外泌體誘導(dǎo)干細胞分化的研究進展

張水勤，肖雁冰

(1.遵義醫(yī)科大學(xué)研究生學(xué)院，貴州 遵義 563000；2.遵義醫(yī)科大學(xué)附屬婦幼保健院婦產(chǎn)科，貴州 遵義 563000)

除轉(zhuǎn)基因誘導(dǎo)及外源性誘導(dǎo)因子誘導(dǎo)干細胞分化外，與成熟體細胞共培養(yǎng)同樣可以誘導(dǎo)干細胞定向分化為目的細胞[1]，但誘導(dǎo)分化的機制尚未完全明確。有研究顯示，干細胞顯著的再生能力是由于其外泌體是組織修復(fù)過程中活躍的參與者[2]。目前，臨床上器官功能損傷的患者可以通過藥物、手術(shù)及器官移植等手段治療，但都無法徹底根治，并且常伴隨一系列相關(guān)并發(fā)癥。鑒于傳統(tǒng)療法的局限性，生物再生替代療法已成為目前器官功能損傷治療的研究熱點。已有研究證明，外泌體可以在不需要任何生長因子或刺激物的情況下誘導(dǎo)細胞定向分化[3]。以干細胞分化為目的細胞的替代療法可為退變及損傷組織或器官的修復(fù)再生提供足量且穩(wěn)定的細胞來源，使維持原有的生物力學(xué)功能、逆轉(zhuǎn)組織損傷、功能退化成為了可能。

1 外泌體的來源、結(jié)構(gòu)、種類及作用

細胞在特定外環(huán)境下產(chǎn)生的一些以膜為基礎(chǔ)結(jié)構(gòu)的細胞外囊泡，又被稱為細胞外小泡。細胞外囊泡分為三類：第一類是凋亡小體，直徑5～50 nm；第二類為微泡、外小體、微?；蛸|(zhì)膜衍生小泡，直徑50 ～1 000 nm；第三類也是最重要的一種，分泌型細胞外小泡，直徑50～150 nm，又被稱作外泌體，是細胞間通訊傳遞物質(zhì)的新發(fā)現(xiàn)[4]。細胞內(nèi)特異性的核酸、蛋白質(zhì)及其他生物活性分子根據(jù)細胞內(nèi)外環(huán)境選擇性地加載到外泌體中，并在全身循環(huán)。研究表明，外泌體在多種生物過程中發(fā)揮著通訊作用，例如細胞通訊、干細胞分化、器官再生等，是細胞間相互作用的一種新方式[5-6]。外泌體通過特定配體錨定在不同類型的細胞表面改變細胞間通訊，包括生物的發(fā)生、負載物的選擇、細胞的特異性攝取、抗原呈遞、免疫調(diào)節(jié)和藥物有效載荷傳遞[6]，提示外泌體是細胞間信號傳導(dǎo)的重要參與者，其功能及特征與起源細胞的生理功能及胞內(nèi)含有的特異性物質(zhì)有關(guān)[7-8]。

2 外泌體在生物醫(yī)學(xué)及組織修復(fù)中的作用

2.1 外泌體誘導(dǎo)干細胞在神經(jīng)再生與修復(fù)中的作用

Takeda等[9]發(fā)現(xiàn)，神經(jīng)細胞分泌的外泌體可誘導(dǎo)間充質(zhì)干細胞(mesenchyma stem cell，MSC)分化為神經(jīng)細胞，且分化后的MSC高表達神經(jīng)標(biāo)志物微管相關(guān)蛋白，這個復(fù)雜的過程由外部和固有信號共同驅(qū)動，這些信號最終決定了神經(jīng)細胞的類型和數(shù)量，而外泌體中的miRNA可能是MSC向神經(jīng)元分化的機制。外泌體可能通過膜融合或內(nèi)吞的方式將能夠重新編碼多種細胞機制的miRNA導(dǎo)入受體細胞中，從而有助于向星形細胞譜系的誘導(dǎo)[10]。事實上，外泌體運輸?shù)脑S多蛋白和miRNA都反映了其起源細胞的性質(zhì)。此外，Ma等[11]揭示了外泌體中部分miRNA的特征，證明miR-21a在神經(jīng)元生成和介導(dǎo)外泌體神經(jīng)源性潛力中有關(guān)鍵作用。

