腦型瘧小鼠小膠質(zhì)細胞的活化特征分析

沈 燕，李英輝，王 軍，梁 姣，黃豫曉，朱卿昊，吳興安，趙 亞

腦型瘧是非洲等惡性瘧流行區(qū)兒童以及我國輸入性瘧疾病例死亡的常見原因[1-2]，其發(fā)病機制與免疫細胞在腦部聚集引起中樞神經(jīng)系統(tǒng)（central nervous system,CNS）炎癥性病理損傷密切相關(guān)[3-4]。研究發(fā)現(xiàn)，小膠質(zhì)細胞是一類組織定居巨噬細胞，其活化方式直接決定其神經(jīng)保護/損傷作用[5-7]。目前研究認為，小膠質(zhì)細胞是單核細胞在胚胎發(fā)育早期遷入腦內(nèi)分化而成的巨噬細胞，因其形態(tài)或表面標志物缺乏特異性，所以難以將其與外周巨噬細胞有效區(qū)分[8-10]。本研究擬根據(jù)小膠質(zhì)細胞CNS定居的特點，結(jié)合實驗型腦型瘧（experimental cerebral malaria,ECM）小鼠病程動態(tài)變化規(guī)律，利用血腦屏障（blood brain barrier,BBB）作用從空間上將小膠質(zhì)細胞和外周巨噬細胞區(qū)分，通過ECM小鼠炎性相關(guān)分子表達量改變篩選活化標志物；通過比較感染后不同時間點腦內(nèi)小膠質(zhì)細胞的表達譜，尋找腦型瘧小膠質(zhì)細胞活化的分子標志，為研究小膠質(zhì)細胞在腦型瘧顱內(nèi)炎癥反應(yīng)中的作用提供新的思路和方法。

1 材料與方法

1.1 材料 伯氏瘧原蟲ANKA株（Plasmodium berghei ANKA strain,PbA）為本實驗室保存蟲種。C57BL/6小鼠購于空軍軍醫(yī)大學實驗動物中心。伊文思蘭（Evans blue,EB）試劑和Giemsa染液購于碧云天生物技術(shù)公司。甲酰胺試劑購于默克公司。RPMI1640培養(yǎng)基購于Hyclone公司。RNA提取試劑RNAiso Plus、反轉(zhuǎn)錄試劑盒PrimeScript RT Master Mix kit和實時熒光定量PCR（real time quantitative PCR,RT-qPCR）熒光試劑購于TaKaRa公司。Percoll試劑購于GE公司。流式抗體FITC標記的CD11b和PE標記的CD45購于達科為生物技術(shù)公司。熒光染色抗體CD45、BrdU、IBA-1分別購于Abcam公司、CST公司和賽維爾生物科技公司。Cy2標記的綿羊抗小鼠IgG、羅丹明紅標記的山羊抗兔IgG購于Jackson公司。熒光抗淬滅劑購于Invitrigen公司。

1.2 ECM小鼠模型 ECM模型為經(jīng)典的PbA感染C57BL/6小鼠。原蟲感染率經(jīng)由鼠尾取血、薄血膜涂片、Giemsa染色后計數(shù)確定。根據(jù)紅細胞計數(shù)和原蟲感染率計算受感染的紅細胞（infected RBCs,iRBCs）數(shù)量。不同感染時間點分別選取3只4～6周齡C57BL/6雄性小鼠，體質(zhì)量16～18 g，每只小鼠經(jīng)腹腔注射5×106個iRBCs。

1.3 mRNA提取和RT-qPCR檢測 小鼠麻醉后固定，生理鹽水經(jīng)心臟灌注，取腦組織，機械剝離嗅球、大腦、小腦、腦干和延髓各區(qū)。各腦區(qū)組織的RNA提取和反轉(zhuǎn)錄分別使用RNAiso Plus法和PrimeScript RT Master Mix kit法。擴增引物由上海生工技術(shù)服務(wù)有限公司合成，其序列如表1所示，其中β-actin為內(nèi)參。RT-qPCR檢測使用2步法擴增，結(jié)果分析采用delta-delta CT法。

表1 基因引物序列Table 1 Genetic primer sequences

1.4 BBB通透性檢測 采用EB滲出法檢測BBB完整性，小鼠經(jīng)腹腔注射100 μl 1% EB/PBS緩沖液，12 h后，小鼠經(jīng)麻醉、心臟灌注后取腦組織，稱重；每克腦組織加入1 ml甲酰胺溶液，37 ℃水浴孵育過夜。取孵育液上清200 μl，使用酶標儀（伯樂公司）于620 nm處測量吸光度，根據(jù)標準曲線計算EB濃度，以每克腦組織含EB量（μg）表示。

