西寧地區(qū)犬呼吸道菌群分析及藥敏試驗(yàn)

蔣含偉,解秀梅，張麗芳，牛玉豐

(青海畜牧獸醫(yī)職業(yè)技術(shù)學(xué)院，西寧 812100)

寵物犬越來越多的進(jìn)入了人們的生活，呼吸道疾病對于寵物犬來說是一種多發(fā)性的疾病，尤其是幼齡犬和小型犬[1]，在一定的季節(jié)和年齡，呼吸道感染的情況愈發(fā)多見[2]。上呼吸道是多種菌群常居的部位，有些原發(fā)致病，有些會(huì)引起繼發(fā)感染使呼吸道癥狀加重[3]，若治療不及時(shí)或者不合理，會(huì)危及生命。但寵物臨床由于用藥缺乏科學(xué)依據(jù)，且不規(guī)范，為治療帶來了很多問題。同時(shí)，由于呼吸道感染疾病發(fā)病急，也沒有足夠時(shí)間去做細(xì)菌的分離鑒定和藥敏試驗(yàn)。因此，我們進(jìn)行了西寧地區(qū)健康犬呼吸道菌群及呼吸道感染犬菌群的調(diào)查研究及藥敏試驗(yàn)，了解和掌握寵物犬呼吸道菌群的特點(diǎn)，分析呼吸道疾病的發(fā)生原因和常見感染菌種，確定有效的治療藥物，制定正確科學(xué)的預(yù)防和治療對策。為今后開展全面、快速、準(zhǔn)確地寵物臨床診療工作提供科學(xué)依據(jù)，同時(shí)也為寵物醫(yī)學(xué)的快速發(fā)展創(chuàng)造良好的條件。

1 材料與方法

1.1 研究對象

選取青海省西寧地區(qū)西派寵物醫(yī)院、寵來福寵物醫(yī)院等5家寵物醫(yī)院，采取患呼吸道疾病的犬只和健康犬只的呼吸道棉拭子樣品共155例作為研究對象。呼吸道患病犬的樣品均是以出現(xiàn)有明顯呼吸道癥狀，如咳嗽、流鼻涕或出現(xiàn)黃膿鼻涕的犬只為主，共92例；采樣同時(shí)做呼吸道常見病毒的快速診斷試劑板的測試，其中有19例是由病毒感染引起。健康犬只均為無任何呼吸道癥狀，或來進(jìn)行免疫注射或美容洗澡的犬只，共63例。采樣表見表1。

表1 犬呼吸道樣品采集情況表

1.2 培養(yǎng)基

試驗(yàn)所用的增菌培養(yǎng)劑為LB液體培養(yǎng)基，制備方法：氯化鈉5g，胰蛋白胨10g，酵母粉10g，溶液1000mL，溶解后，調(diào)節(jié)pH值并高壓滅菌。

細(xì)菌分離培養(yǎng)所用的培養(yǎng)基為LB固體培養(yǎng)基。制備方法：氯化鈉5g，胰蛋白胨10g，酵母粉10g，瓊脂粉20g，溶液1000mL，溶解后，調(diào)節(jié)pH值并高壓滅菌。

生化實(shí)驗(yàn)所用培養(yǎng)基為TSA培養(yǎng)基，購自杭州微生物試劑有限公司。

藥敏試驗(yàn)所用培養(yǎng)基為營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基。

1.3 藥敏紙片

多西環(huán)素、磺胺嘧啶、頭孢哌酮、頭孢噻吩、頭孢噻肟、頭孢曲松、青霉素、阿莫西林、氨芐西林、卡那霉素、丁胺卡那、林可霉素、恩諾沙星、阿奇霉素，均購自杭州微生物試劑有限公司。

1.4 方法

1.4.1標(biāo)本采集

采用咽拭子采集法，在專用咽拭子采集管中放入2mL的無菌LB液體培養(yǎng)基，使用一次性無菌棉拭子進(jìn)行咽部深層采集，棉拭子盡量避免口腔和舌黏膜。然后將拭子插入采集管中并旋轉(zhuǎn)以利于細(xì)菌的洗脫，蓋緊蓋口。收集的咽拭子標(biāo)本立即放入-20℃的冰箱儲存。

1.4.2細(xì)菌分離培養(yǎng)

2008年，化名為“中本聰”的研究人員首次提出了比特幣[1]。在隨后幾年中，數(shù)字貨幣發(fā)展迅速，出現(xiàn)了像以太坊、萊特幣等具有代表性的一些數(shù)字貨幣。而支撐這類數(shù)字貨幣的區(qū)塊鏈技術(shù)也逐漸得到研究人員的重視。

