基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)探討潛陽封髓丹治療慢性阻塞性肺疾病的潛在分子機(jī)制

于海洋，陳云志，朱 星，劉懷全，趙 潔，張旭飛，李 文

貴州中醫(yī)藥大學(xué)(貴州 貴陽 550025)

慢性阻塞性肺病(COPD)是支氣管、肺泡、肺泡間質(zhì)等部位的呼吸系統(tǒng)慢性炎癥性疾病，以咳嗽、咯痰、胸悶、氣流受限為主要臨床表現(xiàn)，且氣流受限等癥狀會(huì)隨病程的延長(zhǎng)而呈現(xiàn)進(jìn)行性加重的趨勢(shì)，甚至?xí)l(fā)肺心病，嚴(yán)重影響患者的日常生活。目前，COPD已經(jīng)成為一個(gè)嚴(yán)重的健康問題，流行病學(xué)調(diào)查顯示[1]，我國中青年人群的COPD患病率達(dá)13.7%。臨床主要以控制性氧療、口服支氣管擴(kuò)張劑、霧化吸入激素、注射抗炎藥物等手段為主，雖在一定程度上緩解癥狀但預(yù)后欠佳。我國傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)在治療COPD的過程中取得了不錯(cuò)的效果，特別是在緩解臨床癥狀、改善預(yù)后等方面尤為突出。

中醫(yī)認(rèn)為COPD應(yīng)歸屬“肺脹”“喘癥”“咳嗽”等范疇，其病理性質(zhì)以本虛標(biāo)實(shí)、上實(shí)下虛為主[2]。有統(tǒng)計(jì)表明[3]COPD患者有較大概率出現(xiàn)消瘦、潮熱、咽喉不利、咳嗽、氣喘、遺尿等癥狀。潛陽封髓丹出自許國禎所撰《御藥院方》，由黃柏、砂仁、甘草組成。其中黃柏性味苦性寒，既可入心使心火不亢，使肺金無心火煩擾之憂，又可稟天冬寒水下滋腎水，有補(bǔ)虛瀉實(shí)之妙。砂仁，味辛性溫、無毒，入脾、肺、腎等經(jīng)，主咳嗽脹滿、溫化寒痰、腹痛心疼、下氣之功，其性溫而不傷于熱，行氣而不傷于克，可健脾以祛痰之源。甘草健脾益氣、祛痰潤(rùn)肺，又可調(diào)和諸藥三藥合力清上潤(rùn)下，祛痰行氣恰中病機(jī)。清代火神派醫(yī)家鄭欽安十分推崇此方，認(rèn)為此方可治一切咳嗽、喘促、面腫、喉痹、耳腫、目赤、鼻塞、遺尿等上實(shí)下虛之證。臨床上，有醫(yī)家將此方用于肺結(jié)核[4]、肺心病[5]等疾病，獲得了較為理想的療效。

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)是近年來新興的藥物研究手段，兼顧了中藥多成分多靶點(diǎn)等特點(diǎn)，可從分子水平上探究藥物與疾病的相互作用，有利于整體而全面的認(rèn)知藥物的潛在作用機(jī)制。故本文擬基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的角度尋找潛陽封髓丹治療COPD的潛在靶點(diǎn)，為臨床用藥提供新的思路及方法。

1 材料與方法

1.1潛陽封髓丹活性成分及作用靶點(diǎn)的篩選通過中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫與分析平臺(tái)數(shù)據(jù)庫TCMSP(http://tcmspw.com/)下載黃柏、砂仁、甘草的數(shù)據(jù)，并以類藥性(DL)>0.18、口服生物利用度(OB)>30為條件篩選出三者的主要活性成分及藥物靶點(diǎn)，并在 Uniprot數(shù)據(jù)庫(http://www.uniprot.org/)中，對(duì)已獲取的靶點(diǎn)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理。

1.2COPD靶點(diǎn)的獲取從TTD數(shù)據(jù)庫(http://db.idrblab.net/ttd/)、DisGeNET數(shù)據(jù)庫(http://www.disgenet.org/web/DisGeNET/menu/home)、MalaCards(https://www.malacards.org/)等數(shù)據(jù)庫中查找COPD的疾病基因，合并后去除重復(fù)值。

1.3成分及靶點(diǎn)的網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建將篩選后的數(shù)據(jù)導(dǎo)入Cytoscape 3.8.0構(gòu)建藥物—成分—疾病靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖。

