1例輸入性HIV-1 G亞型毒株的檢出及基因組序列分析

杜 波，李 賀，羅周正，馬玉霞，劉文新，趙 地，吳 瑩，郭 勇，田曉東

HIV-1為反轉(zhuǎn)錄病毒屬正鏈RNA病毒，由于病毒復制過程缺少校對功能，具有高度變異性。HIV-1除少數(shù)為N組和O組外，大部分屬于M組，而M組又可分為9個亞型和102個重組亞型[1-2]。隨著基因測序技術的進步，越來越多的HIV基因組得到測序，這為分析HIV亞型、流行趨勢、分子溯源提供基礎數(shù)據(jù)，也對制定有效的艾滋病防治措施提供科學依據(jù)[3-5]。HIV-1亞型中，G亞型主要分布于西非和歐洲，其感染者只占全球感染者的4.6%；但G亞型出現(xiàn)時間較長，隨著病毒的變異和重組，G亞型與HIV-1其他亞型重組產(chǎn)生的重組亞型廣泛流行。例如，重組亞型CRF02_AG就是由HIV-1 A亞型和G亞型重組而成，CRF02_AG重組亞型感染者占全球感染者的7.7%[6]。

阜新地區(qū)流行的HIV-1毒株亞型呈現(xiàn)復雜趨勢。2009年以前，主要以B亞型感染為主；2009年以后，以CRF01_AE亞型感染居多，亞型種類包括B亞型、CRF07_BC亞型和CRF65_cpx亞型，但之前本地區(qū)未發(fā)現(xiàn)過G亞型。在2019年的艾滋病監(jiān)測中，首次監(jiān)測到本地區(qū)有1例輸入性HIV-1 G亞型感染者，本文對其體內(nèi)的HIV-1基因組進行序列測定和進化分析，為本病例病毒溯源提供依據(jù)，也為本地區(qū)HIV-1流行趨勢提供預測?，F(xiàn)報道如下。

1 對象與方法

1.1 對象 本病例來自阜新市衛(wèi)生健康服務中心（阜新市疾病預防控制中心）艾滋病監(jiān)測人群，為艾滋病WHO臨床分期I期的尼日利亞來華人員，血清樣本編號FX2019042，經(jīng)ELISA、膠體金篩查和免疫印跡確證試驗確認為HIV-1抗體陽性。在確?；颊咧橥獾那疤嵯?，采集患者血清2 ml，凍存于-70 ℃冰箱備用。

1.2 HIV-1 RNA提取 采用RNA病毒提取試劑盒QIAamp Viral RNA Mini Kit（QIAGEN公司，貨號52904）提取血清樣品中的HIV-1 RNA，具體操作嚴格按照說明書進行。提取的RNA凍存于-70 ℃冰箱備用。

1.3 HIV-1 RT-PCR擴增 由于樣本珍貴，先將病毒RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，再以cDNA為模板，進行兩輪PCR，最后進行測序。反轉(zhuǎn)錄反應按照試劑盒說明書進行。反應過程簡述如下。RT-PCR反應體系總體積50 μl，體系成分包括：1 μl反轉(zhuǎn)錄酶（0.5 U/μl）、25 μl 2× 緩沖溶液，10 μl模板RNA，5 μl隨機引物及 2 μl dNTP，用水補足至50 μl。反轉(zhuǎn)錄反應條件為 50 ℃溫育50 min，85 ℃5 min終止反應。用2×Taq PCR Master Mix試劑盒（日本TaKaRa公司）進行第一輪PCR擴增，其PCR產(chǎn)物為近似全長基因組，上游引物為UFA，下游引物為URB。PCR反應體系總體積50 μl，體系成分包括：25 μl 2×Taq PCR Master Mix混合液、2 μl cDNA 模板、2 μl上下游引物（10 μmol/L），用水補足至 50 μl。PCR反應條件如下：95 ℃ 10 min；95 ℃ 60 s，55 ℃ 60 s，70 ℃ 10 min，進行 40 個循環(huán)；終延伸72 ℃ 10 min。用2×Taq PCR Master Mix試劑盒（日本TaKaRa公司）進行第二輪巢式PCR擴增，反應體系和條件同第一輪PCR反應。所有引物序列見表1。

表1 RT-PCR 引物序列表Table 1 Sequence of RT-PCR primers

1.4 PCR產(chǎn)物的純化和測序 PCR產(chǎn)物進行1%瓊脂糖凝膠電泳，對目的條帶切膠回收，使用QIAGEN公司（德國）QIAquick Gel Extraction Kit對切膠產(chǎn)物進行純化，純化后的產(chǎn)物委托Invitrigen公司進行DNA測序。

