玉木耳絡(luò)氨酸酶基因的克隆及表達(dá)分析

蘇文英，楊和川，譚一羅，惠林沖，秦裕營(yíng)，李 曉

(1.連云港市農(nóng)業(yè)科學(xué)院,江蘇 連云港 222006；2.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué) 食藥用菌教育部工程中心，吉林 長(zhǎng)春 130118)

酪氨酸酶(Tyrosinase)是一種含銅糖蛋白,一般也稱為多酚氧化酶,歸類于酪氨酸酶相關(guān)蛋白家族(Tyrosinase-related Protein)[1]。酪氨酸酶廣泛存在于微生物、動(dòng)植物及人體中,并發(fā)揮著重要的生理功能[2]。在真菌中,雙孢蘑菇的酪氨酸酶較早受到關(guān)注,在20世紀(jì)70年代,Turner 等就提出酪氨酸酶可能在雙孢蘑菇(Agaricusbisporus)黑色素的合成中發(fā)揮相當(dāng)重要的作用[3]；絡(luò)氨酸酶在氧氣的參與下,將酪氨酸氧化為多酚類化合物(如L-多巴)及多巴醌,多巴醌在一系列反應(yīng)后最終生成黑色素[4]。2016年賓夕法尼亞大學(xué)的楊亦農(nóng)教授利用基因編輯技術(shù)對(duì)雙孢蘑菇中控制褐變的多酚氧化酶基因進(jìn)行了基因編輯,并將該酶的活性降低了30%,使其抗褐變[5]。此外,真菌絡(luò)氨酸酶還與孢子的形成及穩(wěn)定性相關(guān)。有研究表明,絡(luò)氨酸酶在真菌菌絲無(wú)性生長(zhǎng)時(shí)期發(fā)揮重要的作用,其表達(dá)量在菌絲生長(zhǎng)期間逐漸上升，至子實(shí)體形成時(shí)開(kāi)始下降[6]。目前,香菇(Lentinusedodes)[7]、漏斗多孔菌(Polyporusarcularius)[8]等真菌中的絡(luò)氨酸酶基因已被克隆鑒定,為其在真菌內(nèi)的表達(dá)模式分析及功能研究提供了方便。

玉木耳(AuriculariacorneaEhrenb.),隸屬于木耳科木耳屬,是毛木耳的白色變種[9],其質(zhì)地脆嫩,美味可口,營(yíng)養(yǎng)豐富,且具有抗腫瘤等活性[10-11]。目前關(guān)于玉木耳的研究集中在栽培、生理活性及成分分析方面,對(duì)其分子遺傳學(xué)的研究還鮮有報(bào)道。鑒于此,我們?cè)诳寺∮衲径j(luò)氨酸酶基因(Actyr)的基礎(chǔ)上,還測(cè)定了玉木耳菌絲由營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)到生殖生長(zhǎng)整個(gè)過(guò)程中關(guān)鍵時(shí)期絡(luò)氨酸酶基因的相對(duì)表達(dá)量,從而對(duì)所有絡(luò)氨酸酶基因的功能進(jìn)行了系統(tǒng)分析，以期為深入研究絡(luò)氨酸酶基因在玉木耳子實(shí)體發(fā)育過(guò)程中的生物學(xué)功能提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試菌株

玉木耳菌絲材料由吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)食藥用菌教育部工程研究中心提供；大腸桿菌(E.coli)DH5α購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司。

1.2 試劑

UNlQ-10柱式Trizol總RNA抽提試劑盒(生工公司,上海); Phanta Max Super-Fidelity DNA Polymerase(諾唯贊生物科技股份有限公司,南京); SYBR PrimeScript TM RT-PCR Kit熒光定量試劑盒[寶生物工程(大連)有限公司,大連]； Peasy-T1 cloning vector(北京全式金生物技術(shù)有限公司,北京); AxyPrep DNA凝膠回收試劑盒(愛(ài)思進(jìn)生物技術(shù)有限公司,杭州)。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 玉木耳總RNA的提取及cDNA第一鏈的合成 用總RNA提取試劑盒提取玉木耳的RNA,具體操作參照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。采用凝膠電泳及微量測(cè)定儀NanoDrop ND-1000對(duì)提取獲得的RNA的濃度和純度進(jìn)行檢測(cè)。在檢測(cè)合格后于-80 ℃保存?zhèn)溆?。根?jù)試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄,所得cDNA于-20 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 玉木耳Actyr基因全長(zhǎng)序列的克隆 以逆轉(zhuǎn)錄獲得的cDNA為模板,利用RT-PCR技術(shù)擴(kuò)增得到Actyr基因的全長(zhǎng)cDNA序列。PCR引物序列如下:Actyr-F， ATGCCACAAGGTCACAGG;Actyr-R， TCAATCGTACTCGTAGCAC。引物由金唯智生物技術(shù)有限責(zé)任公司合成。PCR反應(yīng)體系為: ddH2O 17 μL、2 × Phanta Max Buffer 25 μL、dNTP Mix (10 mmol/L each) 1 μL、模板cDNA 2 μL、上下游引物各2 μL、Phanta Max Super-Fidelity DNA Polymerase (1 μg/μL) 1 μL。PCR擴(kuò)增反應(yīng)條件為:95 ℃預(yù)變性3 min;95 ℃變性30 s,55 ℃退火15 s,72 ℃延伸1 min,共30個(gè)循環(huán)。在PCR反應(yīng)結(jié)束后,將PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)正確后,利用凝膠回收試劑盒回收PCR產(chǎn)物,具體操作參照試劑盒說(shuō)明書(shū)。