1.4蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)相互作用關(guān)系網(wǎng)絡(luò)圖(PPI)的構(gòu)建將潛陽封髓丹與COPD的交集基因?qū)隨TRING數(shù)據(jù)庫獲取蛋白之間的結(jié)合度數(shù)據(jù)，并將數(shù)據(jù)導(dǎo)入Cytoscape 3.8.0實(shí)現(xiàn)可視化。

1.5、基因本體(GO)功能、京都基因與基因組百科全書(KEGG) 通路分析使用DAVID 6.8數(shù)據(jù)庫對(duì)潛陽封髓丹治療COPD的靶點(diǎn)進(jìn)行GO、 KEGG分析，并設(shè)定物種為“Homo sapiens”[6]。借助R語言對(duì)兩者的結(jié)果進(jìn)行可視化處理。

1.6分子對(duì)接將藥物成分中Degree值最高的化合物與PPI中Degree值最高的靶點(diǎn)導(dǎo)入PYMOL及AUTODOCK_VINA等軟件進(jìn)行對(duì)接，并以結(jié)合能的數(shù)值評(píng)估對(duì)接效果。分子對(duì)接過程中受體與配體的親和力越好，則其結(jié)合能越低。本研究將結(jié)合能(affinity)≤-5.0 kcal/moL作為有效分子對(duì)接的篩選條件[7]。

2 結(jié)果

2.1潛陽封髓丹化學(xué)成分篩選及靶點(diǎn)收集結(jié)果在TCMSP數(shù)據(jù)庫中按照篩選條件獲得114個(gè)潛陽封髓丹的化學(xué)成分。并利用Cytoscape 3.8.0軟件繪制化學(xué)成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖(圖1)。圖中包括961條邊和225個(gè)節(jié)點(diǎn)，其中225個(gè)節(jié)點(diǎn)由114個(gè)化學(xué)成分(淺綠色三角形)和111個(gè)靶點(diǎn)(淡藍(lán)色六邊形)組成。

圖1 化學(xué)成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖

2.2潛陽封髓丹化學(xué)成分治療COPD的靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)

通過DisGeNET、TTD、Malacard數(shù)據(jù)庫共獲取1 494個(gè)COPD相關(guān)靶點(diǎn)。利用R語言得到48個(gè)潛陽封髓丹化學(xué)成分治療COPD的相關(guān)靶點(diǎn)(圖2)。

圖2 共同靶點(diǎn)韋恩圖

2.3成分及靶點(diǎn)的網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建使用Cytoscape 3.8.0軟件進(jìn)一步構(gòu)建潛陽補(bǔ)髓丹化學(xué)成分-COPD-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖(圖3)。涉及141個(gè)節(jié)點(diǎn)和619條邊，141個(gè)節(jié)點(diǎn)由91個(gè)化學(xué)成分(綠色三角形)、48個(gè)靶點(diǎn)(紫色圓形)、1個(gè)疾病(黃色四邊形)和1個(gè)方名組成(粉色四邊形)。通過Network Analysis功能模塊對(duì)網(wǎng)絡(luò)圖進(jìn)行分析，各個(gè)節(jié)點(diǎn)的拓?fù)鋮?shù)，見表1。

圖3 藥物成分-COPD-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖

表1 活性化合物-COPD-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)中Degree值較高的核心化合物

2.4PPI構(gòu)建結(jié)果在String數(shù)據(jù)庫中獲得潛陽補(bǔ)髓丹治療COPD的PPI網(wǎng)絡(luò)，并利用Cytoscape 3.8.0軟件進(jìn)一步可視化(圖4)。PPI網(wǎng)絡(luò)圖包含68個(gè)靶點(diǎn)和618條邊，靶點(diǎn)越大和顏色越綠表示相應(yīng)靶點(diǎn)的Degree值越高，PPI網(wǎng)絡(luò)的拓?fù)鋮?shù)，見表2。

圖4 PPI網(wǎng)絡(luò)圖

表2 PPI核心靶點(diǎn)及拓?fù)鋮?shù)