1.5 序列分析 用Chromas軟件查看測序序列峰圖，序列編輯使用Sequencher 4.0軟件，最后用BioEdit 6.1軟件對序列進行拼接，基因位置的繪圖和分析采用HIV Sequence Locator軟件。從HIV Database （https://www.hiv.lanl.gov）下載HIV-1各亞型參考毒株基因組序列，使用MEGA 6.0軟件構建Neighbor-Joining系統(tǒng)進化樹，計算參數(shù)設定為Bootstrap值500次。在GenBank中下載所有G亞型基因組序列，利用NCBI BLAST在線比對G亞型各基因與本研究毒株各基因相似度。對獲得的基因組序列，使用RIP 3.0軟件進行基因重組分析，并將序列中env基因C2V3區(qū)序列應用Gene Cutter軟件搜索并翻譯為氨基酸序列。所得到的氨基酸序列使用Geno2pheno軟件進行輔助受體預測，輔助受體判定標準：假陽性率＜5%判定為病毒使用趨化性細胞因子受體4（chemokine cysteine-X-cysteine motif receptor 4,CXCR4）為輔助受體；5%～15%判定為趨化性細胞因子受體5（chemokine cysteinecysteine motif receptor 5,CCR5）/CXCR4雙嗜性輔助受體；＞15%判定為CCR5為輔助受體。

1.6 統(tǒng)計學處理 采用EpiData 3.1 軟件錄入數(shù)據(jù)，采用SPSS 23.0 軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析。計量資料以±s表示。

2 結 果

2.1 近似全長基因組分析 經(jīng)過測序，所獲得的7個片段經(jīng)拼接后，序列全長為8695 bp?；蚪M中，4種堿基分別為：3199A、1491C、2071G、1934T，嘌呤（A+G）占 60.6%（5270/8695），毒株符合反轉(zhuǎn)錄病毒基因組堿基組成特征，將此毒株編號為FX2019042。經(jīng)HIV Sequence Locator軟件分析，F(xiàn)X2019042 從 5′-3′分 別 為 gag、pol、vif、vpr、tat、vpu、env、rev和 nef共 9個基因，參照HIV-1標準毒株HXB2，F(xiàn)X2019042毒株的序列位置見圖1。

圖1 FX2019042毒株基因序列位置圖Figure 1 FX2019042 strain gene sequence location map

2.2 系統(tǒng)進化分析 在HIV Database中下載A～D、F～H、J～K各亞型及其常見重組亞型的參考株全長序列，使用Kimura2-parameter模型，繪制Neighbor-Joining系統(tǒng)進化樹（見圖2）。FX2019042毒株與G亞型參考株G.KE.1993.HH8793基因離散率為9.96%，并與其他G亞型參考株親緣關系相近，Bootstrap值為98%，提示該毒株為G亞型毒株。

圖2 FX2019042毒株與各亞型參考株全長序列進化分析★.FX2019042毒株Figure 2 Full-length sequence phylogenetic tree of FX2019042 and reference strains of each subtype

為了在分子生物學上進一步確定FX2019042毒株的來源，將GenBank中6株國內(nèi)G亞型毒株和17株國外G亞型毒株與FX2019042一起繪制進化樹。結果顯示，我國的G亞型呈散在分布，F(xiàn)X2019042毒株與尼日利亞流行株G.NG.1995.NG1937.AF069937親緣關系最近，基因離散率為8.95%（見圖3）。GenBank中G亞型HIV基因組序列共142條，將FX2019042毒株的3個結構基因和6個非結構基因序列分別與G亞型HIV基因組中各基因比對，獲得相似度分值，基因序列相似度比較結果見表2。結果顯示，F(xiàn)X2019042毒株發(fā)生變異最大的主要基因為結構基因env和非結構基因tat。

圖3 FX2019042毒株與G亞型參考株進化分析★.FX2019042毒株；●.與FX2019042毒株親緣關系最近的G亞型毒株；△.國外G亞型毒株；▲.國內(nèi)G亞型毒株Figure 3 Phylogenetic tree of FX2019042 strain and subtype G reference strain

表2 FX2019042毒株各基因與G亞型各基因序列相似度比較Table 2 Comparison of sequence similarity between each gene of FX2019042 strain and each gene of G subtype

2.3 基因重組分析 為了檢測FX2019042毒株基因組是否存在重組片段，我們使用在線軟件RIP3.0對FX2019042毒株進行重組分析，參數(shù)設置：windowsize=400，confidence threshold=90%，gapoption=3，multistate characters=yes。FX2019042毒株基因組序列重組分析結果見圖4。結果顯示，未發(fā)現(xiàn)FX2019042毒株基因組序列與HIV-1的A～D、F～H、J～K的9個亞型發(fā)生重組，提示該毒株為純粹的HIV-1 G亞型毒株。

