PYCR1在胃癌細(xì)胞中的表達(dá)及生物學(xué)功能研究

孫娟　林暉　王耀新　蔡惠美　唐晶晶

【摘要】 目的：研究與分析PYCR1在胃癌細(xì)胞中的表達(dá)及生物學(xué)功能。方法：選取2017年10月-

2020年1月本院32例胃癌患者為觀察組，同時期的32例胃炎患者為對照組。比較兩組的病灶組織PYCR1表達(dá)情況，并比較觀察組中不同疾病分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況者的PYCR1表達(dá)情況，采用Spearman秩相關(guān)分析其與疾病分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況的關(guān)系;取胃癌AGS、SGC-790及MGC-803細(xì)胞分別分為si-NC組（轉(zhuǎn)染對照質(zhì)粒）與si-PYCR1組（轉(zhuǎn)染敲低序列PYCR1質(zhì)粒），比較各組的細(xì)胞克隆數(shù)、凋亡細(xì)胞率及細(xì)胞穿膜數(shù)。結(jié)果：觀察組的PYCR1表達(dá)水平高于對照組（P<0.05）。觀察組中不同疾病分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況者的PYCR1表達(dá)水平比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），Spearman秩相關(guān)分析顯示，PYCR1與疾病分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況均呈正相關(guān)（rs=0.910、0.881，P<0.05）。AGS、SGC-790及MGC-803細(xì)胞的si-PYCR1組的細(xì)胞克隆數(shù)及細(xì)胞穿膜數(shù)均低于si-NC組，凋亡細(xì)胞率均高于si-NC組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。結(jié)論：PYCR1在胃癌細(xì)胞中呈現(xiàn)高表達(dá)，且與疾病分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況均呈正相關(guān)，干擾PYCR1可有效控制胃癌細(xì)胞增殖及遷移侵襲。

【關(guān)鍵詞】 PYCR1 胃癌細(xì)胞 增殖 遷移 侵襲

Study on the Expression of PYCR1 in Gastric Cancer Cells and Biological Function/SUN Juan， LIN Hui， WANG Yaoxin， CAI Huimei， TANG Jingjing. //Medical Innovation of China， 2021， 18（23）： -166

[Abstract] Objective： To study and analyze the expression and biological function of PYCR1 in gastric cancer cells. Method： From October 2017 to January 2020， 32 patients with gastric cancer in our hospital were selected as the observation group， and 32 patients with gastritis during the same period were selected as the control group. The expression of PYCR1 in the two groups was compared， and the expressions of PYCR1 in patients with different disease stages and lymph node metastasis in the observation group were compared. The relationship between PYCR1 and disease stage and lymph node metastasis was analyzed by Spearman rank correlation. Gastric cancer AGS， SGC-790 and MGC-803 cells were divided into si-NC group （transfected control plasmid） and si-PYCR1 group （transfected knockdown sequence PYCR1 plasmid）， respectively. The number of cell clones， apoptotic cell rate and cell transmembrane number were compared in each group. Result： The expression level of PYCR1 in the observation group was higher than that in the control group （P<0.05）. The differences of PYCR1 expression levels in patients with different disease stages and lymph node metastasis in the observation group were statistically significant （P<0.05）. Spearman rank correlation analysis showed that， PYCR1 was positively correlated with disease stage and lymph node metastasis （rs=0.910， 0.881， P<0.05）. The number of cell clones and cell transmembrane number in si-PYCR1 group of AGS， SGC-790 and MGC-803 cells were lower than those in si-NC group， and the rates of apoptotic cells were higher than those in si-NC group， the differences were statistically significant （P<0.05）. Conclusion： PYCR1 is highly expressed in gastric cancer cells and is positively correlated with disease stage and lymph node metastasis， interfering with PYCR1 can effectively control the proliferation， migration and invasion of gastric cancer cells.