取出儲存于冰箱的咽拭子，放置于恒溫箱內(nèi)進(jìn)行細(xì)菌復(fù)蘇培養(yǎng)4～8h，然后接種于LB固體培養(yǎng)基37℃培養(yǎng)18～48h。

1.4.3細(xì)菌的純培養(yǎng)

挑出分離培養(yǎng)結(jié)果為陽性的平板，根據(jù)平板上形成的菌落形態(tài)、特征等的不同，對培養(yǎng)出的不同的菌落分別進(jìn)行純培養(yǎng)，同時(shí)進(jìn)行革蘭氏染色鏡檢。

1.4.4菌種的鑒定

之后將純培養(yǎng)出的菌接種于TSA培養(yǎng)基，后根據(jù)MicroScan WalkAway-40(西門子公司)全自動(dòng)細(xì)菌鑒定儀的操作要求鑒定細(xì)菌種屬。革蘭陰性細(xì)菌鑒定卡和革蘭陽性細(xì)菌鑒定卡購自于梅里埃生物科技有限公司。

1.4.5藥敏實(shí)驗(yàn)

采用Kirby-Bauer紙片擴(kuò)散法，將已分離培養(yǎng)鑒定出的不同菌種液分別均勻涂抹于營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，待培養(yǎng)基表面干燥后，將藥敏片試紙粘于涂菌的表面，置37℃恒溫培養(yǎng)18h～24h，根據(jù)抑菌圈的大小來判斷細(xì)菌對藥物的敏感性。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)菌的分離培養(yǎng)結(jié)果

將155份含有咽部棉拭子的增菌培養(yǎng)液分別接種于LB固體培養(yǎng)基培養(yǎng)18h～48 h，觀察菌落生長情況，有20份未生長出菌落，其中患呼吸道疾病的樣品有13份未生長出菌落，健康犬樣品有7份未生長出菌落；其余135份都有不同程度的菌落形成，共計(jì)173株菌，患病犬樣品104株，健康犬樣品69株。

2.2 細(xì)菌分離鑒定結(jié)果

將純培養(yǎng)的173株菌經(jīng)過染色鏡檢，確定革蘭陰性菌株59株，占總分離株的34.1%；其中：患病犬中分離34株，占陰性分離株的57.6%；健康犬中分離25株，占陰性分離株的42.4%。革蘭陽性菌株114株，占總分離株的65.9%；其中患病犬中分離70株，占陽性分離株的61.4%；健康犬中分離44株，占陽性分離株的38.6%，后分別根據(jù)染色結(jié)果選擇相對應(yīng)的革蘭陰性細(xì)菌鑒定卡或革蘭陽性細(xì)菌鑒定卡，放于全自動(dòng)細(xì)菌鑒定儀進(jìn)行鑒定，最終確定分離菌種13種，患病犬呼吸道分離菌種12種，健康犬呼吸道分離菌種7種，重復(fù)6種。具體比例見表2、3。

表2 革蘭陽性菌株分離比例表

表3 革蘭陰性菌株分離比例表

2.3 藥敏試驗(yàn)結(jié)果

對患病犬中分離的12種菌株，和健康犬中分離的7種菌種分別選取2株進(jìn)行Kirby-Bauer紙片法藥敏實(shí)驗(yàn)，結(jié)果顯示在犬呼吸道菌群中，對于革蘭陽性細(xì)菌敏感的藥物有頭孢噻肟、頭孢曲松、恩諾沙星，其敏感率超過50%；其次為丁胺卡那、頭孢哌酮、頭孢噻吩，其敏感率均在30%～40%。耐藥情況較嚴(yán)重的藥物有磺胺嘧啶、阿莫西林、林可霉素、阿奇霉素，其耐藥率超過70%；其次耐藥的有多西環(huán)素、氨芐西林，其耐藥率達(dá)50%。

對于革蘭陰性細(xì)菌敏感的藥物有卡那霉素、恩諾沙星、丁胺卡那，其敏感率達(dá)70%；其次敏感藥物有頭孢噻吩、頭孢曲松、頭孢哌酮、氨芐西林，其敏感率達(dá)50%。耐藥情況較嚴(yán)重的藥物有阿莫西林、青霉素、林可霉素，其耐藥率超過70%；其次耐藥有磺胺嘧啶、多西環(huán)素、其耐藥率超過50%。藥敏實(shí)驗(yàn)結(jié)果統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)見表4。