1.3.3 擴(kuò)增產(chǎn)物的克隆及測(cè)序 將回收純化的產(chǎn)物連接T-vector,連接反應(yīng)體系為: Peasy-T1 cloning vector 1 μL、回收產(chǎn)物4 μL,反應(yīng)條件為25 ℃ 20 min。獲得的連接產(chǎn)物直接用于大腸桿菌轉(zhuǎn)化,轉(zhuǎn)化方法為熱激法。將轉(zhuǎn)化產(chǎn)物涂布于平板,在37 ℃過(guò)夜培養(yǎng)；挑取單菌落于5 mL LB(含Amp+)液體培養(yǎng)基中,在200 r/min、37 ℃條件下震蕩培養(yǎng)過(guò)夜。對(duì)重組克隆載體進(jìn)行菌液PCR鑒定。委托生工公司進(jìn)行菌液PCR測(cè)序。

1.3.4 基因序列的分析 根據(jù)克隆獲得的Actyr的核酸序列以及對(duì)應(yīng)的氨基酸序列,通過(guò)在線分析軟件在理論上對(duì)其進(jìn)行基因信息分析。

利用DNAMAN軟件對(duì)測(cè)序所得序列與Actyr基因序列進(jìn)行序列同源性分析;通過(guò)NCBI Conserved Domains進(jìn)行保守功能域分析;應(yīng)用PredictProtein軟件對(duì)Actyr蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析;應(yīng)用Protparam (http://expasy.org/tools/protparam.htmL)對(duì)其進(jìn)行分子量和等電點(diǎn)的預(yù)測(cè);應(yīng)用TMpred軟件(http://www.isrec.isb-sib.ch/software/tmpred_from.html)分析預(yù)測(cè)蛋白序列的跨膜區(qū);應(yīng)用SignalP 4. 1 (http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)預(yù)測(cè)信號(hào)肽;應(yīng)用Swiss-MODEL在線工具軟件對(duì)蛋白質(zhì)的三級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行成像分析。

1.3.5 基因表達(dá)量的測(cè)定 收集耳芽期、原基期、耳片期(耳片直徑2、3、4 cm)5個(gè)時(shí)期的材料,提取RNA,反轉(zhuǎn)錄后形成cDNA,保存于-20 ℃待用。以ACTIN基因?yàn)閮?nèi)參基因,采用SYBR PrimeScript TM RT-PCR Kit熒光定量試劑盒在ABI StepOne Plus型熒光定量PCR儀上進(jìn)行熒光定量檢測(cè)。擴(kuò)增條件: 95 ℃ 30 s; 95 ℃ 5 s,60 ℃ 20 s,循環(huán)40次；在72 ℃下單點(diǎn)檢測(cè)信號(hào)。對(duì)每個(gè)樣品設(shè)3次技術(shù)重復(fù),采用2-△△Ct法對(duì)各基因進(jìn)行相對(duì)定量分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 目的基因的擴(kuò)增與克隆鑒定

以玉木耳的基因組cDNA為模板，擴(kuò)增得到Actyr基因的全長(zhǎng)cDNA序列,經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳，所得結(jié)果與預(yù)期大小相符(圖1)。將PCR擴(kuò)增獲得的反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)電泳、回收、連接、轉(zhuǎn)化DH5α后,對(duì)獲得的單菌落進(jìn)行菌液PCR及測(cè)序，測(cè)序結(jié)果表明,克隆獲得的Actyr基因cDNA序列長(zhǎng)度為1113 bp,編碼371個(gè)氨基酸(圖2 );同時(shí),NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)的Conserved Domains分析結(jié)果(圖3)表明,Actyr屬于Tyrosinase基因家族。