[Key words] PYCR1 Gastric cancer cells Proliferation Migration Invasion

First-author’s address： Fuzhou First Hospital， Fuzhou 350009， China

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2021.23.040

胃癌是消化系統(tǒng)常見惡性腫瘤，與胃癌相關(guān)的各方面研究一直是臨床重點(diǎn)。與胃癌預(yù)后相關(guān)的研究中，胃癌細(xì)胞的增殖侵襲及轉(zhuǎn)移能力是重要因素[1-2]。PYCR1作為在多類惡性腫瘤患者中研究較多的指標(biāo)，較多研究認(rèn)為其對于腫瘤細(xì)胞的增殖及侵襲轉(zhuǎn)移具有促進(jìn)作用[3-5]。臨床中關(guān)于PYCR1在胃癌細(xì)胞中的作用機(jī)制，尤其是生物學(xué)功能的研究極為匱乏，且在細(xì)致程度方面有所欠缺，因此本方面的研究意義較高。本研究就PYCR1在胃癌細(xì)胞中的表達(dá)及生物學(xué)功能進(jìn)行研究與分析，以為疾病的診治與控制提供參考依據(jù)，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 材料 （1）組織標(biāo)本來源。選取本院2017年10月-2020年1月收治的32例胃癌患者為觀察組，另選取同時期32例胃炎患者為對照組。納入標(biāo)準(zhǔn)：20～75歲者;男女不限;觀察組為確診為胃癌者，對照組為確診為胃炎者。排除標(biāo)準(zhǔn)：合并其他消化系統(tǒng)疾病者;合并創(chuàng)傷者;妊娠期及哺乳期者;合并慢性基礎(chǔ)疾病者;合并代謝性疾病者。患者均對研究知情同意。（2）胃癌細(xì)胞。胃癌AGS、SGC-790及MGC-803細(xì)胞均來源于中國科學(xué)院。（3）試劑。基礎(chǔ)培養(yǎng)基和胎牛血清（Biological Industries，美國），酶標(biāo)儀（Invitrogen公司，美國），CCK-8細(xì)胞計(jì)數(shù)檢測試劑盒（CST，美國），兔抗人-PYCR1抗體、HRP抗兔二抗（北京博奧森生物公司），Transwell小室（Corning公司），Trizol試劑（Ta Ka Ra公司），CCK8試劑（同仁公司），Matrigel基質(zhì)膠（BD公司）。本研究已經(jīng)倫理學(xué)委員會批準(zhǔn)。

1.2 方法

1.2.1 對照組和觀察組PYCR1表達(dá)情況 采集兩組病灶組織標(biāo)本，將組織標(biāo)本進(jìn)行常規(guī)處理，采用RT-qPCR法進(jìn)行其相對表達(dá)量的檢測，首先進(jìn)行總RNA的提取，然后進(jìn)行2-ΔΔCt的方法進(jìn)行相對表達(dá)量的計(jì)算，比較兩組的病灶組織PYCR1表達(dá)情況，并比較觀察組中不同疾病分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況者的PYCR1表達(dá)情況，采用Spearman秩相關(guān)分析其與疾病分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況的關(guān)系。

1.2.2 胃癌細(xì)胞分組與培養(yǎng) 將胃癌AGS、SGC-790及MGC-803細(xì)胞株置于添加青霉素100 U/mL和鏈霉素100 μg/mL的含15%胎牛血清DMEM培養(yǎng)液中培養(yǎng)。選取對數(shù)生長期細(xì)胞胰酶消化后，用基礎(chǔ)培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞密度為1×106個/mL，

將細(xì)胞接種到6孔板后37 ℃孵育24 h。按照制造商說明書用Lipofectamine TM 2000將三種胃癌細(xì)胞分別轉(zhuǎn)染三種敲減序列PYCR1質(zhì)粒（5’-TGAGAAGAAGCTGTCAGCGTT-3’;5’-TCAGAGCTGAAAGTGGACGT-3’;5’-TAGAACCTATGAAGGAAGGTT-3’），利用RT-qPCR和免疫印跡試驗(yàn)檢測PYCR1表達(dá)，選取干擾效率最高的細(xì)胞株進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)，命名為si-PYCR1組;另取三種胃癌細(xì)胞轉(zhuǎn)染對照質(zhì)粒siRNA-NC作為si-NC組。

1.2.3 克隆形成實(shí)驗(yàn) 轉(zhuǎn)染48 h后取AGS、SGC-790及MGC-803細(xì)胞si-NC組與si-PYCR1組的對數(shù)生長周期的細(xì)胞，以胰蛋白酶消化并吹打成單個細(xì)胞，將其懸浮于10%胎牛血清的培養(yǎng)液中，細(xì)胞懸液進(jìn)行梯度倍數(shù)稀釋，以梯度密度接種于37 ℃培養(yǎng)皿中，與5% CO2下培養(yǎng)2～3周，形成肉眼可見的克隆后，采用PBS浸洗，處理2次，采用多聚甲醛進(jìn)行固定，染色，流水洗去染色，進(jìn)行干燥處理后采用制成透明膠片，低倍鏡下進(jìn)行克隆數(shù)的計(jì)數(shù)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)5次。

1.2.4 AnnexinV/PI雙染色細(xì)胞凋亡試驗(yàn) 收集各組細(xì)胞，調(diào)整待檢測細(xì)胞濃度，預(yù)冷PBS進(jìn)行兩次潤洗，4 ℃條件下3 000 r/min，離心5 min，將細(xì)胞重懸與Binding Buffer，加入Annexin-FITC并混勻，避光條件下置于冰上，15 min后將其轉(zhuǎn)至流式檢測管，加入PBS，再加入PI后上機(jī)檢測，另以不加Annexin-FITC及PI的作為陰性對照。分別加Annexin-FITC及PI作為橫軸與縱軸進(jìn)行結(jié)果分析，統(tǒng)計(jì)分析凋亡細(xì)胞率。實(shí)驗(yàn)重復(fù)5次。