2.2 外泌體誘導(dǎo)干細胞在髓核再生與修復(fù)中的作用

2006年，Richardson等[12]將髓核細胞與骨髓間充質(zhì)干細胞直接共培養(yǎng)后，骨髓間充質(zhì)干細胞可表現(xiàn)出髓核細胞表型。近年來有研究發(fā)現(xiàn)，用熒光染料標(biāo)記的髓核細胞外泌體與骨髓間充質(zhì)干細胞直接共培養(yǎng)，可觀察到髓核細胞外泌體以內(nèi)吞的方式被骨髓間充質(zhì)干細胞攝取，骨髓間充質(zhì)干細胞向髓核細胞分化，并且分化能力強于細胞間接共培養(yǎng)[13]。藍蔚仁[3]的研究發(fā)現(xiàn)，敲減部分Rab27a蛋白的髓核細胞，其外泌體的釋放明顯減少，骨髓間充質(zhì)干細胞向髓核細胞分化明顯受到抑制，證明外泌體是誘導(dǎo)骨髓間充質(zhì)干細胞向髓核細胞分化的重要物質(zhì)之一。此外，髓核細胞經(jīng)骨髓間充質(zhì)干細胞分泌的外泌體處理后出現(xiàn)明顯增殖，通過定量檢測骨髓間充質(zhì)干細胞外泌體刺激后的髓核細胞發(fā)現(xiàn)，髓核細胞內(nèi)與椎間盤細胞外基質(zhì)丟失、退變密切相關(guān)的基質(zhì)金屬蛋白酶-1、基質(zhì)金屬蛋白酶-3表達均下降，而其抑制物蛋白表達呈升高趨勢，從而促進髓核細胞的增殖，延緩椎間盤組織的退化[14]。此外，在動物實驗中也發(fā)現(xiàn)，骨髓間充質(zhì)干細胞來源的外泌體可通過抑制炎性介質(zhì)及NLRP3等炎性小體的活性從而在髓核細胞中發(fā)揮抗炎作用，還可阻止椎間盤的退行性變[15]。以上研究為體外獲取更多的髓核細胞提供了更為簡單的方法，同時也為椎間盤病變的治療提供了全新的方向。

2.3 外泌體誘導(dǎo)干細胞在骨再生與修復(fù)中的作用

Chen等[16]將脂肪干細胞和軟骨細胞共培養(yǎng)后發(fā)現(xiàn)，脂肪干細胞具有新生軟骨形成的能力，可降低X型膠原蛋白和腫瘤壞死因子-α的表達，并且還能改善新生軟骨的凋亡和纖維化等問題。進一步研究發(fā)現(xiàn)，附載于聚乙烯亞胺支架上的外泌體改善了骨整合過程中的礦化作用，且誘導(dǎo)人牙周膜干細胞向骨分化[3]。一項動物實驗研究發(fā)現(xiàn)，與用PBS處理的軟骨病灶相比，胚胎干細胞衍生的外泌體治療骨缺損具有獨特的作用，其可使軟骨病灶完全恢復(fù)為類似于天然組織的軟骨和軟骨下骨[17]，證明外泌體在軟骨修復(fù)中有重要的作用。此外，在探索含MSC外泌體的絲素蛋白3D支架促進大鼠顱骨缺損區(qū)的骨再生實驗中，骨髓間充質(zhì)干細胞在附有外泌體的3D支架上培養(yǎng)14 d后，其相關(guān)促成骨基因ALP、RUNX2及OCN的表達均上調(diào)，說明骨髓間充質(zhì)干細胞的成骨分化受到支架上的外泌體的調(diào)控，并且主要發(fā)生在成骨分化后期[18-19]。外泌體顯示出其通過轉(zhuǎn)移生物成分改變細胞間通訊的能力，也進一步證明外泌體功能與外泌體來源細胞密切相關(guān)。

