丹參治療缺血性腦卒中潛在效應(yīng)機(jī)制的網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究

朱德才,張昌林,廖映迪

腦卒中是一種急性腦循環(huán)障礙導(dǎo)致的局限性或彌漫性神經(jīng)功能缺損的腦血管疾病,包括缺血性腦卒中(ischemic stroke,IS)和出血性腦卒中[1]。據(jù)2016 年全球疾病負(fù)擔(dān)研究顯示,腦卒中已成全球第二大死亡原因,患腦卒中人數(shù)達(dá)8 010 萬人,其中缺血性腦卒中占84.4%[2]。在我國,腦卒中是傷殘調(diào)整壽命年增加的主要原因之一[3],腦卒中防控形勢嚴(yán)峻,未來隨著我國人口老齡化速度的加快,腦卒中疾病負(fù)擔(dān)仍可能進(jìn)一步增加。因此,探索更多積極、有效防治腦卒中發(fā)生發(fā)展的措施顯得尤為必要。

缺血性腦卒中屬中醫(yī)學(xué)“中風(fēng)”的范疇,中風(fēng)的發(fā)病與風(fēng)、火、痰、虛、瘀等因素密切相關(guān),其中瘀貫穿缺血性腦卒中發(fā)病發(fā)展的全過程[4]。因此,活血化瘀的法則在中風(fēng)病的治療中占據(jù)相當(dāng)重要的分量[5]。中藥丹參始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》,其味苦,性微寒,歸心、肝經(jīng),具有活血祛瘀、通經(jīng)止痛等功效[6]?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明,丹參具有改善血液循環(huán)、抗血小板聚集、保護(hù)血管內(nèi)皮細(xì)胞、抗動脈粥樣硬化、抗炎、抗氧化應(yīng)激、抗腫瘤等多種藥理作用,目前主要用于治療冠心病、心肌梗死、缺血性腦卒中等心腦血管疾病[7-8]。因此,探究中藥丹參治療缺血性腦卒中潛在效應(yīng)機(jī)制,對發(fā)揮中醫(yī)藥治療缺血性腦卒中的優(yōu)勢具有重要意義。

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)是一門融合了系統(tǒng)生物學(xué)、生物信息學(xué)及計算機(jī)技術(shù)等的新興學(xué)科,這一概念由Hopkins首次提出,他指出對于多成分、多靶點(diǎn)藥物的研發(fā),需要用系統(tǒng)思維,從網(wǎng)絡(luò)層面去分析藥物效應(yīng)機(jī)制[9]。這種從網(wǎng)絡(luò)層面闡釋藥物效應(yīng)機(jī)制的方法,是對既往“一藥、一靶、一病”還原論藥物研發(fā)模式的有效補(bǔ)充。中藥具有多成分、多靶點(diǎn)、多效應(yīng)途徑的特征,這與網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的思想及研究方法相吻合,由此網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)很快為中藥研究者所接受并應(yīng)用在中藥藥理研究中,提出了中藥網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的研究策略與路線[10]。本研究基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析方法,從系統(tǒng)層面以及分子、蛋白水平揭示丹參治療缺血性腦卒中的潛在效應(yīng)機(jī)制,為中藥丹參的進(jìn)一步藥理研究和臨床應(yīng)用提供。

1 資料與方法

1.1 丹參化學(xué)成分及成分作用靶標(biāo)預(yù)測 BATMANTCM(http://bionet.ncpsb.org/batman-tcm/)數(shù)據(jù)庫具有中藥成分靶標(biāo)預(yù)測、基因功能分析、通路富集分析等諸多功能[11],通過藥物相似性原則,預(yù)測中藥成分作用靶標(biāo)[12]。本研究在BATMAN-TCM 平臺“Cluster name”中輸入中藥丹參的拼音“DANSHEN”,并以P＜0.05、Score cutoff=20 為閾值收集中藥丹參的成分信息及預(yù)測成分作用靶標(biāo)。

