黃芩苷對H9C2心肌細胞缺氧損傷的保護作用機制研究

崔春婷，張建麗，黃 穎

黃芩(Scutellariae Radix)是我國的一味傳統(tǒng)中藥，來源于唇形科黃芩屬植物黃芩(scutellaria baicalensis georgi)根部，迄今已有2 000多年的用藥歷史[1]。有研究表明，黃芩的主要有效成分是黃酮類化合物，主要包括黃芩苷(baicalin)、黃芩素(baicalein)和漢黃芩素(wogonin)等[2]。多項研究表明，黃芩中的黃芩苷具有顯著的抗腫瘤活性及保護心血管作用[3-5]，但對心肌保護的具體機制尚不明確。微小RNA(microRNA，miRNA)是一類長度為18～23個核苷酸的單鏈RNA分子，有研究表明，miRNA參與多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程，在信號通路和基因調(diào)控方面具有重要的生物學作用[6]。相關(guān)研究表明，在心肌細胞缺氧損傷過程中，多種miRNA呈不同的變化趨勢，其中miR-133b上調(diào)有利于保護心肌細胞[7-9]。本研究探討黃芩苷對心肌細胞缺氧損傷的保護作用及分子機制。

1 材料與方法

1.1 實驗藥物與試劑 黃芩苷購自普瑞法科技公司(批號：21967-41-9)，CoCl2購自國藥集團，DMEM培養(yǎng)基和胎牛血清購自Gibco公司。實驗用一抗購自Abcam公司，稀釋比例1∶1 000。所有二抗和β-actin一抗購自中杉金橋公司。實驗用小干擾RNA由百奧邁科公司設(shè)計并合成。

1.2 實驗儀器 熒光倒置顯微鏡(日本奧林巴斯)，細胞培養(yǎng)瓶T-25(美國Corning)，六孔板(美國Corning)，流式細胞儀(美國BD)。

1.3 實驗方法

1.3.1 細胞培養(yǎng) H9C2細胞使用含10%胎牛血清和100 U/mL青霉素-鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基于37 ℃，5%CO2條件下培養(yǎng)。

1.3.2 缺氧復氧模型的構(gòu)建 參考文獻[10-11]選取CoCl2溶液5個梯度濃度(分別為400 μmol/L、600 μmol/L、800 μmol/L、1 000 μmol/L、1 200 μmol/L)作用于H9C2細胞22 h，之后使用完全培養(yǎng)液復氧2 h，檢測細胞活力，確定實驗用CoCl2濃度。

1.3.3 MTT實驗 取缺氧復氧后細胞，以每孔3 000個細胞密度接種于96孔板中，培養(yǎng)24 h，待細胞貼壁后，棄上清液，每孔加入20 μL MTT溶液，37 ℃孵育4 h，棄掉MTT，每孔加入200 μL的二甲基亞砜(DMSO)于震蕩儀上震蕩溶解15 min，使用酶標儀于570 nm處測定吸光度，計算細胞增殖率。

1.3.4 流式細胞術(shù) 收集經(jīng)處理的H9C2心肌細胞，磷酸緩沖鹽溶液(PBS)洗滌細胞兩次，加入490 μL結(jié)合緩沖液重懸細胞，之后分別加入5 μL的Annexin V-FITC和5 μL的PI染液，室溫避光孵育30 min，使用流式細胞儀檢測。

1.3.5 蛋白質(zhì)印跡實驗 細胞以5×105/孔密度接種于6孔板中，經(jīng)不同處理后，裂解并提取細胞總蛋白，使用BCA法測定蛋白濃度，具體步驟參考BCA試劑盒，蛋白電泳上樣質(zhì)量為每樣本30 mg，具體步驟參考文獻[12]。

1.3.6 實時熒光定量聚合酶鏈式反應(PCR) 經(jīng)過不同處理后，H9C2細胞中加入Trizol試劑，根據(jù)試劑盒說明提取總RNA，之后逆轉(zhuǎn)錄成cDNA模板后上機檢測。

1.4 統(tǒng)計學處理 采用SPSS 13.0軟件進行統(tǒng)計學分析，計量資料以均數(shù)±標準差(x±s)表示，采用t檢驗。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié) 果

2.1 H9C2細胞缺氧復氧損傷模型 使用1 000 μmol/L的CoCl2處理細胞22 h后，細胞活力為50%～60%，細胞活力下降程度適中，后續(xù)實驗均采用此濃度建立H9C2心肌細胞缺氧復氧損傷模型。詳見圖1。

圖1 不同濃度CoCl2建立心肌細胞缺氧復氧模型

2.2 黃芩苷對CoCl2誘導H9C2細胞活力的影響 使用不同濃度黃芩苷(分別為10 mg/L、25 mg/L、50 mg/L、100 mg/L)和40 mg/L陽性藥物丹參酮ⅡA磺酸鈉預處理H9C2細胞0 h、24 h、48 h、72 h后，以1 000 μmol/L的CoCl2缺氧后復氧細胞。采用MTT法檢測細胞活力。經(jīng)黃芩苷預處理的細胞具有較高的細胞活力，預處理24 h時開始，各濃度組與0 h比較，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)，但均未超過陽性對照組，詳見圖2。黃芩苷保護H9C2細胞活力具有濃度依賴性和時間依賴性。