1.5 小膠質(zhì)細胞提取 根據(jù)Garcia等[11]報道的方法提取腦組織小膠質(zhì)細胞，小鼠經(jīng)麻醉、心臟灌注后取全腦組織；將腦組織置于冰上，研磨后加入2 ml RPMI1640培養(yǎng)基，用5 ml注射器反復抽吸使腦組織呈勻漿狀，加入5 ml RPMI1640培養(yǎng)基和3 ml Percoll溶液輕柔混勻；將30% Percoll/細胞懸液沿管壁小心加入含有2 ml 70% Percoll/Hank's平衡鹽緩沖液（Hank's balanced salt solution,HBSS）的15 ml EP管內(nèi)，保持液面分層；低溫550×g離心30 min；用巴氏吸管收集液層分界處細胞，用8 ml HBSS洗滌。4 ℃ 900×g離心7 min，棄上清；用含1% BSA的FACS緩沖液重懸細胞，4 ℃保存待用；每個腦組織可獲得細胞總數(shù)約為（1～5）×104個。

1.6 細胞染色及流式細胞檢測 將流式抗體FITC標記的CD11b和/或PE標記的CD45加入細胞懸液，4 ℃避光孵育20 min，PBS洗滌后用40 μl FACS緩沖液重懸，采用流式細胞儀（BD公司）進行檢測分析，其中裸細胞組和單染色對照組調(diào)整補償，每個樣本檢測不少于104個細胞。

1.7 腦組織切片間接免疫熒光和HE染色 小鼠經(jīng)麻醉灌注后取腦組織，4%多聚甲醛固定過夜；經(jīng)脫水、透明、包埋后切片。熒光染色切片依次經(jīng)過二甲苯、梯度酒精再水化、抗原修復、封閉；一抗4 ℃孵育過夜；洗滌后，二抗孵育1 h，抗淬滅劑封片。HE染色切片依次經(jīng)過二甲苯、梯度酒精再水化、HE染色、脫水封片。顯微鏡下采集圖像。

1.8 統(tǒng)計學處理 采用GraphPad Prism軟件處理和分析數(shù)據(jù)。2組間比較用成組t檢驗（各組計量數(shù)據(jù)均呈正態(tài)分布，組間方差齊），P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié) 果

2.1 ECM小鼠腦內(nèi)炎癥水平 不同腦區(qū)的腦組織mRNA轉(zhuǎn)錄水平檢測表明，與未感染小鼠相比，PbA感染小鼠后第5 d，TNF-α在大腦內(nèi)的mRNA轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)7.65倍（t=6.034，P=0.009）；同時，IL-6在嗅球內(nèi)的mRNA轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)4.54倍（t=3.361，P=0.044）。Fizz1在小腦內(nèi)的mRNA轉(zhuǎn)錄水平分別于感染后第3 d和第5 d下調(diào)85.12%（t=12.175，P=0.001）和93.44%（t=72.322，P=0.000），在腦干和延髓分別下調(diào)54.39%（t=3.908，P=0.030）和83.99%（t=14.326，P=0.000）（圖1）。

圖1 ECM小鼠腦內(nèi)炎癥因子mRNA水平A～C 縱坐標數(shù)字均為以2為底的對數(shù)；A.不同感染時間點，各腦區(qū)TNF-α的mRNA轉(zhuǎn)錄水平；B.不同感染時間點，各腦區(qū)IL-6的mRNA轉(zhuǎn)錄水平；C.不同感染時間點，各腦區(qū)Fizz1的mRNA轉(zhuǎn)錄水平；＊.P＜0.05；＊＊.P＜0.01；＊＊＊.P＜0.001Figure 1 mRNA levels of inflammatory cytokines in the brain of ECM mice