1.2 缺血性腦卒中靶標(biāo)收集 本研究以ischemic stroke,brain ischemia,cerebral infarction,cerebral ischemia 作為缺血性腦卒中的關(guān)鍵詞,通過檢索DisGe NET(http://www.disgenet.org)[13]、NCBI (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/)、Human Phenotype Ontology(https://hpo. jax. org/app/)[14]、Gene Cards (https://www.genecards.org/)[15]等數(shù)據(jù)庫,獲取已知的與缺血性腦卒中相關(guān)的靶標(biāo),并刪除重復(fù)靶標(biāo),構(gòu)建缺血性腦卒中疾病靶標(biāo)數(shù)據(jù)庫。

1.3 丹參治療缺血性腦卒中的蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 將丹參成分預(yù)測靶標(biāo)及缺血性腦卒中疾病靶標(biāo)上傳至Venny 2.1.0 (http://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/index.html)在線分析工具,獲取兩者共同靶標(biāo),繪制Venn 圖。STRING(https://string-db.org/)數(shù)據(jù)庫是一個在線搜索蛋白質(zhì)相互作用關(guān)系的數(shù)據(jù)庫,該數(shù)據(jù)庫收錄大量實驗數(shù)據(jù)、文獻(xiàn)挖掘數(shù)據(jù)及生物信息學(xué)預(yù)測數(shù)據(jù)等[16]。在本研究中,將丹參成分預(yù)測靶標(biāo)與缺血性腦卒中的共同靶標(biāo)導(dǎo)入STRING 數(shù)據(jù)庫,選擇研究對象為“Homo sapiens”,構(gòu)建丹參治療缺血性腦卒中的蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用(protein-protein interaction,PPI)網(wǎng)絡(luò)。

1.4 PPI網(wǎng)絡(luò)分析 網(wǎng)絡(luò)拓?fù)涮卣髦械亩戎行男?degree)、介度中心性(betweenness centrality)及緊密度中心性(closeness centrality)是衡量網(wǎng)絡(luò)節(jié)點(diǎn)重要程度的指標(biāo)[17]。網(wǎng)絡(luò)節(jié)點(diǎn)在網(wǎng)絡(luò)中的重要性與該指標(biāo)數(shù)值的大小呈正相關(guān)。本研究采用Cytoscape3.6.1 軟件中“Network Analyzer”對丹參-缺血性腦卒中靶標(biāo)PPI 網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)拓?fù)鋵W(xué)特征分析,獲取其度中心性、介度中心性及緊密度中心性等網(wǎng)絡(luò)拓?fù)涮卣髦?并以同時滿足大于度中心性、介度中心性和緊密度中心性的中位數(shù)作為基準(zhǔn),篩選丹參治療缺血性腦卒中的核心靶標(biāo)。

1.5 丹參治療缺血性腦卒中的基因本體(GO)及京都基因和基因百科全書(KEGG)分析 GO 分析廣泛應(yīng)用于基因功能的注釋,其可提供細(xì)胞組分、分子功能及生物學(xué)過程等生物學(xué)信息[18]。KEGG 是國際上最常用的生物信息學(xué)數(shù)據(jù)庫之一,從分子水平方面為了解生物高級功能及生物系統(tǒng)提供參考信息[19]。DAVID(the database for annotation,visualization and integrated discovery)數(shù)據(jù)庫整合了包括GO、KEGG 在內(nèi)的多個權(quán)威數(shù)據(jù)庫資源,為大規(guī)模的基因或蛋白提供生物信息方面的注釋[20]。本研究將丹參治療缺血性腦卒中的核心靶標(biāo)上傳DAVID 數(shù)據(jù)庫,對丹參治療缺血性腦卒中的核心靶標(biāo)進(jìn)行GO 基因功能和KEGG 通路富集分析,并依據(jù)P-vaule 值結(jié)果排序,以圖表形式展示。