2.4 外泌體誘導(dǎo)干細胞在牙再生與修復(fù)中的作用

目前，牙周疾病的治療主要是修復(fù)和重建牙及牙周組織的結(jié)構(gòu)和功能完整性。有研究發(fā)現(xiàn)，在病變牙周圍移植骨髓間充質(zhì)干細胞后，腫瘤壞死因子-α和白細胞介素-1β明顯下調(diào)，破骨細胞數(shù)量減少，牙槽骨病變明顯逆轉(zhuǎn)，說明骨髓間充質(zhì)干細胞除可抑制牙周炎癥反應(yīng)外，還可以促進牙周組織的再生[20]。Wang等[21]的研究發(fā)現(xiàn)，人乳牙脫落細胞的外泌體可促進牙周膜干細胞的成骨分化，原因可能是外泌體攜帶的Wnt3a和BMP2抑制了BMP/Smad和Wnt/β-catenin信號通路，顯著增強成骨分化。Mohammed等[22]發(fā)現(xiàn)，脂肪間充質(zhì)干細胞的外泌體在大鼠實驗性牙周炎的輔助治療中，可促進新牙周組織的生成，說明BMC分泌的外泌體確實具有促進牙周組織再生的潛力。將人牙周干細胞與骨髓間充質(zhì)干細胞外泌體在體外共培養(yǎng)可發(fā)現(xiàn)，牙周組織再生和成骨分化可能是由于骨髓間充質(zhì)干細胞外泌體通過OPG-RANKL-RANK信號通路調(diào)節(jié)破骨細胞的功能，并影響巨噬細胞極化和白細胞介素-1β表達，從而調(diào)節(jié)炎癥性免疫反應(yīng)，抑制牙周炎的發(fā)展和牙周組織的免疫損傷[23]。還有實驗發(fā)現(xiàn)，脂多糖預(yù)處理牙囊細胞的外泌體后能促進牙囊細胞的增殖、遷移，形成完整的牙周組織，伴隨外泌體濃度的增加，牙囊細胞增殖、遷移速度加快，最終達到飽和狀態(tài)[24]。這為未來以新型材料為支架、以外泌體為載體誘導(dǎo)細胞定向分化提供了思路。

3 外泌體誘導(dǎo)干細胞在腫瘤發(fā)生、發(fā)展中的作用

與健康個體相比，癌癥患者中可以檢測到更多、更頻繁的外泌體指導(dǎo)細胞的分子通訊[9,25]。這種由外泌體指導(dǎo)的相互作用在腫瘤形成、進展、免疫逃逸、轉(zhuǎn)移及血管生成和耐藥性中具有促進作用[26]。CD99有助于抑制腫瘤的發(fā)生和分化，沉默CD99的尤文氏肉瘤細胞的外泌體通過miR-34a抑制Notch-NF-κB誘導(dǎo)促進尤文氏肉瘤細胞的神經(jīng)分化，減少細胞的增殖和遷移，進而誘導(dǎo)分化程度更高的惡性表型[27-28]。人肝癌HepG2細胞源性外泌體與脂肪間充質(zhì)干細胞共培養(yǎng)，其可誘導(dǎo)脂肪間充質(zhì)干細胞向癌相關(guān)肌成纖維細胞分化，同時也能顯著促進細胞增殖[26]，進一步提高腫瘤的侵襲力。也有研究發(fā)現(xiàn)，膠質(zhì)瘤細胞與星形膠質(zhì)細胞共孵育時，兩種細胞相互促進生長，甚至部分星形膠質(zhì)細胞表達致瘤表型[29]，原因可能在于外泌體起源于C6膠質(zhì)瘤細胞，外泌體的功能與細胞來源密切相關(guān)。