2.2 ECM小鼠腦內(nèi)小膠質(zhì)細胞水平 流式細胞技術(shù)對腦內(nèi)提取小膠質(zhì)細胞的檢測結(jié)果表明，與未感染小鼠相比，PbA感染小鼠后第5 d，CD11b+細胞的占比和數(shù)量分別上調(diào)8.02倍（t=3.818，P=0.012）和9.07倍（t=3.851，P=0.012）；感染后第6 d，分別上調(diào)4.36倍（t=5.412，P=0.003）和4.51倍（t=6.161，P=0.002）；感染后第7 d，分別上調(diào)3.41倍（t=2.867，P=0.035）和6.87倍（t=2.734，P=0.034）（圖2A、2B）。通過間接免疫熒光染色對小鼠腦組織切片檢測發(fā)現(xiàn)，PbA感染后第5 d的大腦內(nèi)可見IBA-1+細胞（圖2C）。

圖2 ECM小鼠腦內(nèi)小膠質(zhì)細胞檢測A.不同感染時間點，小膠質(zhì)細胞中CD11b+細胞比例，縱坐標數(shù)字為以2為底的對數(shù)；B.不同感染時間點，小膠質(zhì)細胞中CD11b+細胞數(shù)量，縱坐標數(shù)字為以10為底的對數(shù)；C.PbA感染后第5 d，間接免疫熒光法檢測腦內(nèi)表達IBA-1的細胞（星號）；Cy2.綠色熒光染料；DAPI.藍色細胞核染料；Merge.Cy2 染料和DAPI 染料的融合；＊.P＜0.05；＊＊.P＜0.01Figure 2 Detection of microglia in brain of ECM mice

2.3 ECM小鼠 BBB開放時間 利用EB滲出法對BBB通透性的檢測發(fā)現(xiàn)，與未感染小鼠相比，PbA感染小鼠后第6 d和第7 d，每克腦組織溶出的EB量分別上調(diào)4.30倍（t=94.727，P=0.021）和4.54倍（t=109.507，P=0.018）（圖3A）。PbA感染小鼠后第7 d，可見EB在腦內(nèi)大量浸出，全腦呈現(xiàn)藍色，而未感染小鼠全腦未見EB浸出，也未呈藍色（圖3B）。通過HE染色對小鼠腦組織切片檢測發(fā)現(xiàn)，PbA感染后第7 d，腦內(nèi)可見散在出血點以及浸潤的RBC（圖3C）。

圖3 ECM小鼠BBB開放時間A.不同感染時間點，腦內(nèi)EB浸出量；B.PbA感染后第7 d，腦組織EB滲出圖；C.PbA感染后第7 d，腦組織切片HE染色圖；＊.P＜0.05Figure 3 BBB opening time in ECM mice

2.4 腦內(nèi)巨噬細胞相關(guān)因子水平 腦組織mRNA轉(zhuǎn)錄水平檢測結(jié)果表明，與未感染小鼠相比，PbA感染小鼠后第5 d，CD45的mRNA轉(zhuǎn)錄水平在大腦（t=4.672，P=0.019）、小腦（t=10.485，P=0.002）、腦干和延髓（t=4.232，P=0.024）均上調(diào)（圖4A）；同時，CCR2的mRNA轉(zhuǎn)錄水平在大腦（t=17.519，P=0.000）、小腦（t=3.780，P=0.032）上調(diào)（圖4B），CCL2（CCR2的配體）的mRNA轉(zhuǎn)錄水平在小腦（t=11.239，P=0.002）、腦干和延髓（t=5.164，P=0.014）、嗅球（t=4.519，P=0.020）均上調(diào)（圖4C）。但小膠質(zhì)細胞標志物 TMEM119[12]、P2Y12[13]、Siglec-H[14]的 mRNA轉(zhuǎn)錄水平變化差異均無統(tǒng)計學意義（結(jié)果未展示）。流式細胞技術(shù)對小膠質(zhì)細胞的檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與未感染小鼠相比，CD45+細胞占比分別在感染后第5 d（t=4.042，P=0.009）、第6 d（t=7.147，P=0.000）和第 7 d（t=2.504，P=0.046）上調(diào)（圖4D），同時CD45+細胞數(shù)量分別在感染后第5 d（t=4.016，P=0.010）、第6 d（t=6.900，P=0.000）、第7 d（t=2.780，P=0.032）增多（圖4E）。通過間接免疫熒光染色對小鼠腦組織切片檢測發(fā)現(xiàn)，PbA感染后第7 d，腦內(nèi)可見IBA-1與CD45共表達細胞（圖4F）。