2 結(jié) 果

2.1 丹參化學(xué)成分及成分靶標(biāo)預(yù)測 通過BATMANTCM 數(shù)據(jù)庫,獲得中藥丹參化學(xué)成分38 個,包括丹參素、丹參酚、丹參酚酸類、丹參酮類、丹參醌類、咖啡酸等化合物(見表1)。通過“藥物相似性”原則,計算并篩選出丹參化學(xué)成分的作用靶標(biāo),除去重復(fù)靶標(biāo)后,共獲得770 個靶標(biāo)。對中藥丹參成分作用靶標(biāo)進(jìn)行生物信息學(xué)分析,以了解靶標(biāo)基因功能、通路富集以及疾病表型方面信息,圖1 為簡化的中藥丹參“有效成分-靶標(biāo)-通路-疾病”關(guān)聯(lián)網(wǎng)絡(luò)圖。結(jié)果提示中藥丹參可參與環(huán)磷酸鳥苷(cGMP)-環(huán)磷酸鳥苷依賴的蛋白激酶(PKG)信號通路、Rap1 信號通路、鈣離子信號通路、催乳素信號通路、甲狀腺激素信號通路、逆行神經(jīng)信號、刺激型態(tài)成形因子信號等。疾病表型方面顯示,中藥丹參對于精神類疾病(焦慮、抑郁)、神經(jīng)系統(tǒng)疾病(神經(jīng)變性、腦損傷)、心血管疾病以及婦科相關(guān)疾病(痛經(jīng)、子宮內(nèi)膜異位)可能具有較好的療效。

表1 丹參化學(xué)成分信息匯總表

(續(xù)表)

圖1 中藥丹參“有效成分-靶標(biāo)-通路-疾病”關(guān)聯(lián)網(wǎng)絡(luò)圖

2.2 缺血性腦卒中相關(guān)靶標(biāo) 通過DisGeNET、NCBI、HPO、Gene Cards 數(shù)據(jù)庫檢索缺血性腦卒中關(guān)鍵詞(ischemic stroke、brain ischemia、cerebral infarction、cerebral ischemia),獲取相關(guān)靶標(biāo),其中DisGeNET中737 個,NCBI-Gene 中642 個,HPO 中67 個,Gene Cards 中296 個,去除重復(fù)靶標(biāo)后,共獲取缺血性腦卒中相關(guān)靶標(biāo)1 216 個。

2.3 丹參治療缺血性腦卒中的PPI 網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建及分析 將丹參成分作用靶標(biāo)及缺血性腦卒中疾病相關(guān)靶標(biāo)上傳至Venny 2.1.0 分析工具,獲得共同靶標(biāo)205 個,作為丹參治療缺血性腦卒中的候選靶標(biāo)(見圖2)。將丹參治療缺血性腦卒中的候選靶標(biāo)上傳至STRING 數(shù)據(jù)庫,構(gòu)建丹參治療缺血性腦卒中的PPI 網(wǎng)絡(luò)。通過計算PPI 網(wǎng)絡(luò)特征值,選取同時滿足度中心性、介度中心性和緊密度中心性3 者中位數(shù)的靶標(biāo)作為丹參治療缺血性腦卒中的關(guān)鍵靶標(biāo),本研究共獲取關(guān)鍵靶標(biāo)83個。對丹參治療缺血性腦卒中關(guān)鍵靶標(biāo)相互作用網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行可視化,節(jié)點(diǎn)大小及顏色深度反映該靶標(biāo)度中心性的值(見圖3)。研究顯示丹參治療缺血性腦卒中與白介素6(IL-6)、腫瘤壞死因子(TNF)、TP53、SRC、白介素1β(IL-1β)、FOS、PTGS2、EDN1、JUN、白介素10(IL-10)等靶標(biāo)密切相關(guān)。