2.5生物學(xué)功能和通路分析結(jié)果通過DAVID數(shù)據(jù)庫對(duì)潛陽封髓丹治療COPD的相關(guān)靶點(diǎn)進(jìn)行GO功能和KEGG分析。GO功能分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)48個(gè)靶點(diǎn)涉及413個(gè)富集結(jié)果(P<0.05)，主要涉及細(xì)胞凋亡的調(diào)控、細(xì)胞增殖調(diào)控、氮化合物代謝過程的調(diào)控、乙酰膽堿、類固醇激素受體活性。KEGG分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)48個(gè)靶點(diǎn)參與15條信號(hào)通路過程(P<0.05)，主要涉及erbb信號(hào)通路、toll樣受體信號(hào)通路、 MAPK信號(hào)通路、 p53信號(hào)通路等。本研究按照Count值大小篩選排名前15位的GO功能柱狀圖和KEGG信號(hào)通路圖展示，見圖5，圖6。

圖5 GO功能分析圖

圖6 KEGG分析圖

2.6分子對(duì)接從RCSB PDB數(shù)據(jù)庫(http://www.rcsb.org/)與TCMSP數(shù)據(jù)庫中獲取IL-6與槲皮素的分子結(jié)構(gòu)，并進(jìn)行對(duì)接(圖7)。對(duì)接后發(fā)現(xiàn)兩者的結(jié)合能為-21.338 kcal/moL，提示潛陽封髓丹中的活性化合成分與COPD的核心靶點(diǎn)之間有良好的結(jié)合能力。

圖7 分子對(duì)接圖

3 討論

龔?fù)①t在《壽世保元》中記載：“熱生于心，痰生于火?；鹫咛抵o則伏于脾土動(dòng)則發(fā)于肺金，乃心火克制肺金或寒邪停留肺，寒化為熱，必生痰喘，咳逆上氣肺脹”。肺脹是多種慢性肺系疾病久治不愈而成，久病必虛，故臨床須在解決痰濁、氣滯等因素時(shí)還應(yīng)兼顧補(bǔ)虛。潛陽封髓丹由黃柏、砂仁、甘草組成，可從肺脾腎三臟同時(shí)施治，有祛痰行氣、清熱滋陰之功。

現(xiàn)代研究表明[8]COPD的發(fā)展受多種因素影響，尤其是炎癥、氧化應(yīng)激反應(yīng)的增強(qiáng)會(huì)加重患者的氣道高反應(yīng)、氣道重塑等臨床表現(xiàn)。白細(xì)胞介素-6(IL-6)是多功能促炎因子，有凝聚膠原蛋白，促進(jìn)氣道纖維結(jié)締組織形成及平滑肌增生,抑制細(xì)胞外基質(zhì)分解，刺激成纖維細(xì)胞增殖等作用[9]。腫瘤壞死因子-α(TNF-α)可破壞患者小氣道和肺組織正常結(jié)構(gòu)與功能。轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1(TGF-β1)可通過調(diào)控α-平滑肌肌動(dòng)蛋白(α-SMA)抑制多種細(xì)胞增殖并誘導(dǎo)上皮細(xì)胞凋亡，同時(shí)又可以誘導(dǎo)間質(zhì)樣細(xì)胞增殖和向肌成纖維細(xì)胞分化,進(jìn)而促進(jìn)組織纖維化形成[10]。在COPD的炎癥過程中，血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子促進(jìn)缺氧誘導(dǎo)因子(HIF-1)表達(dá)進(jìn)而誘導(dǎo)血管生成[11]。同時(shí)超氧化物歧化酶(SOD)、活性氧(ROS)、丙二醛(MDA)、一氧化氮(NO)等氧化因素之間的失衡也是加重COPD進(jìn)展的另一重要因素[12]。

藥物-化合物-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)模型展示了潛陽封髓丹多成分多靶點(diǎn)的特點(diǎn)，經(jīng)進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)Degree值>10的化合物主要有：槲皮素、山柰酚、2-甲基-7-甲氧基異黃酮、甘草查爾酮、甘草查爾酮G、β-谷甾醇、豆甾醇。研究表明[13]槲皮素在50 mg/kg劑量下對(duì)COPD大鼠模型無明顯毒性，并可以降低IL-6、TGF-β1、α-SMA和TNF-α等的表達(dá)，對(duì)大鼠肺泡細(xì)胞凋亡，肺組織炎癥和纖維化損傷有明顯的緩解作用。查爾酮與甲氧基異黃酮均為黃酮類化合物，具有抗炎、抗菌、抗氧化、抗腫瘤等多種藥理作用[14-15]。山柰酚是具有抗氧化、抗凋亡作用的黃酮類化合物，MDA含量及凋亡率均明顯減少，總抗氧化能力(T-AOC)含量明顯增加，減輕機(jī)體的氧化應(yīng)激損傷[16]。β-谷甾醇能明顯抑制肺中惡性細(xì)胞的生長(zhǎng)，同時(shí)可將細(xì)胞周期進(jìn)展停滯于G2/M期，并引起細(xì)胞凋亡性死亡，進(jìn)而維護(hù)正常的細(xì)胞周期[17-18]。

