李法君,付春鵬,劉 杰,李宗珍,王愛麗,喬 寧
(濰坊科技學院賈思勰農(nóng)學院,山東壽光 262700)
作為生命科學的核心課程,生物化學主要是應(yīng)用化學的理論和方法,在分子水平上闡明生物現(xiàn)象的一門科學。它既是學習生命科學的基礎(chǔ),又是研究生命本質(zhì)的前沿,在本科教學中起著舉足輕重的作用[1-3]。生物化學的眾多研究成果都是源于實驗基礎(chǔ),因此實驗課程是生物化學學習的重要環(huán)節(jié)[4]。而在生物化學實驗課中,如何提高學生的實驗技能,加強對理論知識的理解和應(yīng)用;如何提升學生的創(chuàng)新能力,建立發(fā)現(xiàn)問題、分析問題和解決問題的思維體系,為將來的科研工作打下基礎(chǔ),就成為當前生物化學實驗課程值得思考和探究的問題。
生物化學實驗通??煞譃榛A(chǔ)驗證性實驗和綜合性實驗。前者實驗結(jié)果是已知的,學生只要按照既定的實驗步驟完成實驗即可[5]。學生創(chuàng)新能力的培養(yǎng)和思維水平的提高主要是依靠綜合性實驗。而從實際授課情況來看,多數(shù)院校的綜合性實驗是獨立設(shè)立的,實驗項目之間沒有銜接性和過渡性;而且多數(shù)實驗內(nèi)容老舊,沒有與前沿的生物化學技術(shù)接軌,學生的綜合能力得不到提高[6-7]。
基于此,團隊成員以較為前沿的“基因組步移技術(shù)”為主線,將基因組DNA的提取、酶切連接、引物設(shè)計、聚合酶鏈式反應(yīng)(PCR)等實驗單元串聯(lián)成一個有機整體,形成一個內(nèi)容相關(guān)、層第推進、方法多樣的綜合性實驗,并且在實施過程中,可充分調(diào)動學生的能動性,取得良好的授課效果。
基因組步移是指通過分子生物學手段獲得已知核酸序列的側(cè)翼未知序列技術(shù),主要用于[8]:①根據(jù)目標基因的cDNA序列,克隆其啟動子序列和調(diào)控序列;②鑒定轉(zhuǎn)座子或轉(zhuǎn)座子的插入點;③染色體測序中的空隙填補等。目前,基于酶切連接的PCR法是最為常用的基因組步移方法。其原理是將基因組DNA 用限制性內(nèi)切酶進行酶切,然后用T4 連接酶將接頭序列加到酶切好的DNA 片段上。根據(jù)已知基因的cDNA 序列設(shè)計兩條引物(SP1 和SP2),用SP1 引物和已知的AP1 引物進行第1 輪PCR外擴;以外擴PCR產(chǎn)物為模板,用SP2 引物和AP2 引物進行第2 輪PCR 內(nèi)擴,獲得的PCR產(chǎn)物即為目的基因[9-10]。
本實驗以中華絨螯蟹(Eriocheir sinensis)的類胰島素促雄腺基因(Insulin-like androgenic gland hormone,IAG)為研究對象,通過基因組步移技術(shù)獲得Es-IAG的5'側(cè)翼序列。Es-IAG基因的cDNA序列來源于前期構(gòu)建的轉(zhuǎn)錄組文庫(NCBI-SRA 登錄號:SAMN06204640)[11]。
生物化學實驗課授課對象為農(nóng)學院生物技術(shù)專業(yè)大三本科生。課程將項目內(nèi)容分解為5 次課(見表1),包括4次實驗課和1次匯報總結(jié),課時數(shù)為12 學時,除PCR反應(yīng)為4學時外,其余均為2 學時,在固定的教學時間段內(nèi)都可完成,適合本科生的課堂教學安排。為了提高生物化學實驗課的教學效果,安排2人1組。
表1 實驗內(nèi)容及安排
剪切中華絨螯蟹約20 mg的肌肉組織,勻漿破碎。加入200 μL Buffer GA,20 μL Proteinase K,55 °C溫浴,將組織完全溶解。然后按DNA提取試劑盒說明進行操作。
將DNA進行酶切,體系如下:基因組DNA 5 μL,內(nèi)切酶1.6 μL,Buffer 2 μL,dd H2O 補足到20 μL。37 °C酶切過夜。將酶切后的DNA與接頭序列進行連接反應(yīng),體系如下:酶切產(chǎn)物4.7 μL,接頭2 μL,Buffer 0.8 μL,T4 連接酶0.5 μL,16 °C孵育1 h。
依據(jù)Es-IAG的cDNA序列,遵循引物設(shè)計的原則進行SP1 和SP 2 引物的設(shè)計。具體序列如表2 所示。
表2 基因組步移的引物序列