1.2.5 Transwell細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn) 將基質(zhì)膠提前放置在4 ℃冰箱內(nèi)融化，以1︰8 的比例將其與不含血清的Matrigel基質(zhì)膠混勻，將混合液每個小室加入100 μL后放入37 ℃孵箱內(nèi)24 h。各組細(xì)胞消化離心，使用無血清的Matrigel基質(zhì)膠重懸細(xì)胞計(jì)數(shù)，調(diào)整細(xì)胞密度為3×108個/L。將Transwell小室置入24孔板內(nèi)，在小室上室加入200 μL細(xì)胞懸液，下室加入700 μL含血清的完全培養(yǎng)基。細(xì)胞孵箱內(nèi)正常培養(yǎng)24 h后取出小室，PBS輕輕洗滌后，用棉簽擦去小室內(nèi)側(cè)細(xì)胞。4%多聚甲醛固定20 min后晾干，再用0.1%結(jié)晶紫染色15 min 后，PBS清洗小室2～3次后自然風(fēng)干，最后顯微鏡觀察穿膜細(xì)胞并拍照，保存后使用軟件計(jì)數(shù)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)5次。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 23.0軟件對所得數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料用（x±s）表示，比較采用t檢驗(yàn)，重復(fù)測量的計(jì)量資料進(jìn)行方差分析;計(jì)數(shù)資料以率（%）表示，比較采用χ檢驗(yàn);因素之間的關(guān)系采用Spearman秩相關(guān)分析。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組一般資料比較 對照組男20例，女12例;年齡29～75歲，平均（65.3±6.9）歲，其中淺表性胃炎2例，糜爛性胃炎10例。觀察組男19例，女13例;年齡30～76歲，平均（65.7±7.0）歲;疾病分期：Ⅰ期6例，Ⅱ期10例，Ⅲ期10例，Ⅳ期6例;淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況：無轉(zhuǎn)移12例，近處轉(zhuǎn)移11例，遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移9例。兩組年齡與性別比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），具有可比性。

2.2 兩組PYCR1表達(dá)情況比較 觀察組的PYCR1表達(dá)量為（3.63±0.56）高于對照組（1.21±0.21），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=22.889，P=0.000）。

2.3 觀察組中不同疾病分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者的PYCR1表達(dá)情況比較 觀察組中不同疾病分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況者的PYCR1表達(dá)比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），見表1。Spearman秩相關(guān)分析顯示，PYCR1與疾病分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況呈正相關(guān)（rs=0.910、0.881，P<0.05）。

2.4 胃癌AGS、SGC-790及MGC-803細(xì)胞經(jīng)不同轉(zhuǎn)染后細(xì)胞克隆數(shù)、凋亡細(xì)胞率、細(xì)胞穿膜數(shù)比

較 AGS、SGC-790及MGC-803細(xì)胞si-PYCR1組的細(xì)胞克隆數(shù)及細(xì)胞穿膜數(shù)均低于si-NC組，凋亡細(xì)胞率高于si-NC組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），見表2。

3 討論

胃癌是臨床研究的重點(diǎn)，與之相關(guān)臨床研究較多，且涉及面較廣，其中與腫瘤細(xì)胞增殖、侵襲轉(zhuǎn)移等方面的研究是重中之重。臨床中與腫瘤細(xì)胞相關(guān)信號通路及增殖、凋亡調(diào)控相關(guān)的基因研究涉及種類較多[6-9]。PYCR1在前列腺癌、乳腺癌等多類惡性腫瘤中的研究可見，其主要為通過影響脯氨酸代謝來達(dá)到影響腫瘤細(xì)胞增殖的目的，在多類惡性腫瘤細(xì)胞中都呈現(xiàn)出相對較高的表達(dá)狀態(tài)[10-14]。近年來關(guān)于PYCR1在惡性腫瘤中的表達(dá)研究不斷增多，其中可見在結(jié)腸癌等消化系統(tǒng)惡性腫瘤的表達(dá)變化研究，但是其在胃癌患者中的表達(dá)仍有待探究[15-18]。

本研究結(jié)果顯示，觀察組的PYCR1表達(dá)水平高于對照組（P<0.05）;觀察組中不同疾病分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況者的PYCR1表達(dá)水平比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）;Spearman秩相關(guān)分析顯示，PYCR1與疾病分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況均呈正相關(guān)（rs=0.910、0.881，P<0.05），肯定了PYCR1在胃癌患者中的檢測價值及其與胃癌疾病分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的相關(guān)性。AGS、SGC-790及MGC-803細(xì)胞的si-PYCR1組細(xì)胞克隆數(shù)及細(xì)胞穿膜數(shù)均低于si-NC組，凋亡細(xì)胞率均高于si-NC組（P<0.0.5），進(jìn)一步肯定了PYCR1表達(dá)對于胃癌腫瘤細(xì)胞的增殖、侵襲等方面的影響。PYCR1在脯氨酸代謝過程中，極大地影響到氧自由基的代謝，進(jìn)而通過影響鈣調(diào)磷酸激酶途徑來達(dá)到影響腫瘤細(xì)胞增殖的目的[17-20]。

綜上所述，PYCR1在胃癌細(xì)胞中呈現(xiàn)高表達(dá)，且與疾病分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況均呈正相關(guān)，干擾PYCR1可有效控制其增殖及遷移侵襲。

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（收稿日期：2020-09-30） （本文編輯：田婧）