子宮內(nèi)膜異位癥相關(guān)生物標(biāo)志物的研究進(jìn)展

江妹，岳文濤

子宮內(nèi)膜異位癥（endometriosis，EMs）是子宮內(nèi)膜的腺體和間質(zhì)組織種植于子宮腔外的一種激素依賴性疾病。近年來，EMs 的發(fā)病率呈現(xiàn)明顯的增高趨勢，已是目前常見的婦科疾病之一，累及全世界高達(dá)10%的育齡期婦女[1]。盡管對EMs 的研究不斷深入，但EMs 的臨床診斷及治療仍然缺乏足夠敏感和特異的體征、癥狀以及血液檢測。目前，診斷EMs 的金標(biāo)準(zhǔn)依然為腹腔鏡檢查。因此，癥狀的非特異性以及侵入性的診斷方法往往會導(dǎo)致對EMs 診斷和治療的延遲。鑒于EMs 的復(fù)雜性和異質(zhì)性，探索敏感度高、特異性強(qiáng)的生物標(biāo)志物或組合性生物標(biāo)志物對EMs 的無創(chuàng)性診斷及早期診斷至關(guān)重要?，F(xiàn)對與EMs 相關(guān)的生物標(biāo)志物的最新研究進(jìn)展進(jìn)行綜述。

1 EMs 分子病因?qū)W相關(guān)的生物標(biāo)志物

EMs 通常被認(rèn)為是一種良性疾病，但是EMs 病變廣泛，形態(tài)多樣，具有惡性腫瘤的臨床特性，如侵襲性和復(fù)發(fā)性，亦可發(fā)生惡變等[1]。雖然近年有大量的基礎(chǔ)和臨床研究探討EMs 的病因機(jī)制，但是EMs發(fā)展的確切起源及發(fā)病機(jī)制仍存在爭議。越來越多的研究證明EMs 不是一種單一的疾病，而是多因素共同導(dǎo)致的一種慢性病，這些因素包括遺傳因素、表觀遺傳、激素、免疫反應(yīng)、微環(huán)境及環(huán)境因素等。這些多重相互聯(lián)系的因素可能解釋了EMs 具有不同的發(fā)病位置、癥狀以及激素反應(yīng)等復(fù)雜的疾病表現(xiàn)及異質(zhì)性[2]。因此，在EMs 發(fā)展的各個(gè)階段，檢測血液、尿液、宮頸黏液等體液中相關(guān)的細(xì)胞、蛋白和基因等生物標(biāo)志物對于EMs 的無創(chuàng)性診斷具有重要的意義。

1.1 腫瘤相關(guān)的糖類抗原CA-125 是一種成熟的腫瘤標(biāo)志物，其常被用于上皮性卵巢癌的診斷，亦是目前研究最廣泛的EMs 無創(chuàng)診斷標(biāo)志物。多項(xiàng)研究表明EMs 患者的血清CA-125 水平升高，且升高程度可能與EMs 疾病的嚴(yán)重程度密切相關(guān)[3]。2016 年Hirsch 等[4]綜合先前的研究，對1 500 多例EMs 患者和1 300 例對照組的資料進(jìn)行了薈萃分析，闡述了血清CA-125 診斷EMs 的準(zhǔn)確性。以30 U/mL 為檢測閾值，敏感度為52.4%，特異度為92.7%。該研究顯示血清CA-125（閾值30 U/mL）可作為有癥狀患者的常規(guī)檢測，但不推薦作為篩查試驗(yàn)。CA-125≥30 U/mL 可高度預(yù)測具有疼痛和（或）不孕癥的女性患者，但是CA-125＜30 U/mL 不能排除EMs。由于在許多生理或病理?xiàng)l件下均可導(dǎo)致CA-125 水平升高，將CA-125 作為單一的血清生物標(biāo)志物易增加假陽性結(jié)果，因此CA-125 不能滿足EMs 充分診斷的理想標(biāo)準(zhǔn)[5]。