圖4 ECM小鼠腦內(nèi)巨噬細胞相關(guān)因子的檢測A.不同感染時間點，各腦區(qū)CD45的mRNA轉(zhuǎn)錄水平；B.不同感染時間點，各腦區(qū)CCR2的mRNA轉(zhuǎn)錄水平；C.不同感染時間點，各腦區(qū)CCL2的mRNA轉(zhuǎn)錄水平，縱坐標數(shù)字為以2為底的對數(shù)；D.不同感染時間點，CD45+細胞比例，縱坐標數(shù)字為以2為底的對數(shù)；E.不同感染時間點，CD45+細胞數(shù)量，縱坐標數(shù)字為以10為底的對數(shù)；F.PbA感染后第7 d，間接免疫熒光法檢測腦內(nèi)IBA-1和CD45共表達的細胞（星號）；Cy2.綠色熒光染料標記IBA-1；羅丹明紅.紅色熒光染料標記CD45；DAPI.藍色細胞核染料；Merge.Cy2、羅丹明紅和DAPI 染料的融合；＊.P＜0.05；＊＊.P＜0.01；＊＊＊.P＜0.001Figure 4 Detection of macrophage related factors in brain of ECM mice

2.5 CD45表達量與小膠質(zhì)細胞活化的相關(guān)性 對流式細胞技術(shù)檢測結(jié)果的進一步分析發(fā)現(xiàn)，CD11b+細胞根據(jù)CD45表達量的不同可分為兩群：CD11b+CD45high和CD11b+CD45int，與未感染小鼠相比，CD11b+CD45int亞群細胞數(shù)在感染后第 5 d（t=5.822，P=0.002） 和 第 7 d（t=3.492，P=0.013）增多；CD11b+CD45high亞群細胞數(shù)目分別在感染后第5 d（t=2.689，P=0.043）和第6 d（t=4.683，P=0.005）增多（圖5A）。不同的是，CD11b+CD45high的細胞占比在感染后第5 d（t=3.330，P=0.021） 下 調(diào) 而 第 7 d（t=2.674，P=0.037）上調(diào)，CD11b+CD45int的細胞占比在感染后第5 d（t=3.850，P=0.012）上調(diào)而第7 d（t=2.696，P=0.036）下調(diào)（圖5B）。免疫熒光染色對小鼠腦組織切片檢測發(fā)現(xiàn)，可觀察到CD45和BrdU雙陽性細胞，并且可見iRBCs（圖5C）。

圖5 CD45表達量與小膠質(zhì)細胞活化的相關(guān)性A.不同感染時間點，小膠質(zhì)細胞中CD11b+CD45high和CD11b+CD45int的細胞數(shù)量，縱坐標數(shù)字為以10為底的對數(shù)；B.不同感染時間點，CD11b+CD45high和CD11b+CD45int的細胞比例；C.PbA感染后第5 d，間接免疫熒光法檢測腦內(nèi)CD45和BrdU雙陽性細胞（星號）；Cy2.綠色熒光染料標記BrdU；羅丹明紅.紅色熒光染料標記CD45；DAPI.藍色細胞核染料；Merge.Cy2、羅丹明紅和DAPI 染料的融合；iRBC（箭頭所指）；＊.P＜0.05；＊＊.P＜0.01Figure 5 Correlation between CD45 expression level and activation of microglia cells

3 討 論

小膠質(zhì)細胞是在腦組織定居的一類巨噬細胞，在多發(fā)硬化癥等神經(jīng)系統(tǒng)疾病中，參與炎癥發(fā)生、脫髓鞘、神經(jīng)細胞損傷等病理過程[15]，但其在腦型瘧神經(jīng)病理損傷中的作用至今尚未闡明。多數(shù)研究利用IBA-1作為小膠質(zhì)細胞標志物[16]，當BBB保持完整時腦內(nèi)IBA-1陽性細胞可認為是小膠質(zhì)細胞，然而一旦BBB開放IBA-1就難以區(qū)別小膠質(zhì)細胞和外周巨噬細胞。研究表明，腦型瘧的發(fā)生與BBB損傷密切相關(guān)，瘧原蟲特異性CD8+T細胞通過ECM的病理過程可遷移到腦血管，進而殺傷內(nèi)皮細胞[17]，啟動BBB外側(cè)炎癥損傷；而在BBB內(nèi)側(cè)，小膠質(zhì)細胞則可能是發(fā)揮主要作用的炎性細胞?；谀X型瘧B(tài)BB開放這一重要病理變化，本研究利用BBB物理區(qū)隔小膠質(zhì)細胞和外周巨噬細胞，為研究小膠質(zhì)細胞在腦型瘧中的作用提供可行的思路。