與0 h比較，＊P<0.01。

2.3 黃芩苷對CoCl2誘導的H9C2細胞凋亡的影響 使用不同濃度黃芩苷(10 mg/L、25 mg/L、50 mg/L、100 mg/L)和40 mg/L陽性藥物丹參酮ⅡA磺酸鈉預處理H9C2細胞24 h后按1 000 μmol/L的CoCl2使細胞缺氧后復氧。采用蛋白質(zhì)印跡實驗檢測細胞Bax、Caspase-3和Bcl-2蛋白表達水平。經(jīng)黃芩苷預處理的細胞具有較低的Caspase-3和Bax蛋白水平(P<0.01)和較高的Bcl-2蛋白水平(P<0.01)，但未超過陽性藥物對照，詳見圖3。流式細胞術(shù)檢測黃芩苷抑制心肌細胞凋亡具有濃度依賴性，詳見表1。

圖3 不同濃度黃芩苷和丹參酮ⅡA磺酸鈉對細胞Bax、Caspase-3和Bcl-2蛋白水平的影響

表1 不同濃度黃芩苷和丹參酮ⅡA磺酸鈉抑制心肌細胞凋亡的能力(x±s)

2.4 黃芩苷對miR-133b的影響 使用不同濃度黃芩苷(10 mg/L、25 mg/L、50 mg/L、100 mg/L)預處理H9C2細胞24 h后按1 000 μmol/L的CoCl2使細胞缺氧后復氧，采用實時熒光定量PCR檢測miR-133b表達情況。經(jīng)黃芩苷預處理的細胞具有較高的miR-133b表達水平(P<0.01)，且呈濃度依賴性和時間依賴性。詳見圖4。

圖4 不同濃度黃芩苷處理H9C2細胞不同時間miR-133b表達情況

2.5 黃芩苷保護心肌細胞依賴miR-133b的表達 使用商品化miR-133b抑制劑抑制H9C2細胞內(nèi)源性miR-133b表達，詳見圖5。抑制miR-133b表達24 h后，以不同濃度黃芩苷(10 mg/L、25 mg/L、50 mg/L、100 mg/L)預處理H9C2細胞0 h、24 h、48 h和72 h，之后按1 000 μmol/L的CoCl2使細胞缺氧后復氧。使用蛋白印跡實驗檢測Bax、Caspase-3和Bcl-2蛋白表達水平，miR-133b敲減后，黃芩苷對Caspase-3、Bax和Bcl-2蛋白水平無顯著影響。詳見圖6。

與陽性對照藥物比較，＊P<0.05。

圖6 敲減miR-133b后黃芩苷對Caspase-3、Bax和Bcl-2蛋白水平的影響

3 討 論

黃芩是我國歷史悠久的傳統(tǒng)中藥材，具有清熱燥濕、瀉火解毒、止血安胎的功效。目前臨床使用黃芩與其他傳統(tǒng)中藥材配伍治療多種感染性疾病和過敏性疾病等。黃芩苷是黃芩中主要的有效成分之一，有研究證明黃芩苷具有抗氧化和抗腫瘤等生物學功能[13-14]。

心肌梗死是嚴重威脅人類生命健康的常見疾病，心肌細胞缺氧是引起心肌細胞凋亡進而導致心肌梗死的重要原因[15-16]。本研究參考相關(guān)文獻[11]，利用CoCl2處理心肌細胞H9C2建立缺氧損傷模型，研究不同濃度黃芩苷對心肌細胞缺氧損傷的保護作用。本研究結(jié)果表明，黃芩苷可顯著提高心肌細胞H9C2細胞活力，并抑制心肌細胞凋亡，其作用呈濃度依賴性。為進一步探討黃芩苷保護心肌細胞的分子機制，本研究測定心肌細胞損傷相關(guān)miRNA表達情況。結(jié)果表明，黃芩苷預處理后的H9C2細胞miR-133b水平高表達，且這些細胞在缺氧復氧中表現(xiàn)出較高的細胞活力和較低的凋亡比例。為進一步分析與miR-133b相關(guān)的分子機制，本研究使用人工合成的特異性miR-133b抑制劑抑制細胞內(nèi)源性miR-133b表達，結(jié)果證明，miR-133b被抑制后，黃芩苷對心肌細胞凋亡的保護作用消失。

綜上所述，黃芩苷對CoCl2引起的心肌細胞缺氧復氧損傷具有保護作用，可提高細胞活力和抑制細胞凋亡。miR-133b在黃芩苷保護作用中發(fā)揮了重要功效，黃芩苷通過提高細胞內(nèi)miR-133b表達進而發(fā)揮保護心肌細胞的作用。