1.2 細(xì)胞因子細(xì)胞因子是一種廣泛參與細(xì)胞信號傳遞的小蛋白。在EMs 中，細(xì)胞因子可促進(jìn)疾病的進(jìn)展。它們在子宮內(nèi)膜細(xì)胞逃避免疫監(jiān)視、降低識別和破壞異位細(xì)胞中發(fā)揮重要作用，有助于子宮內(nèi)膜異位病灶的植入。研究表明EMs 患者血清中白細(xì)胞介素1（IL-1）、IL-2、IL-4、IL-6、IL-8、IL-10、腫瘤壞死因子α（TNF-α）等多種炎癥因子，趨化因子及細(xì)胞黏附因子等的水平增高，它們可能被用作EMs的生物標(biāo)志物[6]。現(xiàn)研究多采用多個(gè)細(xì)胞因子的組合檢測，以評價(jià)細(xì)胞因子作為診斷EMs 的生物標(biāo)志物的可能。2019 年Knific 等[7]評估了116 例EMs 患者血漿樣本中40 種細(xì)胞因子，包括炎癥因子和趨化因子等。該研究通過這40 種細(xì)胞因子的血漿濃度、臨床數(shù)據(jù)及適當(dāng)?shù)慕y(tǒng)計(jì)分析，發(fā)現(xiàn)并沒有任何一組細(xì)胞因子的組合具有足夠的敏感度和特異度診斷EMs，表明選定的細(xì)胞因子的水平對診斷EMs 的潛力有限?？傊?，由于細(xì)胞因子的作用具有多效性，可以參與各種生理或病理的生物途徑，缺乏特異性，故目前尚無細(xì)胞因子能夠作為EMs 的生物標(biāo)志物。此外，有研究表明，EMs 患者患其他與自身免疫或激素失調(diào)相關(guān)疾病的風(fēng)險(xiǎn)更高，如纖維肌痛、感染、慢性疲勞綜合征、腸道綜合征、甲狀腺炎、系統(tǒng)性紅斑狼瘡和多發(fā)性硬化癥等[8]。因此，很難將單獨(dú)的細(xì)胞因子水平改變與一種疾病聯(lián)系起來。

1.3 激素EMs 是一種激素依賴性疾病，類固醇激素在EMs 發(fā)展中發(fā)揮重要作用。子宮內(nèi)膜的增殖和分化主要由雌、孕激素介導(dǎo)，研究表明異位子宮內(nèi)膜組織中存在雌激素、孕激素和雄激素受體。異位內(nèi)膜組織中的雌、孕激素受體表達(dá)水平存在一定差異，從而利于形成雌激素樣環(huán)境；但由于類固醇類激素的合成及作用局限于子宮內(nèi)膜異位組織中，因此血清中雌二醇和孕酮水平不受EMs 的影響[9]。Maia 等[10]檢測了97 例有明顯癥狀的EMs 患者血漿中尿皮質(zhì)素1（urocortin-1，Ucn1）的水平，結(jié)果顯示與對照組相比，EMs 患者的血漿Ucn1 水平顯著升高。受試者工作特征曲線（ROC）分析顯示血漿Ucn1＞46 pg/mL是診斷EMs 的最佳截?cái)嘀?，敏感度?6%，特異度為88%。在有慢性盆腔疼痛、不孕癥或兩種癥狀都有的女性中，患EMs 的可能性隨著血漿Ucn1 水平的增加而增加。2019 年P(guān)ergialiotis 等[11]通過系統(tǒng)回顧和薈萃分析探討EMs 患者子宮內(nèi)膜異位組織或血液樣本中Ucn1 表達(dá)的意義，分析結(jié)果表明，Ucn1 在EMs 患者異位組織及血液中表達(dá)水平顯著增高，其表達(dá)水平與疾病的嚴(yán)重程度呈正相關(guān)。盡管目前研究證據(jù)表明Ucn1 可作為EMs 臨床診斷及預(yù)后的具有潛在價(jià)值的生物標(biāo)志物，但是還需更多的臨床研究以評價(jià)Ucn1 的實(shí)際臨床應(yīng)用價(jià)值。

