎn)等，但有些方法的一些步驟需要進(jìn)行改進(jìn)，如 SPEAD 和 BEAD 方法，以更有利于 NAb 的檢測(cè)。

在 SPEAD 或 BEAD 中，在低 pH 下，鏈霉親和素包被的磁珠上結(jié)合的生物素-藥物結(jié)合物由于結(jié)合能力降低可能會(huì)發(fā)生一定程度的浸出，盡管通常來(lái)講生物素-藥物的浸出對(duì) ADA 分析沒(méi)有明顯影響，但浸出的生物素-藥物會(huì)與 NAb 結(jié)合，可能干擾 NAb 檢測(cè)，影響分析結(jié)果?？赏ㄟ^(guò)優(yōu)化所用洗脫溶液的 pH、生物素摩爾比以及孵育時(shí)間等實(shí)驗(yàn)條件，解決生物素-藥物結(jié)合物浸出問(wèn)題[15]。

3 結(jié)語(yǔ)

在生物技術(shù)藥物的安全性和有效性的評(píng)估中，免疫原性一直是非常重要的評(píng)價(jià)內(nèi)容[26]，ADA 檢測(cè)方法缺乏標(biāo)準(zhǔn)化是免疫原性評(píng)價(jià)的一大問(wèn)題[27]。高濃度循環(huán)藥物的干擾，是當(dāng)前 ADA 與 NAb 檢測(cè)面臨的主要問(wèn)題。對(duì)于單抗藥物而言，可溶性靶標(biāo)也會(huì)對(duì)檢測(cè)產(chǎn)生干擾，這些都會(huì)直接影響檢測(cè)結(jié)果。目前主要的方法是進(jìn)行酸解或磁珠提取等預(yù)處理，或者將不同預(yù)處理方法相結(jié)合。在研究中，應(yīng)該考慮每種藥物的特點(diǎn)、檢測(cè)目的、風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估、靈敏度目標(biāo)、操作難易程度及可行性等，選擇適用的分析方法和平臺(tái)。

近年來(lái)，不同的免疫原性分析方法在靈敏度和耐藥性方面有了大幅提高，并且在持續(xù)完善。隨著免疫原性評(píng)價(jià)技術(shù)的不斷進(jìn)步，相信將有更加優(yōu)化的方法出現(xiàn)，用于準(zhǔn)確評(píng)價(jià)蛋白多肽類(lèi)和單抗藥物的免疫原性。

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2020-10-23

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