圖4 FX2019042毒株基因重組分析X軸表示序列在移動的窗口中心的位置；Y軸表示與參考毒株相似程度Figure 4 Analysis of FX2019042 strain gene recombination

2.4 糖蛋白GP120分析 GP120的糖基化過程對于蛋白質(zhì)的折疊至關重要，在HIV感染人體T淋巴細胞過程中，GP120通過糖基化使病毒吸附于T淋巴細胞，而且HIV可以利用糖基來阻塞抗體表位而逃避人體免疫系統(tǒng)。含511個氨基酸的GP120中，V1～V5為可變區(qū)，C1～C5為恒定區(qū)。對FX2019042毒株的GP120的可變區(qū)和糖基化程度進行分析，結果顯示FX2019042毒株V3區(qū)有1個氨基酸缺失，在GP120區(qū)域共有25個糖基化位點，但其中8個位點因多糖空洞而導致糖基化位點缺失（見圖5）。在輔助受體方面，對V3區(qū)關鍵氨基酸的分析顯示，F(xiàn)X2019042毒株V3區(qū)氨基酸序列為CVRPNNNTRRSIHFGPGQA IYTTGIIGDIRQAHC，預測此毒株利用 CCR5作為輔助受體。

圖5 FX2019042毒株GP120糖基化位點預測黃色部分代表缺失的糖基化位點Figure 5 Prediction of GP120 glycosylation sites of FX2019042 strain

3 討 論

HIV-1 G亞型為古老的HIV-1亞型，在全球的流行分布極不平衡，主要集中在西非的尼日利亞和喀麥隆等地區(qū)。而G亞型與其他亞型重組形成的重組亞型則廣泛分布[6-7]，在我國常見的為CRF02_AG流行重組型，在世界范圍內(nèi)，雖然G亞型感染者只占全部HIV-1感染者的5.0%，但CRF02_AG感染者占全部HIV-1感染者的7.7%。在G亞型的發(fā)源地西非地區(qū)，67%的HIV-1感染者中能檢測到G亞型基因片段[7]，可見G亞型毒株極易與其他毒株發(fā)生重組并獲得傳播優(yōu)勢，需要加強對本地區(qū)的HIV流行株嚴密監(jiān)測，防止新型重組毒株的出現(xiàn)及流行。

我國發(fā)現(xiàn)的HIV-1 G亞型毒株較少，僅重慶、上海和廣西有相關報道[3，8-9]。我國在重慶市首次檢測到G亞型毒株[8]，根據(jù)HIV傳統(tǒng)分型基因env，鑒定為G亞型，但是由于只測序了env基因的686 bp，無法排除此毒株為CRF02_AG重組亞型的可能[3，9]。在2019年的艾滋病監(jiān)測中，本課題組發(fā)現(xiàn)了1例HIV-1 G亞型毒株，對其進行基因組測序，RIP 3.0軟件分析顯示FX2019042為純G亞型，構建的系統(tǒng)進化樹顯示FX2019042毒株與尼日利亞毒株親緣關系最近，與在廣西等地發(fā)現(xiàn)的G亞型毒株親緣關系較近[3，10]，但與上海分離株sh52親緣關系較遠，推測FX2019042毒株為境外輸入型毒株。

HIV-1感染人體細胞除了需要與CD4+T淋巴細胞受體結合外，還需要env基因編碼的輔助受體CCR5和CXCR4[1，11-12]。這兩種受體為HIV-1進入人體細胞的主要輔助受體，在艾滋病不同時期HIV-1使用的輔助受體不同，在HIV-1感染早期，體內(nèi)病毒準種常以CCR5為輔助受體，隨著病情進展，病毒利用的輔助受體向CXCR4過渡，在感染晚期則利用CXCR4輔助受體[1，3-15]。由于GP120的糖基化過程對于HIV-1感染細胞至關重要，而且HIV可以利用糖基來阻塞抗體表位而逃避機體免疫功能[12，15]，所以本研究在基因序列分析基礎上，對FX2019042毒株的GP120可變區(qū)和糖基化程度進行分析，結果顯示，F(xiàn)X2019042毒株準種進入CD4+T淋巴細胞時利用的輔助受體為CCR5，這與該患者病程為艾滋病發(fā)病早期相符。

綜上，本研究對艾滋病監(jiān)測獲得的HIV-1 G亞型近似全長基因組序列進行研究，從分子流行病學角度證實該毒株為境外輸入型毒株，這與該感染者流行病學史相符。此毒株序列的測定和分析對于本地區(qū)HIV流行趨勢和HIV毒株多樣性研究均具有重要意義，提示我們需加強艾滋病監(jiān)測，防止境外毒株與本地毒株發(fā)生重組和流行。