圖2 丹參成分靶標(biāo)與缺血性腦卒中疾病靶標(biāo)的Venn 圖

圖3 丹參治療缺血性腦卒中核心靶標(biāo)相互作用網(wǎng)絡(luò)圖

2.4 丹參治療缺血性腦卒中核心靶標(biāo)基因功能及通路富集分析 通過DAVID 數(shù)據(jù)庫對丹參治療缺血性腦卒中核心靶標(biāo)進(jìn)行GO 基因功能及KEGG 通路富集分析,以了解其核心靶標(biāo)所發(fā)揮的生物學(xué)功能。研究結(jié)果顯示,在生物學(xué)過程中,丹參治療缺血性腦卒中與一氧化氮生物合成過程的正調(diào)控、對藥物的反應(yīng)、炎癥反應(yīng)、細(xì)胞增殖的陽性調(diào)節(jié)、衰老、DNA 模板轉(zhuǎn)錄正調(diào)控、血壓調(diào)節(jié)、ERK1 和ERK2 級聯(lián)的正調(diào)節(jié)、基因表達(dá)正調(diào)控、RNA 聚合酶Ⅱ啟動子對轉(zhuǎn)錄的正調(diào)節(jié)作用等過程相關(guān);其分子功能方面涉及了蛋白質(zhì)雜化活性、酶結(jié)合、細(xì)胞因子活性、受體結(jié)合、生長因子活性、蛋白結(jié)合、轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合、蛋白質(zhì)同源活性、相同蛋白質(zhì)結(jié)合、腎上腺素結(jié)合等;在細(xì)胞層面其作用部位集中在細(xì)胞外間隙、胞外區(qū)、細(xì)胞膜、細(xì)胞表面、神經(jīng)元投射、細(xì)胞膜有機(jī)組成部分、細(xì)胞膜外側(cè)面、溶酶體、蛋白質(zhì)復(fù)合物、細(xì)胞質(zhì)核周區(qū)等。詳見圖4。

圖4 丹參治療缺血性腦卒中核心靶標(biāo)GO 分類圖

結(jié)合KEGG 通路富集分析及文獻(xiàn)研究結(jié)果見圖5,丹參治療缺血性腦卒中可能通過以下信號通路發(fā)揮作用,包括TNF 信號通路、神經(jīng)活性配體-受體相互作用、T 細(xì)胞受體信號通路、細(xì)胞因子-細(xì)胞因子受體相互作用、環(huán)磷酸腺苷(cAMP)信號通路、絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)信號通路、Toll 樣受體信號通路、Ras信號通路、造血細(xì)胞系以及細(xì)胞凋亡等,提示丹參治療缺血性腦卒中是通過多途徑效應(yīng)機(jī)制發(fā)揮療效的。

圖5 丹參治療缺血性腦卒中核心靶標(biāo)KEGG 通路富集圖

3 討 論

中藥丹參在我國得到廣泛的應(yīng)用,尤其在心腦血管領(lǐng)域,如冠心病、高血壓、急性缺血性腦卒中等[21]。本研究通過BATMAN-TCM 數(shù)據(jù)庫,共獲得中藥丹參化學(xué)成分38 個,其中包括丹參素、丹參酚、丹參酚酸類、丹參酮類、丹參醌類、咖啡酸等化合物。動脈新生和側(cè)支循環(huán)增加是腦卒中病人恢復(fù)再灌注和預(yù)后的重要因素。研究表明,丹參素可以增加血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)、基質(zhì)源性因子-1(SDF-1)、腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(BDNF)和內(nèi)皮型一氧化氮合酶(eNOS)的表達(dá),增加卒中后側(cè)支動脈的直徑,促進(jìn)局部腦血流恢復(fù)[22]。丹參酚酸具有較強(qiáng)的血小板凝聚作用,其可降低血液中血栓素B2(TXB2)水平,從而發(fā)揮抗積聚作用[23]。此外,研究還表明丹參酚酸B 具有抗炎、抗氧化、抗細(xì)胞凋亡等諸多作用,減輕腦缺血性損傷,改善神經(jīng)功能缺失癥狀[24]。此外,相關(guān)研究也表明丹參酮ⅡA 可通過抑制炎性反應(yīng)及細(xì)胞凋亡發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用,降低腦梗死體積及神經(jīng)功能缺損評分[25-26]。