結(jié)果顯示ESR1、IL-6作為COPD患者的炎癥標(biāo)志物在急性發(fā)作期間異常增高[19]。VEGFA、EGFR與氣道黏液高分泌有關(guān)，黏液高分泌會(huì)導(dǎo)致氣道阻力增加、肺功能下降，促進(jìn)細(xì)菌在氣道內(nèi)繁殖，同時(shí)也影響正常的清除功能，形成惡性循環(huán)。原癌基因 (myc)及CCND1在COPD患者成纖維細(xì)胞增殖中呈過度表達(dá)，這可能是患者氣道重塑的作用機(jī)制之一[20-21]。PPARG基因?yàn)檫^氧化物酶體增生激活受體γ(PPARγ)的編碼基因，正常情況下PPAR γ在支氣管上皮細(xì)胞、肺泡上皮細(xì)胞、支氣管黏膜下層、成纖維細(xì)胞中常呈低表達(dá)趨勢(shì)，若其高表達(dá)則表現(xiàn)出膠原沉積、 肺纖維化明顯等現(xiàn)象[22]。Rel A對(duì)NF-κB通路的活性進(jìn)行調(diào)節(jié)，因其修飾方式不同會(huì)造成不同的結(jié)果，故還有待進(jìn)一步研究。

對(duì)生物功能及KEGG信號(hào)通路進(jìn)行富集分析，發(fā)現(xiàn)潛陽封髓丹可能通過erbb信號(hào)通路、toll受體信號(hào)通路、 MAPK信號(hào)通路、 p53信號(hào)通路干預(yù)COPD患者的進(jìn)展。有文獻(xiàn)表明[23]erbb通路的高表達(dá)會(huì)促進(jìn)人類呼吸道上皮細(xì)胞分泌黏液。toll受體通路的激活可加重患者的炎癥損傷[24]。MAPK通路可通過促進(jìn)炎癥反應(yīng)及肺動(dòng)脈高壓的形成推動(dòng)COPD的發(fā)展[25]。肺泡上皮細(xì)胞凋亡與p53蛋白表達(dá)增加是COPD發(fā)病過程中較為常見的現(xiàn)象，肺組織p53蛋白表達(dá)與肺泡上皮細(xì)胞凋亡呈正相關(guān)，使用p53抑制劑后可明顯觀察到p53蛋白表達(dá)與肺泡上皮細(xì)胞凋亡減少[26]。

綜上所述，潛陽封髓丹具有多成分、多靶點(diǎn)等特點(diǎn)，可從多種途徑改善COPD的炎癥、氧化應(yīng)激反應(yīng)，抑制氣道重塑，清除氣道內(nèi)高分泌黏液，減輕患者的臨床癥狀。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)是基于大數(shù)據(jù)進(jìn)行系統(tǒng)性、整體性的藥物分析，其本質(zhì)與中醫(yī)理論中的“整體觀念”有異曲同工之妙，不僅可以用來尋找藥物作用于疾病的潛在靶點(diǎn)，還可評(píng)估傳統(tǒng)藥物創(chuàng)新用法的可行性。因潛陽封髓丹可緩解COPD所造成的肺心病，且COPD患者臨床中也易出現(xiàn)虛陽上越之癥，故潛陽封髓丹有改善COPD患者臨床癥狀的潛力。本研究用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)驗(yàn)證發(fā)現(xiàn)，潛陽封髓丹可通過抑制炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激損傷、氣道內(nèi)黏液異常分泌、肺動(dòng)脈高壓的形成等途徑改善COPD患者的預(yù)后。后續(xù)，課題組將結(jié)合分子生物學(xué)、生物信息學(xué)設(shè)計(jì)系統(tǒng)嚴(yán)謹(jǐn)?shù)呐R床及動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，進(jìn)一步明確潛陽封髓丹在治療COPD中的作用機(jī)制。