結(jié)核性腦膜炎腦脊液分子檢測技術(shù)概述

韓利軍 趙雪瑤

結(jié)核性腦膜炎(tuberculous meningitis，TBM)是最常見的中樞神經(jīng)系統(tǒng)結(jié)核病，由于無特異的臨床表現(xiàn)及較低的實驗室診斷敏感度，早期診斷TBM非常困難；而診斷不及時會延誤抗結(jié)核治療的時機，導致高病死率和高致殘率[1]。因此，尋求切實有效的腦脊液檢測手段，提高TBM的早期診斷率顯得尤為重要。

近幾年隨著分子檢測技術(shù)的快速發(fā)展，尤其是測序技術(shù)的問世，為TBM早期診斷帶來了可能。筆者針對TBM腦脊液分子檢測技術(shù)的應用現(xiàn)狀、最新研究進展進行綜述及評論，為指導結(jié)核病臨床工作提供參考。

一、結(jié)核性腦膜炎腦脊液分子檢測技術(shù)的應用現(xiàn)狀

結(jié)核性腦膜炎分子檢測技術(shù)是以臨床標本(腦脊液)為檢測對象，結(jié)核分枝桿菌特異基因為檢測標志物，完成對標本中是否含有結(jié)核分枝桿菌特異基因的一系列檢測過程[2]。結(jié)核分枝桿菌核酸擴增技術(shù)(nucleic acid amplification test，NAAT)問世已有30余年，通常以IS6110、MPB64、gyrB、rpoB等為靶標，通過聚合酶鏈反應(polymerase chain reaction，PCR)進行擴增和檢測。近年來，結(jié)核分枝桿菌的分子檢測技術(shù)不斷推陳出新[3]，目前臨床使用的方法有熒光定量PCR技術(shù)，如實時熒光定量PCR技術(shù)、GeneXpert MTB/RIF(簡稱“GeneXpert”)；等溫(恒溫)擴增技術(shù)，如環(huán)介導等溫擴增技術(shù)(loop-mediated isothermal amplification，LAMP)、交叉引物恒溫擴增技術(shù)(CPA)、實時熒光核酸恒溫擴增檢測技術(shù)(SAT)；探針-反向雜交技術(shù)，如線性探針技術(shù)、基因芯片法；熔解曲線技術(shù)，如探針熔解曲線技術(shù)。

1. GeneXpert：GeneXpert是由美國Cepheid公司開發(fā)的全自動一體化實時定量半巢式PCR，通過檢測ropB基因來檢測結(jié)核分枝桿菌及利福平耐藥性[4]。研究顯示，對于結(jié)核病患者的腦脊液，GeneXpert檢測的敏感度為23%～52%；對于結(jié)核病并發(fā)HIV感染者的腦脊液，GeneXpert檢測的敏感度為62%，特異度為87.5%～98%[5-12]；如果對腦脊液樣本進行離心，或提高樣本量至6 ml以上，均可提高檢測的敏感度[7-9]。對于有TBM癥狀體征的成人和兒童的腦脊液樣本，WHO[13]對GeneXpert檢測的推薦優(yōu)先于涂片鏡檢和(或)培養(yǎng)。但在目前的臨床工作中，由于腦脊液含菌量低及早期抗結(jié)核治療藥品的應用，降低了GeneXpert在TBM診斷中的敏感度[1, 14]。