1.4 表觀遺傳相關(guān)的分子標(biāo)志物表觀遺傳修飾在不改變DNA 序列的前提下，通過調(diào)節(jié)DNA 甲基化、DNA 去甲基化、組蛋白修飾及染色質(zhì)重塑等調(diào)控重要基因的表達(dá)水平。現(xiàn)有的研究表明表觀遺傳修飾在EMs 的發(fā)展中發(fā)揮重要的作用。雌激素信號、低氧應(yīng)激及炎癥細(xì)胞因子是EMs 發(fā)生、發(fā)展的3個(gè)相互關(guān)聯(lián)的影響因素，而表觀遺傳調(diào)控在協(xié)調(diào)這3 個(gè)因素中起著核心作用[12]。DNA 甲基化由DNA 甲基轉(zhuǎn)移酶（DNA methyl-transferases，DNMT）催化，已有研究表明EMs 患者中DNMT 的表達(dá)水平顯著升高，DNMT 的表達(dá)隨著類固醇激素的反應(yīng)而改變[13]。微小RNA（microRNA，miRNA）是一種單鏈非編碼RNA，在廣泛的生理病理過程中對表觀遺傳基因的調(diào)控發(fā)揮重要作用。近年研究認(rèn)為miRNA 有望成為EMs 診斷和預(yù)后的重要生物標(biāo)志物[14]。Moga 等[15]進(jìn)行薈萃分析發(fā)現(xiàn)，miR-200 家族、miR-143、miR-145、miR-20a 和miR199a 是EMs 中最常見的表達(dá)失調(diào)的miRNA。

1.5 循環(huán)子宮內(nèi)膜細(xì)胞（circulating endometrial cell，CEC）檢測CEC 是近年來提出的一種新的EMs 診斷標(biāo)志物，在EMs 患者的外周血中檢測到的CEC 為異位病變的存在提供了明確的依據(jù)[16]。Chen等[17]結(jié)合微流控芯片技術(shù)與免疫組織化學(xué)染色的方法，成功分離并鑒定了EMs 患者外周血中的CEC，并評估其作為EMs 的生物標(biāo)志物的可能性。該研究顯示EMs 患者外周血中CEC 檢出率為89.5%，顯著高于健康對照組（15%），并且CEC 與月經(jīng)周期無相關(guān)性。2019 年P(guān)ospisilova 等[18]進(jìn)行了一項(xiàng)多中心研究，對423 例EMs 患者外周血中的CEC 進(jìn)行分離富集，并對其中11 例患者的CEC 進(jìn)行了基因表達(dá)分析，結(jié)果顯示CEC 的細(xì)胞形態(tài)學(xué)分析和基因表達(dá)譜分析結(jié)果與患者的臨床特征密切相關(guān)；EMs 患者外周血中CEC 的檢出率為78.4%，其中分泌期CEC的數(shù)量最高；基因表達(dá)分析結(jié)果顯示在CEC 數(shù)量較高（每8 mL 樣品CEC≥1 000 個(gè)）的樣品中，基因NANOG、角蛋白18（cytokeratin 18，KRT18）、波形蛋白（Vmentin，VIM）和FLT1 的表達(dá)水平顯著增高。因此，CEC 是一種有潛在臨床應(yīng)用價(jià)值的EMs 生物標(biāo)志物，利用EMs 患者外周血中CEC 的特征及相關(guān)的差異表達(dá)的分子標(biāo)志物為EMs 的非侵入性輔助診斷提供了可能。

2 高通量組學(xué)技術(shù)篩選EMs 生物標(biāo)志物

近年來，隨著分子生物學(xué)及生物信息學(xué)分析技術(shù)的不斷發(fā)展，一種非侵入性的高通量的篩選EMs生物標(biāo)志物的方法應(yīng)運(yùn)而生。這些研究使用高通量的篩選技術(shù)檢測群體之間的多重差異。其優(yōu)點(diǎn)是不限定于某種特定的一組標(biāo)志物或已知或懷疑的疾病發(fā)病機(jī)制相關(guān)的蛋白。這種不偏倚的方法可能有助于評估疾病的特異性生物標(biāo)志物[19]。其中最常用的篩選技術(shù)主要有基因組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)及代謝組學(xué)。鑒于EMs 具有復(fù)雜性、異質(zhì)性以及不明確的病理生理學(xué)機(jī)制，同時(shí)缺乏理想的診斷工具，因此，高通量篩選技術(shù)可能成為發(fā)現(xiàn)EMs 生物標(biāo)志物一個(gè)有應(yīng)用前景的方法。