將連接液稀釋10 倍后,取1 μL 作為第1 輪反應(yīng)的模板。用SP1 于AP1 配合進行第1 輪外擴,然后取外擴產(chǎn)物稀釋100 倍后,取2 μL作為第2 輪反應(yīng)的模板。PCR反應(yīng)體系如下:dd H2O 20.5 μL,PCR Buffer 2.5 μL,dNTP 0.5 μL,AP 引物0.5 μL,SP 引物0.5 μL,Polymerase Mix 0.5 μL。第1 輪反應(yīng)程序如下:7個循環(huán):94 °C 25 s,72 °C 3 min,32 個循環(huán):94 °C 25 s,67 °C 3 min,67 °C 終延伸7 min。第2 輪反應(yīng)程序如下:5 個循環(huán):94 °C 25 s,72 °C 3 min,20 個循環(huán):94 °C 25 s,67 °C 3 min,67 °C 終延伸7 min。瓊脂糖檢測反應(yīng)產(chǎn)物,然后送公司測序[12-13]。
對各個小組的實驗結(jié)果進行比較后,選取典型的實驗結(jié)果進行分析。通過兩輪PCR步移反應(yīng),獲得約1 000 bp的目的條帶(見圖1),將第2 輪PCR產(chǎn)物外送測序,測序結(jié)果如圖2 所示。
圖1 基因組步移結(jié)果
圖2 步移獲得的Es-IAG基因5'側(cè)翼序列(引物用灰色背景標出,起始密碼子ATG用下劃線標出)
無論動物、植物還是微生物,體內(nèi)的生化反應(yīng)都是一個復雜有序的整體,都遵循“中心法則”。因此,應(yīng)該從整體水平上來看待生物化學實驗課程。傳統(tǒng)的生物化學實驗課,往往都是獨立的單元,割裂了各單元之間的聯(lián)系。這種單元化教學模式的后果往往使學生獲得的知識也呈現(xiàn)單元化,沒有形成一個整體,進而影響了學生對生物化學理論知識的掌握,更無從談起靈活運用生物化學實驗技術(shù)。本實驗項目將基因組DNA的提取、酶切連接、引物設(shè)計和PCR 反應(yīng)等實驗單元串聯(lián)成一個整體,既考慮了實驗內(nèi)容和實驗方法的關(guān)聯(lián)性和完整性,又考慮了每個單元的相對獨立性。在實驗教學過程中,遵循循序漸進的原則,按照“DNA提取-酶切-鏈接-引物設(shè)計-PCR反應(yīng)-測序”的順序,安排實驗內(nèi)容。上一個實驗的產(chǎn)物是下一個實驗的原材料,環(huán)環(huán)相扣,在DNA水平將上述單元聯(lián)系在一起,突出了模塊教學的整體性,實現(xiàn)了實驗內(nèi)容和教學方法的有機融合。
生物化學實驗課除了提高學生的動手能力外,培養(yǎng)學生的發(fā)現(xiàn)問題、解決問題的能力也是實驗課的目標之一。在每個實驗之前,指導教師都引導學生閱讀相關(guān)的文獻資料,做到對實驗有較為清晰的理解,掌握實驗的基本原理,明確不同試劑在實驗中的作用。通過查閱文獻使學生明確本實驗與文獻中技術(shù)路線有何不同,讓學生帶著問題走進實驗室,如在DNA 提取實驗中,學生的問題主要為柱式提取法與傳統(tǒng)的酚仿的不同點;在酶切連接環(huán)節(jié),問題為完全酶切和不完全酶切對本次實驗是否有影響;在基因組步移環(huán)節(jié),問題為基于PCR技術(shù)的基因組步移方法有哪幾種;每種方法各自的優(yōu)缺點是什么。所有的問題都在匯報環(huán)節(jié)集中解決,先由學生自己根據(jù)所掌握的知識給出相應(yīng)的答案,如有不妥之處,由指導教師答疑釋惑。因此,模塊化的實驗課程設(shè)置體系和循序漸進的教學方式,不但可以使學生在實驗過程中變被動為主動,發(fā)揮主觀能動性,逐步提高發(fā)現(xiàn)問題、分析問題和解決問題的能力;而且還可以增強團隊意識和協(xié)作能力。
生物化學是一門與時俱進的學科,近年來由于科技不斷地發(fā)展,生物化學技術(shù)突飛猛進,特別是分子生物學技術(shù)取得了一系列的成果,如基因編輯技術(shù)-CRISPR/Cas9 系統(tǒng)[14-15]、核糖核酸(RNA)干擾技術(shù)[16]等。隨著生物科技產(chǎn)業(yè)化的發(fā)展,社會對生物方面的人才需求日益增長,不僅要求具有扎實的理論基礎(chǔ),而且更看重畢業(yè)生的“即插即用”能力。因此,不斷替換原有的實驗內(nèi)容,添加前沿性的實驗項目將是生物化學實驗課程面臨的重要課題?;诖?,團隊根據(jù)理論知識結(jié)合生物化學發(fā)展的現(xiàn)狀,開展了具有前沿性“基因組步移”模塊實驗,旨在提高學生的綜合科研能力,使其所學到的知識與本領(lǐng)能為將來走上工作崗位奠定良好的基礎(chǔ)。