2. GeneXpert MTB/RIF Ultra：GeneXpert MTB/RIF Ultra是在GeneXpert基礎(chǔ)上開發(fā)的新的檢測方法，其檢測包含2個不同的靶點(IS6110和IS1081)，并擁有比GeneXpert更大的DNA反應室(GeneXpert MTB/RIF Ultra中50 μl的PCR反應與GeneXpert中25 μl的PCR反應)。GeneXpert MTB/RIF Ultra還集成了全套核酸擴增和更快速的熱循環(huán)，這促使其檢測下限達到16 菌落形成單位(CFU)/ml，而GeneXpert為114 CFU/ml[13]。WHO[13]推薦，GeneXpert MTB/RIF Ultra用于腦脊液樣本檢測，可作為TBM的初始診斷，其可靠性更高。Kohli等[15]對6項關(guān)于GeneXpert MTB/RIF Ultra的研究(包含475例參與者)進行綜述，指出GeneXpert MTB/RIF Ultra用于腦脊液檢測的敏感度為89.4%，特異度為91.2%；而對于HIV感染人群，GeneXpert MTB/RIF Ultra檢測的敏感度為95%，特異度為100%[9]。由此可見，GeneXpert MTB/RIF Ultra檢測的敏感度較GeneXpert有所提高，但由于目前相關(guān)研究較少，還需大樣本的臨床觀察來確認。同時，GeneXpert MTB/RIF Ultra的陰性預測值為84%(應≥99%)，對于TBM診斷仍存在局限性，且對腦脊液所需的量更大(理想情況下為8～10 ml)，雖然其檢測閾值低，但部分患者大量引流腦脊液后容易出現(xiàn)低顱壓綜合征，因此在常規(guī)開展此項檢查的過程中，會導致其敏感度降低。

3. LAMP：LAMP在等溫條件下使用了具有鏈置換作用的BstDNA聚合酶，在6段特異靶核酸序列中設(shè)計4個引物序列進行擴增。LAMP的優(yōu)點是不需要復雜的儀器，并且具有與痰涂片鏡檢相似的生物安全性[13]。一些研究顯示，應用IS6110、MPB64作為LAMP的靶點檢測腦脊液，敏感度為43.2%～82%，特異度為80%～100%；若采用多靶點聯(lián)合檢測，敏感度可達88%[16-20]；劉威等[21]研究顯示，用腦脊液標本檢測結(jié)核分枝桿菌LAMP比熒光定量PCR的敏感度要高10倍[17]。LAMP也是WHO推薦的用于TBM的臨床檢測技術(shù)，但LAMP擴增的高效會產(chǎn)生非特異性擴增，存在一定的假陽性率[16]。

4. 探針熔解曲線技術(shù)：探針熔解曲線技術(shù)是通過檢測特異性擴增產(chǎn)物與探針形成雙鏈的解鏈溫度，比較突變序列和野生型序列的溫度差異獲得靶基因序列信息[22]。其既可檢測到結(jié)核分枝桿菌復合群，還可實現(xiàn)結(jié)核分枝桿菌對異煙肼、利福平、乙胺丁醇及氟喹諾酮類藥品的耐藥突變檢測。目前該技術(shù)已廣泛應用于痰液的檢測，而關(guān)于腦脊液檢測的相關(guān)數(shù)據(jù)較少。吳劍等[23]的研究顯示，在170例腦脊液標本中，探針熔解曲線技術(shù)的陽性檢出率與BACTAC MGIT 960快速培養(yǎng)法一致。探針熔解曲線技術(shù)多用于呼吸道標本的檢測，對腦脊液標本的研究相對較少，但該方法能為TBM患者快速提供耐多藥和廣泛耐藥的相關(guān)信息。