網(wǎng)絡(luò)拓?fù)涮卣鞣治霰砻?丹參治療缺血性腦卒中與IL-6、TNF、TP53、SRC、IL-1β、FOS、PTGS2、EDN1、JUN、IL-10 等靶標(biāo)密切相關(guān)。免疫炎癥反應(yīng)在缺血性腦卒中的發(fā)生發(fā)展中具有重要作用。IL-6 在急性期炎癥反應(yīng)中具有重要地位,研究表明,急性缺血性腦卒中發(fā)生后,釋放的IL-6 可通過N-甲基-D-天冬氨酸(NMDA)受體的激活,上調(diào)內(nèi)皮素-1(ET-1)和JUN 的表達(dá),介導(dǎo)海馬區(qū)神經(jīng)元的死亡以及腦自動調(diào)節(jié)能力的受損[27]。腦卒中后IL-6 水平與磁共振彌散加權(quán)成像(MR-DWI)中急性損害面積、腦灌注缺損、最終梗死面積等參數(shù)密切相關(guān)[28],并且IL-6 也與腦卒中病人感染(如肺部感染)呈獨(dú)立相關(guān),對預(yù)測病人是否發(fā)生感染具有參考價值[29]。TNF-α具有活化小膠質(zhì)細(xì)胞,促進(jìn)黏附及趨化因子表達(dá)的作用,進(jìn)而提高炎性相關(guān)細(xì)胞的遷移能力,是缺血性腦卒中后神經(jīng)細(xì)胞損傷的關(guān)鍵原因之一[30]。此外,動物研究發(fā)現(xiàn),對于TNF 受體基因缺乏小鼠,腦缺血后的腦梗死體積和腦損傷程度均明顯高于野生型小鼠,這一定程度上提示TNF 具有一定的神經(jīng)保護(hù)作用[31]。SRC 是一種具有酪氨酸蛋白激酶活性的蛋白質(zhì),其可通過氧化還原作用,調(diào)節(jié)緩激肽、偶聯(lián)因子6、血管內(nèi)皮生長因子等,改變血管的結(jié)構(gòu)和功能,在心腦血管疾病如高血壓、腦卒中中發(fā)揮重要作用[32]。IL-1β是重要的炎癥反應(yīng)細(xì)胞因子之一,其可啟動白介素1(IL-1)受體,進(jìn)而激活核因子κB(NF-κB)、JUK、MAPA 等炎性相關(guān)通路,產(chǎn)生IL-6 等促炎細(xì)胞因子,造成局部腦組織損傷[33]。

在生物學(xué)過程方面,本研究發(fā)現(xiàn)丹參治療缺血性腦卒中與一氧化氮生物合成過程的正調(diào)控、炎癥反應(yīng)、衰老、血壓調(diào)節(jié)、ERK1 和ERK2 級聯(lián)的正調(diào)節(jié)、基因表達(dá)正調(diào)控等過程相關(guān)。近年來,一氧化氮作為一種氣體信號分子逐漸為大家所認(rèn)識,其主要生理功能包括維持血管張力、減少炎癥反應(yīng)、維持血栓-溶栓系統(tǒng)平衡以及調(diào)節(jié)細(xì)胞生長等[34]。一氧化氮與腦卒中關(guān)系密切,一氧化氮的產(chǎn)生主要來源于誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(iNOS)、神經(jīng)元型一氧化氮合酶(nNOS)以及eNOS。其中,eNOS 在缺血性腦卒中早期及晚期起著腦保護(hù)作用,研究表明,一氧化氮作為一種自由基通過修飾線粒體功能,降低線粒體功能障礙,從而介導(dǎo)缺血再灌注損傷后的細(xì)胞保護(hù)作用[35]。炎癥反應(yīng)貫穿缺血性腦卒中的整個過程。腦卒中發(fā)生后,病灶組織中損傷或死亡的神經(jīng)細(xì)胞會釋放損傷相關(guān)模式分子,進(jìn)而激活炎癥反應(yīng)的發(fā)生,早期炎癥反應(yīng)的發(fā)生會加重腦腫脹的發(fā)生以及氧化應(yīng)激反應(yīng),進(jìn)而造成繼發(fā)性的腦損傷[36]。衰老是腦卒中發(fā)生的重要因素之一,研究表明隨著年齡的增長,腦卒中危險因素逐漸增加,并且心血管疾病的風(fēng)險累積效應(yīng)也不斷上升,這導(dǎo)致了缺血性腦卒中的發(fā)生及發(fā)病風(fēng)險顯著提高[37]。此外,高血壓是導(dǎo)致腦卒中發(fā)生的高危因素之一[38],多項研究證實,對腦卒中病人及時進(jìn)行降壓治療,能明顯降低腦卒中的復(fù)發(fā)率及血管事件的發(fā)生率[39]。