4 外泌體在機體代謝中的作用

人體心血管疾病、糖尿病、脂肪肝、骨質(zhì)疏松癥、氣道疾病、退行性疾病(包括癡呆癥)和某些癌癥，被認為在很大程度上是由肥胖引起的胰島素抵抗導(dǎo)致。脂肪組織外泌體在能量平衡和代謝中有重要作用。脂聯(lián)素是一種多效性器官保護蛋白，其通過與T-鈣黏蛋白結(jié)合被內(nèi)吞入細胞，從而刺激外泌體的生物合成和釋放[30-31]，導(dǎo)致細胞神經(jīng)酰胺(一種與胰島素抵抗、細胞死亡、炎癥和動脈粥樣硬化有關(guān)的鞘脂)的減少，過量的神經(jīng)酰胺可引起胰島素抵抗和心血管疾病相關(guān)臨床表現(xiàn)[32]。一項動物實驗研究發(fā)現(xiàn)，脂肪組織巨噬細胞衍生的外泌體可影響小鼠的胰島素敏感性，當(dāng)給予瘦小鼠肥胖小鼠脂肪組織巨噬細胞的外泌體時，可引起其葡萄糖不耐受和胰島素抵抗；而瘦小鼠脂肪組織巨噬細胞的外泌體則改善了肥胖小鼠的葡萄糖不耐受和胰島素抵抗，其可能是外泌體內(nèi)microRNAs(如miR-155)的變化對調(diào)節(jié)胰島素敏感性和葡萄糖穩(wěn)態(tài)有重要作用[33]。脂聯(lián)素如何通過外泌體提高胰島素敏感性和心臟功能，以及進一步應(yīng)用于臨床治療還有待進一步研究。

5 展望

目前，臨床上目的細胞及特定器官在體內(nèi)外的構(gòu)建是現(xiàn)代再生醫(yī)學(xué)及替代醫(yī)療的嶄新方案。其中干細胞是一種具有強大自我更新和多向分化潛能的細胞，但由于免疫排斥、誘導(dǎo)效率低、穩(wěn)定性較差及相關(guān)并發(fā)癥問題限制了干細胞在臨床上的廣泛運用[34]。為了避免這些風(fēng)險，體外目的細胞培養(yǎng)或無細胞誘導(dǎo)替代療法有望成為一種有前途的策略。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，干細胞療法用于細胞及組織的再生修復(fù)，不僅是因為干細胞在損傷部位的增殖和分化，也可能是由旁分泌釋放的外泌體發(fā)揮作用[2]。越來越多的研究表明，外泌體在各種生理系統(tǒng)中對傷口愈合和組織修復(fù)具有積極作用[35]，且外泌體的生物學(xué)效應(yīng)在很大程度上取決于供體細胞的來源和生理狀態(tài)，與共培養(yǎng)相比，無細胞方法具有免疫原性低、靶向性強、效率高及易于使用等優(yōu)勢[5]。這引起了人們對在組織工程及再生醫(yī)學(xué)中利用外泌體的興趣，其中定型細胞分泌的外泌體可以誘導(dǎo)或觸發(fā)增殖細胞的分化，為構(gòu)建替代療法打開了一條嶄新的通路?？紤]到磷脂雙分子層外泌體的良好生物相容性和免疫親和力等相關(guān)特性，可經(jīng)過特定修飾并將有效載荷傳遞至靶細胞，因此外泌體經(jīng)過改造后可以提供各種具有巨大治療潛力的有效載荷，如小干擾RNA、微小RNA(miRNA/miR)和小分子干擾RNA[36]。此外，外泌體作為“無細胞”療法的介質(zhì)，能夠避免干細胞直接移植療法的不良問題。但是，干細胞進入體內(nèi)的方式也是需要解決的問題，經(jīng)血循環(huán)注射干細胞后，其在體內(nèi)的遷移路徑和在各個器官中的分布難以追蹤，雖然干細胞經(jīng)血循環(huán)注入后表現(xiàn)出對創(chuàng)傷組織的“歸巢現(xiàn)象”，但其歸巢率往往較低，而未“歸巢”的干細胞在人體內(nèi)代謝的形式和歸宿尚不清楚[37]。外泌體作為細胞分泌介質(zhì)，其功能在很大程度上取決于親代細胞的功能，且目前任何干細胞和成體細胞都能夠?qū)崿F(xiàn)外泌體的大規(guī)模生產(chǎn)，因此對干細胞的定向誘導(dǎo)可能會改變目前傳統(tǒng)的細胞治療的模式，推進組織或器官替代治療的新進程，其代表了“無細胞”醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中的一種有前途的新方向，并可能為當(dāng)下所面臨的許多醫(yī)學(xué)難題提供解決思路。