5. 線性探針技術(shù)：線性探針技術(shù)是利用生物素標記的引物特異擴增PCR產(chǎn)物，擴增產(chǎn)物與固定在尼龍膜上的特異寡核苷酸探針雜交，通過酶聯(lián)免疫顯色法顯示結(jié)果，既能檢測結(jié)核分枝桿菌也能檢測其耐藥性[3]。線性探針技術(shù)已經(jīng)發(fā)展了2代，第一代可檢測結(jié)核分枝桿菌及異煙肼、利福平耐藥性，第二代在第一代的基礎(chǔ)上還可檢測氟喹諾酮類及二線注射類藥品的耐藥性[13]。WHO[13]推薦線性探針技術(shù)用于檢測痰樣本中的結(jié)核分枝桿菌和對氟喹諾酮類藥品的耐藥性，其他呼吸道樣本(如支氣管肺泡灌洗液和胃液)或肺外樣本(組織樣本、腦脊液或其他體液)尚未得到充分評估。Kaviyil和Ravikumar[24]的研究顯示，腦脊液樣本線性探針技術(shù)檢測結(jié)核分枝桿菌的敏感度為96.15%，特異度為100.00%。而在印度的一項對238例疑似TBM患者的研究中，應用線性探針技術(shù)對腦脊液中的結(jié)核分枝桿菌進行檢測，在通過微生物學確診的TBM患者中，檢測陽性率僅為55%[25]。雖然線性探針技術(shù)已廣泛應用于痰液樣本的檢測，但對于腦脊液檢測相關(guān)數(shù)據(jù)較少，這也可能是出現(xiàn)此類矛盾結(jié)果的原因。由于線性探針技術(shù)操作復雜，且對實驗室環(huán)境要求較高，在其他分子檢測技術(shù)蓬勃發(fā)展的今天，可能是限制其在TBM診斷中應用的原因。因此，對于線性探針技術(shù)在TBM診斷中的作用，仍需大樣本的臨床觀察來確認。

表1 腦脊液分子檢測方法的比較

腦脊液分子檢測方法的比較見表1。目前，對腦脊液分子檢測技術(shù)的研究，仍首先推薦GeneXpert技術(shù)，雖然其敏感度不及線性探針技術(shù)，但由于其在檢測結(jié)核分枝桿菌的同時可進行利福平耐藥性的檢測，可在2 h內(nèi)報告檢測結(jié)果，且目前在TBM檢測中應用較廣，相關(guān)數(shù)據(jù)較為可靠，因此仍作為首選的檢測方法。而在檢測技術(shù)欠發(fā)達的地區(qū)，可首選LAMP檢測技術(shù)，雖然目前對于腦脊液的LAMP檢測數(shù)據(jù)不及GeneXpert完善，但由于其操作簡單，對實驗室及操作人員要求較低，檢測時間僅需1 h，因此較適合在基層開展。對于復治TBM或高度懷疑耐藥的患者，可在進行GeneXpert檢測的基礎(chǔ)上，聯(lián)合線性探針技術(shù)或熔解曲線技術(shù)進行檢測，以縮短耐藥檢測時間，早期進行治療。而由于腦脊液標本量的限制，首次腰椎穿刺留取腦脊液，應在滿足常規(guī)及生化、細胞學檢測的基礎(chǔ)上，首先進行GeneXpert及結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)的檢查，若條件允許，可繼續(xù)留取標本進行其他分子檢測，以提高檢測敏感度。

二、結(jié)核性腦膜炎腦脊液分子檢測技術(shù)最新研究

1.宏基因組測序技術(shù)(mNGS)：mNGS是利用基因測序原理，檢測樣本中已存在的所有脫氧核糖核酸(DNA)或核糖核酸(RNA)信息，進而得到患者樣本中致病微生物的信息[26]。目前，mNGS技術(shù)已廣泛應用于臨床，在既往的多項研究中指出，mNGS對病毒、真菌、細菌、寄生蟲的檢測，均取得了較好的成果，而對于罕見患者的病原學檢測，也取得了一定的成果[27-29]。近年來，已有越來越多的研究將mNGS應用于TBM的初始診斷。Wang等[30]的研究顯示，對23例結(jié)核性腦膜炎患者進行腦脊液病原學檢測，mNGS方法檢測出18例，檢出率為78.26%，結(jié)合傳統(tǒng)方法可以使檢出率提高至95.65%。Xing等[31]的研究指出，mNGS檢測TBM的敏感度高達84.44%，隨后依次為GeneXpert(40%)、PCR(24.44%)、培養(yǎng)(22.22%)和涂片(0%)。但mNGS用于TBM檢測研究的數(shù)據(jù)較少，尚需做進一步的深入研究。

