乳酸片球菌的抑菌能力及其對斷奶仔豬腸道菌群及黏膜免疫的影響

周登峰 劉雪連 劉 瀅 甘大維*

1.武漢大北農(nóng)農(nóng)牧發(fā)展有限公司，武漢430000；2.北京市飼料安全生物調(diào)控工程技術(shù)研究中心，北京100192

新生期和斷奶期是限制我國集約化、規(guī)?；B(yǎng)豬生產(chǎn)效率的2 個(gè)關(guān)鍵環(huán)節(jié)，改善新生和斷奶仔豬腸道健康，避免或減少腸道病原微生物感染是養(yǎng)豬生產(chǎn)中亟待解決的重大課題[1-2]。有報(bào)道[3-7]稱乳酸片球菌在抑制病原菌生長、改善腸道微生物群落結(jié)構(gòu)、刺激宿主免疫等方面表現(xiàn)出良好的益生性能，但是相比較其他益生菌，該菌在斷奶仔豬上的應(yīng)用報(bào)道較少。本試驗(yàn)研究乳酸片球菌SKL-03 的體外抑菌能力及其對斷奶仔豬腸道微生物菌群和免疫能力的影響，以期為乳酸片球菌制劑在斷奶仔豬生產(chǎn)中的應(yīng)用提供理論和實(shí)踐依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材 料

1）菌株。試驗(yàn)用乳酸片球菌SKL-03 分離于健康斷奶仔豬糞便；大腸桿菌k88、豬霍亂沙門氏菌ATCC13312、金黃色葡萄球菌ATCC6538 均由飼用微生物工程國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保存。乳酸片球菌SKL-03試驗(yàn)品：發(fā)酵液和凍干粉（活菌數(shù)≥5×108cfu/g）；上清液：發(fā)酵液經(jīng)10 000 r/min，3 min 離心后的上清液；由北京大北農(nóng)科技集團(tuán)股份有限公司飼用微生物工程國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室制備。

2）試驗(yàn)試劑。MRS 培養(yǎng)基（青島奧博星）、NB 培養(yǎng)基（青島奧博星）、脫脂乳粉、谷氨酸鈉、抗壞血酸、蔗糖、海藻糖（北京綠琪生物科技有限公司）、乳酸、乙酸標(biāo)準(zhǔn)品（sigma 公司）。

1.2 抑菌性能

1）試驗(yàn)設(shè)計(jì)。發(fā)酵液組：乳酸片球菌SKL-03 發(fā)酵液（含活菌數(shù)5×108cfu/mL）；凍干粉組：乳酸片球菌SKL-03 凍干粉（含活菌數(shù)5×108cfu/mL）；上清液組：乳酸片球菌SKL-03 發(fā)酵液經(jīng)10 000 r/min，3 min 離心后的上清液；培養(yǎng)基組：MRS 培養(yǎng)基；凍干保護(hù)劑組：凍干保護(hù)劑（脫脂乳粉15%、谷氨酸鈉1.5%、抗壞血酸1%、蔗糖2%、海藻糖7%）。

2）試驗(yàn)方法。有機(jī)酸測定：HPLC 法；流動(dòng)相：0.05%硫酸溶液；色譜柱：C18 柱；流速：1 mL/min，紫外檢測器，210 nm。樣品過0.45 μm 的濾膜后，上機(jī)檢測。

牛津杯法[8]：將已滅菌的LB 瓊脂培養(yǎng)基加熱到完全融化，倒在培養(yǎng)皿內(nèi)，每皿15 mL（下層），待其凝固。此外，將融化的培養(yǎng)基冷卻到50 ℃左右混入致病菌（大腸桿菌、沙門氏菌、金黃色葡萄球菌）濃度約為1×108cfu/mL，將混有致病菌的培養(yǎng)基5 mL加到已凝固的培養(yǎng)基上待凝固（上層）。用無菌水將待檢樣品稀釋：乳酸片球菌SKL-03 發(fā)酵液稀釋成0.1 mL/mL、凍干粉0.1 g/mL、上清液0.1 mL/mL；在培養(yǎng)基表面垂直放上牛津杯，在杯中加入培養(yǎng)基空白及待檢樣品各150 μL，加滿后在37 ℃培養(yǎng)16~18 h；游標(biāo)卡尺測量抑菌圈大小。