2.1 基因組學(xué)已有研究表明，EMs 是一種受多種遺傳因素和環(huán)境因素影響的疾病，因此，研究遺傳因素對了解該疾病具有重要意義。全基因組關(guān)聯(lián)研究（genome wide association studies，GWAS）可以用來檢測基因組的變異，亦稱為單核苷酸多態(tài)性（single nucleotide polymorphisms，SNP）。Rahmioglu 等[20]進(jìn)行了一項(xiàng)大規(guī)模的薈萃分析，數(shù)據(jù)包含了11 506 例患者及32 678 例對照，結(jié)果顯示在整個(gè)研究人群中發(fā)現(xiàn)了6 個(gè)基因組區(qū)域可能參與EMs 的病理生理發(fā)展，包括7p15.2、WNT4、VEZT、CDKN2B-AS1、ID4 和GREB1。Pagliardini 等[21]對590 例患者外周血DNA進(jìn)行檢測，研究證實(shí)與正常人群相比，VEZT 基因接近的SNP rs10859871 與EMs 的高風(fēng)險(xiǎn)密切相關(guān)；該研究同時(shí)整合了先前的數(shù)據(jù)進(jìn)行薈萃分析，同樣證實(shí)SNP rs10859871 與EMs 存在顯著關(guān)聯(lián)。因此，與高風(fēng)險(xiǎn)EMs 相關(guān)的SNP 可能成為新的EMs 預(yù)測指標(biāo)和治療靶點(diǎn)，但還需大規(guī)模的基礎(chǔ)和臨床研究數(shù)據(jù)進(jìn)一步證實(shí)這些生物標(biāo)志物的臨床意義。

2.2 轉(zhuǎn)錄組學(xué)基于微陣列或RNA 測序的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析主要評估了4 組轉(zhuǎn)錄本的表達(dá)水平，包括信使RNA（mRNA）、miRNA、長鏈非編碼RNA（long non-coding RNA，lncRNA）和環(huán)狀RNA（circular RNA，circRNA）。雖然mRNA 表達(dá)水平的差異不一定轉(zhuǎn)化為蛋白質(zhì)水平的差異，但對mRNA 的分析?？梢宰鳛榈鞍踪|(zhì)水平的一個(gè)指標(biāo)。因此，可能在mRNA 水平上檢測到潛在的EMs 生物標(biāo)志物[22]。miRNA 是非編碼RNA 中穩(wěn)定性最好的一類，miRNA 表達(dá)水平可能與特定的疾病相關(guān)，檢測樣本可從病變組織或血清、血漿和其他循環(huán)體液中獲得。因此，近年來miRNA 被認(rèn)為具有很大潛力成為EMs 診斷和預(yù)后的重要生物標(biāo)志物[14]。Suryawanshi 等[23]通過實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（RT-qPCR）方法檢測了6 例健康對照、7 例EMs 患者及7 例EMs 相關(guān)性卵巢癌患者血漿中1 113 個(gè)miRNA 的表達(dá)，并鑒定出23 個(gè)miRNA 在EMs 患者的血漿中存在顯著表達(dá)差異。并通過進(jìn)一步驗(yàn)證發(fā)現(xiàn)了3 種miRNA（miR-16、miR-191和miR-195）可作為診斷EMs 的潛在生物標(biāo)志物。Pateisky 等[24]采用高通量RT-qPCR 陣列評價(jià)EMs 患者與健康對照者血漿中miRNA 的表達(dá)水平差異，發(fā)現(xiàn)血漿中特定的miRNA 表達(dá)水平與EMs 密切相關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)hsa-miR-154-5p 在EMs 患者血漿中高表達(dá)，其敏感度為67%，特異度為68%；同時(shí)將hsamiR-154-5p 聯(lián)合hsa-miR-196b-5p、hsa-miR-378a-3p 和hsa-miR-33a 作為組合診斷指標(biāo)檢測了83 例EMs 患者與健康對照者血漿中miRNA 的表達(dá)水平，結(jié)果顯示ROC 曲線下面積為0.72，P 值為0.000 2，該組合診斷可能適用于EMs 的非侵入性診斷。Vanhie 等[25]采用測序的方法獲得全基因組miRNA表達(dá)譜以評估EMs 患者和非EMs 患者血漿中miRNA 水平的差異。研究發(fā)現(xiàn)3 個(gè)miRNA（miR-125-5p、miR-28-5p 和miR-29a-3p）可用于診斷EMs，敏感度為78%，但是特異度僅為37%。盡管大量的研究證明miRNA 可作為診斷EMs 的潛在生物標(biāo)志物，但迄今為止，不同研究中確定的目標(biāo)之間沒有顯著重疊，還沒有單個(gè)或成組的miRNA 可以作為EMs的生物標(biāo)志物[15]。Wang 等[26]應(yīng)用全基因組測序分析EMs 患者和健康對照組之間差異表達(dá)的血清lncRNA，研究發(fā)現(xiàn)了5 種血清lncRNA（NR_038395，NR_038452，ENST00000482343，ENST00000544649和ENST00000393610）的組合具有診斷EMs 的價(jià)值，敏感度為89.7%，特異度為73.2%。