本研究發(fā)現(xiàn)，PbA感染后第5 d，促炎因子TNF-α和IL-6的轉(zhuǎn)錄水平在不同腦區(qū)發(fā)生一定程度上調(diào)，而抑炎因子Fizz1的轉(zhuǎn)錄水平則下調(diào)。EB滲出實驗證實，BBB 顯著開放出現(xiàn)在PbA感染后第6 d，說明腦內(nèi)炎癥水平在BBB開放前已經(jīng)發(fā)生改變。此外，小膠質(zhì)細胞是腦內(nèi)僅有且數(shù)量豐富的固有免疫細胞，極有可能通過發(fā)揮巨噬細胞炎性功能參與腦內(nèi)炎癥發(fā)生。感染后不同時間點提取腦內(nèi)小膠質(zhì)細胞分析結(jié)果也表明，與未感染小鼠相比，CD11b+細胞比例和數(shù)量均顯著上調(diào)，提示小膠質(zhì)細胞確實參與腦型瘧發(fā)生。此外，本研究對已報道的小膠質(zhì)細胞標志物腦內(nèi)轉(zhuǎn)錄水平的檢測也提示，不同神經(jīng)系統(tǒng)疾病模型中小膠質(zhì)細胞的表達標志物可能存在差異，與相關(guān)研究結(jié)果一致[18-19]。

本研究對巨噬細胞標志分子CD45、巨噬細胞M1型活化相關(guān)因子CCR2及配體CCL2進行了檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)感染后第5 d，上述這些分子轉(zhuǎn)錄水平有一定程度上調(diào)，提示PbA感染可觸發(fā)小膠質(zhì)細胞的活化。流式細胞技術(shù)分析也證實，感染后第5、6、7 d，小膠質(zhì)細胞中的CD45+細胞比例和數(shù)量均顯著上調(diào)，提示CD45可能與小膠質(zhì)細胞的活化相關(guān)。進一步分析發(fā)現(xiàn)，腦內(nèi)CD11b+細胞可根據(jù)CD45表達量差異分為CD11b+CD45high和CD11b+CD45int兩群，且在BBB明顯開放前即PbA感染后第5 d，兩群細胞的數(shù)目均顯著增多，提示靜息態(tài)和活化態(tài)小膠質(zhì)細胞數(shù)目均隨感染上調(diào)。以往研究認為小膠質(zhì)細胞CD45的表達水平低于外周巨噬細胞[20]，但近期研究也發(fā)現(xiàn)，小膠質(zhì)細胞活化后CD45表達上調(diào)[21]。本研究發(fā)現(xiàn)CD11b+CD45high細胞亞群占比在感染后第5 d下調(diào)而第7 d上調(diào)，與此同時CD11b+CD45int細胞亞群占比則發(fā)生相反的變化，提示隨著感染進程持續(xù)小膠質(zhì)細胞逐漸由靜息態(tài)向活化態(tài)轉(zhuǎn)變，其CD45的表達量隨之上調(diào)，進一步說明CD45的表達很可能與小膠質(zhì)細胞的活化相關(guān)。部分研究顯示，腦缺血模型中腦損傷區(qū)域的小膠質(zhì)細胞可通過快速增殖加重炎癥反應(yīng)[22]，本研究通過BrdU免疫熒光染色也可見到小膠質(zhì)細胞增殖的現(xiàn)象。

值的注意的是，EB作為偶氮染料，可隨血漿白蛋白從BBB開放區(qū)進入腦實質(zhì)區(qū)，因此，EB滲出時已是BBB內(nèi)皮細胞緊密連接被完全破壞的階段。然而，在BBB紊亂的較早期且內(nèi)皮細胞緊密連接完全破壞之前，EB是不能進入腦內(nèi)的，此時是否存在巨噬細胞主動穿越BBB的可能尚不能確定。

綜上所述，小膠質(zhì)細胞參與了腦型瘧腦部炎癥反應(yīng)，且通過BBB天然屏障作用與外周巨噬細胞物理區(qū)隔，在BBB開放前腦內(nèi)炎癥水平上調(diào)，小膠質(zhì)細胞活化與上調(diào)CD45表達量相關(guān)，以上結(jié)果將為深入研究小膠質(zhì)細胞在腦型瘧CNS病理損傷的作用提供更多的研究思路。