1.3 動(dòng)物功效試驗(yàn)

1）試驗(yàn)動(dòng)物與試驗(yàn)設(shè)計(jì)。將90 頭體重、性別比例相近的21日齡杜長大斷奶仔豬隨機(jī)分為4 組，A組：飼喂基礎(chǔ)日糧；B 組：飼喂基礎(chǔ)日糧+乳酸片球菌SKL-03 菌粉1 kg/t；C 組：飼喂基礎(chǔ)日糧+乳酸片球菌SKL-03 上清液1 L/t；D 組：飼喂基礎(chǔ)日糧+乳酸片球菌SKL-03 發(fā)酵液1 L/t。每組6 個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)3 頭豬，試驗(yàn)期49 d。

2）試驗(yàn)飼糧及飼養(yǎng)管理。試驗(yàn)基礎(chǔ)日糧為玉米-豆粕型日糧，參照NCR（2012）7~11、11~25 kg 階段豬營養(yǎng)需要配制，基礎(chǔ)日糧組成及營養(yǎng)水平見表1。本試驗(yàn)在武漢綠色巨農(nóng)農(nóng)牧股份有限公司進(jìn)行，養(yǎng)殖及防疫程序按豬場規(guī)定進(jìn)行。

表1 基礎(chǔ)飼糧組成及營養(yǎng)水平（風(fēng)干基礎(chǔ)）

3）樣品采集與處理。于試驗(yàn)第49 天結(jié)算飼糧，所有豬只禁食12 h。試驗(yàn)第50 天對所有試驗(yàn)豬進(jìn)行稱重并記錄，按順序屠宰。采集十二指腸、空腸黏膜樣品和結(jié)腸、盲腸食糜樣品，液氮速凍后置于-80 ℃冰箱保存。

4）腸道微生物群落。采用實(shí)時(shí)熒光定量法[9]測定得到斷奶仔豬結(jié)腸和盲腸中大腸桿菌、沙門氏菌和乳酸桿菌的數(shù)量。

5）免疫功能。十二指腸和空腸黏膜中SigA 的含量采用豬分泌型免疫球蛋白A（SigA）酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)試劑盒檢測。

1.4 數(shù)據(jù)分析

使用SPASS 20.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行單因素方差分析，數(shù)據(jù)以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤差”表示，P＜0.05 為差異顯著，0.05≤P＜0.10 為有顯著差異趨勢。

2 結(jié)果與分析

2.1 乳酸片球菌SKL-03 試驗(yàn)品對致病菌的抑制作用

由表2可知，相比于培養(yǎng)基組和凍干保護(hù)劑組，不同試驗(yàn)品對致病菌均有顯著抑制作用（P＜0.05），乳酸片球菌SKL-03 發(fā)酵液組抑菌效果最佳，上清液組次之，凍干粉組抑菌圈直徑最小；不同試驗(yàn)品組抑菌圈直徑隨乳酸和乙酸含量的降低而下降。

表2 乳酸片球菌SKL-03 試驗(yàn)品有機(jī)酸含量及對指示菌的抑制效果

2.2 乳酸片球菌SKL-03 對斷奶仔豬腸道菌群的影響

由表3可知，與空白組相比，菌粉組、上清液組、發(fā)酵液組盲腸中的大腸桿菌和沙門氏菌的數(shù)量顯著降低（P＜0.05）、乳桿菌數(shù)量顯著提高（P＜0.05）；菌粉組、上清液組結(jié)腸中大腸桿菌數(shù)量顯著降低（P＜0.05），發(fā)酵組差異不顯著（P＞0.05）；各組間結(jié)腸中乳酸桿菌數(shù)量差異不顯著（P＞0.05）；菌粉組和發(fā)酵液組結(jié)腸中沙門氏菌數(shù)量顯著降低（P＜0.05），上清液無顯著差異（P＞0.05）。