2.Truenat MTB：Truenat MTB是一種基于芯片的NAAT，可使用實時微PCR技術(shù)檢測結(jié)核分枝桿菌核酸，并進行利福平耐藥性檢測。首先使用Trueprep-MAG(一種基于納米技術(shù)設(shè)備，可用電池驅(qū)動)進行痰液的處理，然后在Truelab-UNOTM分析儀(手持式電池驅(qū)動的熱循環(huán)儀)上進行PCR擴增、分析報告結(jié)果[13, 32]。該方法目前僅應用于痰液的結(jié)核分枝桿菌檢測，對于腦脊液的檢測無相關(guān)研究數(shù)據(jù)。

3.數(shù)字聚合酶鏈反應技術(shù)(dPCR)：dPCR是繼終點PCR和實時PCR之后的第三代PCR技術(shù)，是一種無校正曲線的定量方法，可以絕對定量低豐度的結(jié)核分枝桿菌核酸。Li等[33]應用此技術(shù)，檢測腦脊液結(jié)核分枝桿菌核酸IS6110診斷TBM，其敏感度為57.4%，特異度為97.0%，敏感度明顯高于GeneXpert、實時熒光定量PCR、分枝桿菌培養(yǎng)和涂片檢測。但數(shù)字PCR 檢測TBM研究數(shù)據(jù)較少，還需進一步的深入研究。

4.其他技術(shù)：通過不同的標本處理方法提高分子檢測技術(shù)的敏感度，也是目前研究的熱點。Park等[34]采用同型雙功能亞氨酸酯和微流控平臺富集腦脊液中的結(jié)核分枝桿菌，然后再進行實時熒光定量PCR檢測，可明顯提高檢測陽性率。

目前，新的分子檢測技術(shù)主要通過改進標本處理方法及檢測技術(shù)提高檢測的敏感度。首先，腦脊液為體液樣本，主要問題是含菌量較低、目的基因擴增量少和DNA提取過程易受外界影響等[14]。因此，改進結(jié)核分枝桿菌的富集方法是提高檢測敏感度的第一步。其次，結(jié)核分枝桿菌作為胞內(nèi)寄生菌，常規(guī)的處理方法容易遺漏結(jié)核分枝桿菌的檢測，因此改進標本處理方法，高效提取單核細胞內(nèi)的結(jié)核分枝桿菌應是提高檢測敏感度的第二步。再次，結(jié)核分枝桿菌提取后，如何采取有效的破壁方案，高效提取核酸進行擴增，是提高檢測敏感度的第三步。最后，mNGS作為測序技術(shù)，其主要優(yōu)勢在于可以對樣本中全部的核酸進行檢測，這種無偏性的檢測，對于TBM與其他中樞神經(jīng)感染性疾病的鑒別意義重大，因此對于臨床中難以診斷的中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染性疾病，建議行mNGS檢測，可能會對診斷有幫助。

現(xiàn)階段面臨的主要問題在于，新的檢測方法在臨床中的應用時間較短，仍需大樣本的臨床觀察來確定其實用性。同時現(xiàn)有的分子檢測技術(shù)，仍不能解決腦脊液檢測陰性預測值低的問題，不能作為排除臨床診斷的標準，還需要進一步研究與改進，才能更好地服務(wù)于臨床。

三、展望

腦脊液作為體液樣本有其特點，TBM患者多伴有顱內(nèi)壓增高或腦積液，過多的取材會加重患者病情，取材過少則會影響檢測的敏感度，亟需高敏感度的分子檢測技術(shù)；改進胞內(nèi)寄生菌的提取及采取有效的破壁方案進行高效的核酸提取，可能是提高檢測敏感度的有效方法，也是需要進一步研究的方向；目前臨床中常用的分子檢測技術(shù)，雖然可以用于腦脊液標本，但臨床數(shù)據(jù)較少，仍需要積累臨床數(shù)據(jù)，以篩選出最優(yōu)的檢測方法。檢測TBM的新技術(shù)從實驗室到應用于臨床實際工作仍需要大樣本的臨床試驗來支撐。但是，隨著結(jié)核病實驗室分子檢測技術(shù)水平的提高，TBM的檢測能力也會逐步提高，以更好地滿足臨床醫(yī)生對TBM診斷的要求，提高TBM患者的治療效果。