結(jié)合相關(guān)文獻(xiàn)研究,本研究結(jié)果顯示丹參治療缺血性腦卒中可能通過TNF 信號通路、神經(jīng)活性配體-受體相互作用、T 細(xì)胞受體信號通路、cAMP 信號通路、MAPK 信號通路、Toll 樣受體(TLR)信號通路以及細(xì)胞凋亡等信號通路發(fā)揮療效。TNF-α主要表達(dá)于巨噬細(xì)胞、自然殺傷細(xì)胞、T 細(xì)胞以及B 細(xì)胞,中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的神經(jīng)元及膠質(zhì)細(xì)胞也可以表達(dá)TNF-α。研究表明,急性缺血性腦卒中病人血清中TNF-α水平會升高,并且與病人神經(jīng)功能的缺損程度和梗死范圍密切相關(guān)[40]。此外,TNF-α 可誘導(dǎo)促炎型小膠質(zhì)細(xì)胞形成,參與了缺血性腦損傷的發(fā)生[41]。丹參酚酸B 可抑制星形膠質(zhì)細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞的過度激活,降低TNF-α的表達(dá),發(fā)揮腦保護(hù)作用,從而縮小腦梗死面積,并改善神經(jīng)功能[42]。T 細(xì)胞受體在T 細(xì)胞功能的發(fā)揮和免疫突觸的形成中起著重要作用,其可激活許多信號級聯(lián)發(fā)生,調(diào)節(jié)細(xì)胞因子的產(chǎn)生、細(xì)胞的增殖和分化等。通過比較動脈粥樣硬化、腦梗死、心肌梗死病人中TCR 表達(dá)情況,研究者發(fā)現(xiàn)體內(nèi)T 細(xì)胞受體信號通路表達(dá)下降是其共性的變化,而DNA 甲基化是導(dǎo)致TCR 信號下調(diào)的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子[43]。cAMP 是細(xì)胞內(nèi)重要的第二信使之一,其通過激活PKA 信號通路,介導(dǎo)cAMP 反應(yīng)元件結(jié)合蛋白CREB,調(diào)節(jié)神經(jīng)元再生突觸的形成,發(fā)揮腦保護(hù)作用[44]。缺血性腦卒中發(fā)生后,MAPK 可被激活,對神經(jīng)細(xì)胞凋亡起著重要作用[45]。抑制MAPK 信號通路,可減少神經(jīng)細(xì)胞凋亡,減輕腦組織損傷[46]。Toll 樣受體是參與非特異性免疫中重要的一類蛋白質(zhì)分子,研究表明,缺血后小膠質(zhì)細(xì)胞及神經(jīng)元細(xì)胞中TLR2 的表達(dá)升高,而敲除TLR2 基因后的小鼠則神經(jīng)細(xì)胞的損傷減輕,并且白細(xì)胞及小膠質(zhì)細(xì)胞的浸潤亦減少[47]。

綜上所述,本研究通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析方法,闡述了中藥丹參治療缺血性腦卒中的多成分、多靶點(diǎn)、多途徑的效應(yīng)機(jī)制,為進(jìn)一步的實驗研究和臨床實踐提供一定參考依據(jù)和思路。中藥丹參可通過調(diào)控IL-6、TNF、SRC、IL-1β、JUN、IL-10 等關(guān)鍵靶標(biāo),參與一氧化氮生物合成、炎癥反應(yīng)、衰老、血壓調(diào)節(jié)等生物學(xué)過程,抑制缺血性腦卒中后神經(jīng)組織的壞死、凋亡,發(fā)揮腦保護(hù)作用,改善神經(jīng)功能;其作用機(jī)制涉及TNF 信號通路、cAMP 信號通路、MAPK 信號通路、Toll 樣受體信號通路等。然而,本研究尚存在一定的局限性,藥物成分的理化特性以及劑量和煎服法對療效結(jié)果的影響未能進(jìn)一步闡述。因此,本研究結(jié)果仍需進(jìn)一步研究證實。