表3 乳酸片球菌制劑對70日齡仔豬盲腸和結(jié)腸菌群的影響

2.3 乳酸片球菌SKL-03 對斷奶仔豬十二指腸和空腸SIgA 的影響

由表4可知，與空白組相比，上清液組、發(fā)酵液組十二指腸黏膜中SIgA 含量顯著提高（P＜0.05），菌粉組差異不顯著（P＞0.05）；菌粉組、上清液組、發(fā)酵液組空腸黏膜中SIgA 含量顯著提高（P＜0.05），菌粉組對空腸黏膜中SIgA 含量影響最大，顯著高于上清液組和發(fā)酵液組（P＜0.05）。

表4 乳酸片球菌制劑70日齡仔豬十二指腸和空腸黏膜中SIgA 含量的影響

3 討 論

3.1 乳酸片球菌SKL-03 對致病菌的抑制作用

研究[10-12]表明，乳酸片球菌產(chǎn)生的有機(jī)酸和乳酸片球菌素等能有效抑制致病菌。本試驗(yàn)研究表明，乳酸片球菌SKL-03 菌粉、上清液、發(fā)酵液對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、沙門氏菌均有顯著的抑菌效果，這與王建設(shè)等[13]、Mduduzi[14]、陳亞男等[15]的研究結(jié)果相似；在牛津杯法抑菌試驗(yàn)中，發(fā)酵液組的抑菌效果最好，其次是上清液組；且抑菌能力與試驗(yàn)品中的有機(jī)酸含量有關(guān)，試驗(yàn)品種有機(jī)酸含量越高，抑菌圈直徑越大，表明乳酸片球菌可通過產(chǎn)生有機(jī)酸等抑菌物質(zhì)抑制病原菌的生長。

3.2 乳酸片球菌SKL-03 對斷奶仔豬腸道菌群的影響

斷奶應(yīng)激因降低仔豬腸道有益菌數(shù)量，增加有害菌數(shù)量而危害斷奶仔豬的健康[16]。諸多研究[17-20]表明，在斷奶仔豬飼糧中添加乳酸菌具有調(diào)節(jié)腸道微生物群、保持仔豬腸道微生物群穩(wěn)定的效果。本試驗(yàn)研究表明，與空白組相比，菌粉組、上清液組、發(fā)酵液組盲腸中的大腸桿菌和沙門氏菌的數(shù)量顯著降低（P＜0.05）、乳桿菌數(shù)量顯著提高（P＜0.05）；菌粉組、上清液組結(jié)腸中大腸桿菌數(shù)量顯著降低（P＜0.05），菌粉組和發(fā)酵液組結(jié)腸中沙門氏菌數(shù)量顯著降低（P＜0.05），乳酸桿菌數(shù)量差異不顯著（P＞0.05），這與學(xué)者們[21-24]的研究結(jié)果相似；這表明飼糧中添加乳酸片球菌及其代謝產(chǎn)物能夠抑制有害菌生長，改善腸道微生態(tài)環(huán)境。

3.3 乳酸片球菌SKL-03 對斷奶仔豬十二指腸和空腸SIgA 的影響

SIgA 具有對機(jī)體實(shí)現(xiàn)免疫保護(hù)的作用[16]，本試驗(yàn)結(jié)果表明，飼料中添加乳酸片球菌SKL-03 及其代謝產(chǎn)物可通過提高十二指腸及空腸黏膜中SIgA的含量來對機(jī)體實(shí)現(xiàn)免疫保護(hù)。

4 結(jié) 論

本試驗(yàn)條件下，乳酸片球菌SKL-03 菌粉、上清液、發(fā)酵液具有抑制病原菌生長的作用，在飼糧中添加上述試驗(yàn)品具有降低腸道致病菌的數(shù)量，提高有益菌數(shù)量和小腸黏膜免疫功能的效果。