M: DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)DNA marker DL2000。1～2: PCR產(chǎn)物。

2.2 Actyr基因的生物信息學(xué)分析

應(yīng)用PredictProtein軟件對(duì)Actyr蛋白質(zhì)進(jìn)行分析，二級(jí)結(jié)構(gòu)分析結(jié)果見(jiàn)圖4a,具有α螺旋、β折疊、無(wú)規(guī)則卷曲;氨基酸組成分析結(jié)果見(jiàn)圖4b,其中亮氨酸含量最多,纈氨酸含量最少;亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)結(jié)果表明該基因定位于細(xì)胞質(zhì),見(jiàn)圖4c;通過(guò)Protparam軟件預(yù)測(cè)分析結(jié)果顯示,Actyr的等電點(diǎn)為7.64,分子量MW=41.11 kDa。在體外的半衰期為30 h;不穩(wěn)定指數(shù)為48.2,表明該蛋白是不穩(wěn)定的。通過(guò)SWISS-MODEL軟件對(duì)Actyr蛋白質(zhì)的三級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測(cè)，結(jié)果如圖4d所示,為下一步對(duì)該基因功能的研究奠定了基礎(chǔ)。TMpred軟件的分析結(jié)果顯示, Actyr蛋白不存在跨膜區(qū)(圖5)。信號(hào)肽分析發(fā)現(xiàn)不存在信號(hào)肽結(jié)構(gòu)(圖6)。

圖2 Actyr基因的cDNA序列及推導(dǎo)的氨基酸序列

圖3 CDS分析結(jié)果

把本試驗(yàn)所克隆的Actyr基因編碼的氨基酸序列與其他物種絡(luò)氨酸酶基因編碼的氨基酸序列進(jìn)行同源性比較分析,發(fā)現(xiàn)其在兩個(gè)銅離子結(jié)合區(qū)(CuA和CuB)高度保守(圖7)。

圖4 Actyr基因的生物信息學(xué)分析結(jié)果

圖5 跨膜結(jié)構(gòu)域分析結(jié)果

圖6 信號(hào)肽預(yù)測(cè)結(jié)果

2.3 不同發(fā)育時(shí)期Actyr基因表達(dá)的分析

以ACTIN基因?yàn)閮?nèi)參基因,對(duì)玉木耳不同發(fā)育時(shí)期Actyr基因的表達(dá)量進(jìn)行分析,發(fā)現(xiàn)在玉木耳菌絲生長(zhǎng)時(shí)期,幾乎檢測(cè)不到Actyr基因的表達(dá)量;隨著玉木耳的生長(zhǎng)發(fā)育,其表達(dá)量不斷上升,到子實(shí)體直徑為3 cm時(shí),Actyr基因的表達(dá)量達(dá)到最高;隨著玉木耳的進(jìn)一步發(fā)育,其轉(zhuǎn)錄表達(dá)水平逐漸下降(圖8)。

3 討論與結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)采用基因克隆的手段,獲得了玉木耳的Actyr基因,明確了該基因的基本結(jié)構(gòu)和氨基酸序列。通過(guò)生物信息學(xué)分析,發(fā)現(xiàn)該蛋白屬于絡(luò)氨酸酶基因家族成員,具有其典型特征,即在活性中心含有兩個(gè)銅離子結(jié)合區(qū)。此外,通過(guò)對(duì)其理化性質(zhì)、結(jié)構(gòu)和功能等方面進(jìn)行分析預(yù)測(cè),結(jié)果表明,Actyr基因編碼的蛋白無(wú)跨膜區(qū),不存在信號(hào)肽；細(xì)胞定位預(yù)測(cè)結(jié)果表明其存在于細(xì)胞質(zhì)中,與大部分真菌的絡(luò)氨酸酶性質(zhì)一致[12]。絡(luò)氨酸酶廣泛存在于真菌中,在真菌中具有不同的功能,如參與孢子的形成及穩(wěn)定、防御和毒性機(jī)理,參與子實(shí)體褐變及色素沉著[1-3,13-15]。此外, Kitamoto等的研究表明,雙核菌絲在黑暗條件下培養(yǎng)時(shí),絡(luò)氨酸酶的活性較可見(jiàn)光條件下培養(yǎng)時(shí)低[16]。本研究通過(guò)分離、克隆玉木耳絡(luò)氨酸酶基因,分析其基因表達(dá)特征,為進(jìn)一步明確絡(luò)氨酸酶基因在玉木耳中的功能及遺傳育種奠定了基礎(chǔ)。

“*”表示保守的組氨酸(His)殘基。

圖8 玉木耳不同生長(zhǎng)發(fā)育階段Actyr基因的相對(duì)表達(dá)量