表4 藥敏實(shí)驗(yàn)結(jié)果統(tǒng)計(jì)表

3 討論

3.1 犬上呼吸道菌群分布

根據(jù)細(xì)菌分離鑒定情況可見，健康犬上呼吸道正常菌群的組成種類繁多，主要有緩慢葡萄秋菌、放射根瘤菌、松鼠葡萄秋菌、少動(dòng)鞘氨醇單胞菌、淺黃假單胞菌、偽中間葡球菌、糞屎腸球菌等。其次，不管是從感染病例還是健康犬呼吸道中分離的菌種類型和數(shù)量看，陽性菌株的種類和數(shù)量遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于陰性菌株，陽性菌株分離率幾乎都達(dá)60%，陰性菌株分離率幾乎都在40%。即呼吸道樣品中分離到的革蘭陽性菌多于革蘭陰性菌，這和2018年秦久國[4]的分離結(jié)果一致，我們可以認(rèn)為，犬上呼吸道菌群種類繁多，但主要以革蘭陽性細(xì)菌居多，因此對于上呼吸道感染疾病的臨床用藥或防治繼發(fā)感染可偏向于革蘭陽性細(xì)菌敏感藥物。

3.2 犬呼吸道疾病的發(fā)生與呼吸道菌群的關(guān)系

犬呼吸道疾病的發(fā)生原因較多，主要包括病毒、致病菌直接感染引起[4，5]，環(huán)境因素改變導(dǎo)致菌群紊亂而引起[6]，或是由于患有其他系統(tǒng)疾病使寵物機(jī)體抵抗力低下而繼發(fā)呼吸道感染[6,7]；其他原因如真菌、支原體等引起的犬呼吸道疾病概率極低[8,9]，寵醫(yī)臨床也較少發(fā)生。根據(jù)采樣統(tǒng)計(jì)我們可以看到，由病毒直接感染引起的呼吸道疾病占20.7%。又從健康犬和呼吸道感染犬病例中分離的菌種對比來看，呼吸道患病犬中分離出的菌種幾乎都為條件性致病菌，也有部分正常菌群，主要致病菌感染引起的比例較低，如金黃色葡萄球菌，占感染病例的11.5%，肺炎克雷伯菌臭鼻亞種占感染病例的3.8%。因此，其余63.9%的病例很可能都是由于環(huán)境的改變而使呼吸道菌群紊亂引起。

3.3 犬呼吸道菌種的藥物敏感與臨床用藥的關(guān)系

張曉遠(yuǎn)[10]等研究說明患病犬呼吸道致病菌對抗生素的耐藥性有較大的變化趨勢，2006年呼吸道菌種敏感的藥物到2009年敏感性降低，甚至耐藥。2013年梅梅[2]的文章中，林可霉素、阿莫西林、阿奇霉素等幾種藥物對呼吸感染菌的敏感性很高。但本次實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，呼吸道菌種不管是革蘭陰性菌還是陽性菌對林可霉素、阿莫西林等有較大的耐藥性，革蘭陰性菌對阿奇霉素的敏感性也不是很高。過去幾年阿莫西林、阿奇霉素、林可霉素等是寵物醫(yī)院臨床常用藥物[11，12]，這就說明，呼吸道菌對抗生素耐藥性的變化趨勢極其明顯?？梢?，長期大量的使用的同一種抗生素、或不恰當(dāng)?shù)倪B用抗生素等濫用抗生素的治療方法，會(huì)使細(xì)菌的耐藥性升高很快。不過這種差異也不排除和地區(qū)用藥、菌種種類及數(shù)量有關(guān)[2，8]。同樣，從數(shù)據(jù)不難發(fā)現(xiàn)，近幾年，本地區(qū)頭孢類藥物也在臨床大量使用[13，14]。因此，呼吸道菌種對頭孢類藥物的敏感性并不是特別理想，所以臨床用藥也需針對菌種耐藥性的變化而有所改變。

另外，2018年杜兵[15,16]等在人體呼吸道感染的研究中發(fā)現(xiàn)，呼吸道菌種革蘭氏陰性菌對內(nèi)酰胺類藥物耐藥率超過50%，革蘭氏陽性菌對阿莫西林、阿奇霉素等藥物耐藥率超過50%。和本次試驗(yàn)結(jié)果有一定的相似性，是否寵物犬和人對呼吸道菌的藥物耐藥性有一定的相關(guān)性。

4 結(jié)論

綜合分析表明，犬呼吸道正常菌群種類較多，呼吸道疾病中63.9%是由于環(huán)境因素改變導(dǎo)致呼吸道菌群失調(diào)或條件性致病菌感染引起，而且革蘭陽性菌要多于革蘭陰性菌。因此，臨床用藥可偏向于革蘭陽性菌的藥物進(jìn)行治療或防治繼發(fā)感染。目前，西寧地區(qū)對寵物犬呼吸道細(xì)菌比較敏感的藥物有卡那霉素、恩諾沙星、頭孢類藥物，建議使用。但由于長期使用同一種藥物，極易產(chǎn)生耐藥性而降低療效，應(yīng)隨時(shí)更換藥物，以達(dá)到較好效果。