2.3 蛋白質(zhì)組學(xué)蛋白質(zhì)組學(xué)研究主要集中在蛋白的鑒定、表達(dá)、轉(zhuǎn)錄后修飾以及蛋白質(zhì)相互作用等方面。多項(xiàng)研究已采用蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)用于檢測EMs 患者外周血中差異表達(dá)的蛋白或多肽，相關(guān)研究已發(fā)現(xiàn)一些EMs 特異的潛在生物標(biāo)志物。Manousopoulou 等[27]利用蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)分別在病理組織及血清水平上篩選EMs 患者與正常對照組間的差異蛋白。該研究篩選出子宮內(nèi)膜異位組織中差異表達(dá)的1 212 個(gè)蛋白以及EMs 患者血清中差異表達(dá)的404 個(gè)蛋白，進(jìn)一步分析表明，這些與免疫應(yīng)答、炎癥反應(yīng)、細(xì)胞黏附等相關(guān)的差異蛋白在子宮內(nèi)膜異位組織和EMs 患者血清中明顯表達(dá)豐富。其中有21 種差異蛋白在子宮內(nèi)膜異位組織及血清樣品中都有相同的差異表達(dá)趨勢，可以作為EMs 潛在的組織特異性血清學(xué)標(biāo)志物進(jìn)行進(jìn)一步探討。Irungu等[28]采用2D-凝膠電泳和質(zhì)譜分析技術(shù)篩選了28 例EMs 確診患者和18 例接受手術(shù)的慢性盆腔疼痛患者之間的差異蛋白，并通過酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）方法對87 例血清樣本進(jìn)行進(jìn)一步的驗(yàn)證，研究篩選出差異表達(dá)的候選標(biāo)志物主要有蛋白LUM、CPM、TNC、TPM2 和PAEP。雖然目前有多項(xiàng)研究使用蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)發(fā)現(xiàn)了多個(gè)EMs 的生物標(biāo)志物，但蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)在EMs 臨床診斷中的應(yīng)用還需大樣本研究進(jìn)一步驗(yàn)證。

2.4 代謝組學(xué)代謝組學(xué)研究的代謝物主要存在于體液及組織中，包括代謝的中期或末期產(chǎn)物。代謝物的濃度和最終成分變化迅速，從而代謝組學(xué)的檢測反映了人群的當(dāng)前狀態(tài)。Vicente-Mu?oz 等[29]對50例EMs 和23 例健康婦女的血漿進(jìn)行代謝組學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，與健康女性相比，EMs 患者的血漿中纈氨酸、巖藻糖、含膽堿的代謝產(chǎn)物、賴氨酸/精氨酸和脂蛋白濃度增加，肌酐濃度降低。EMs 患者血漿代謝組學(xué)特征中發(fā)現(xiàn)變化的代謝物與該疾病的進(jìn)展密切相關(guān)。Braga 等[30]通過質(zhì)譜分析獲得50 例EMs 和50 例健康對照者血清樣品的代謝組學(xué)譜，利用恰當(dāng)?shù)念A(yù)測模型篩選出10 種潛在的生物標(biāo)志物，并對該模型進(jìn)行進(jìn)一步的驗(yàn)證。提示血清代謝組學(xué)可能用作EMs 患者的無創(chuàng)輔助診斷工具。

3 結(jié)語和展望

EMs 雖然是一種良性的婦科疾病，但其診斷和治療面臨著巨大的挑戰(zhàn)。盡管經(jīng)過幾十年的研究，但仍然沒有足夠敏感和特異的體征癥狀及用于血液檢測的生物標(biāo)志物，這嚴(yán)重阻礙了EMs 患者的及時(shí)診斷和治療。尋找一種或一組高敏感度和特異度的生物標(biāo)志物作為EMs 診斷和監(jiān)測的輔助手段具有重要的意義。隨著生物技術(shù)和生物信息學(xué)的不斷發(fā)展，有望發(fā)現(xiàn)敏感度和特異度均較高的診斷EMs 的生物標(biāo)志物。