間甲酚對雜交鱘（施氏鱘♀×西伯利亞鱘♂）幼魚肝臟的氧化脅迫作用

蔣左玉，熊鏵龍，姚俊杰，梁正其，馮亞楠

（1.貴州省甕安縣農(nóng)業(yè)農(nóng)村局，貴州 甕安 550400；2.貴州大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院水產(chǎn)科學(xué)系，貴州 貴陽 550025；3.銅仁學(xué)院 生物與農(nóng)林工程學(xué)院，貴州 銅仁 554300；4.北京好未來教育摩比事業(yè)部，北京 100000）

間甲酚（m-cresol）（又名間蒸木油酸）是一種具有原生質(zhì)毒性的環(huán)境激素類化合物，有對甲酚（p-cresol）和鄰甲酚（o-cresol）兩種同分異構(gòu)體。間甲酚具有較強的腐蝕性及毒性，與皮膚、黏膜接觸后直接進(jìn)入血液循環(huán)，攻擊細(xì)胞，侵害神經(jīng)系統(tǒng)，對各種生物均有毒性。我國《污水綜合排放標(biāo)準(zhǔn)》（GB89782-1996）中明確規(guī)定：1989 年，間甲酚被列入我國環(huán)境優(yōu)先控制污染物黑名單，重點防控[2]，對藻類、蚤等、魚類等水生生物具有毒害作用[3-6]。最高允許排放濃度為0.5 mg/L[1]。間甲酚暴露能抑制斑馬魚Danio rerio 的胚胎發(fā)育，胚胎和仔魚的畸形率隨間甲酚濃度增大和暴露時間延長而升高[5,6]。類似的研究結(jié)果在建鯉Cyprinus carpio var.Jian 幼魚的急性毒性研究中也得到證實[7]。相關(guān)研究表明，短時間低濃度間甲酚對魚類的酶活性具有誘導(dǎo)作用，但隨時間延長對酶活性有不同程度的抑制作用。王艷艷等[8]發(fā)現(xiàn)，低濃度間甲酚能誘導(dǎo)雜交鱘幼魚腸和胃中消化酶活性，而高濃度有抑制作用，呈劑量-效應(yīng)關(guān)系;在同一間甲酚濃度下，胃蛋白酶和腸脂肪酶活性隨著時間的延長而降低，呈時間-效應(yīng)關(guān)系。朱俊華等[9,10]研究表明，低濃度的間甲酚溶液能誘導(dǎo)甌江彩鯉Cyprinus carpio var.Color 早期發(fā)育中的磷酸酶、脂酶活性，而高濃度間甲酚溶液則會抑制這些酶的活性。組織學(xué)觀察表明，間甲酚會不同程度地?fù)p傷魚類細(xì)胞、器官組織等，甚至死亡[11,12]。雜交鱘肝組織隨間甲酚暴露時間的延長和濃度的增大，血細(xì)胞侵潤嚴(yán)重，胞漿疏松透明，水樣變性[11]。張正勇[12]研究也表明，高濃度間甲酚下斑馬魚肝臟組織病變更加明顯。間甲酚對水生生物的影響已不容忽視。

雜交鱘生長速度快、抗病力強、產(chǎn)量高，在我國廣為養(yǎng)殖?？寡趸甘巧锷鷳B(tài)毒理學(xué)研究的效應(yīng)指示物之一。本試驗通過測定不同質(zhì)量濃度間甲酚暴露下雜交鱘（施氏鱘Acipenser schrenckii ♀×西伯利亞鱘A.baeri ♂）幼魚肝臟中超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化氫酶（CAT）的活性及丙二醛（MDA）含量變化，以探討間甲酚對雜交鱘幼魚的毒性作用及機體損傷程度，以期為科學(xué)制定間甲酚在水環(huán)境中的允許濃度和排放標(biāo)準(zhǔn)提供一些基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗用魚為貴州省畢節(jié)地區(qū)金沙縣鱘魚苗種場培育的人工繁殖雜交鱘（西伯利亞鱘♂×施氏鱘♀）幼魚，平均體長（12.35±0.94）cm，平均體質(zhì)量（10.26±2.37）g。挑選無病、體質(zhì)健壯的個體用于試驗，試驗前在水族箱中暫養(yǎng)2 d，試驗前一天不投喂。

1.2 方法

根據(jù)國家《污水綜合排放標(biāo)準(zhǔn)》（GB8978-1996），間甲酚最高允許排放濃度的一級、二級和三級標(biāo)準(zhǔn)分別不超過0.1 mg/L、0.2 mg/L 和0.5 mg/L。預(yù)試驗結(jié)果顯示，間甲酚對雜交鱘幼魚急性毒性的96 h 半致死濃度為45.5 mg/L，安全濃度為4.55 mg/L。本試驗以污水排放標(biāo)準(zhǔn)三級（0.5 mg/L）作為亞急性試驗最低濃度，4 mg/L（接近安全濃度））為中間值，采用等比梯度設(shè)置試驗濃度梯度，即0.00 mg/L（對照組）、0.50 mg/L、1.00 mg/L、2.00 mg/L、4.00 mg/L 和8.00 mg/L，每組3 個平行，每個平行放養(yǎng)30 尾。將已馴養(yǎng)兩周的健康試驗魚隨機放入50 L 水箱內(nèi)進(jìn)行40 d 亞急性毒性試驗。試驗中連續(xù)充氣，溶解氧量6.0 mg/L 以上，水溫（17.5±0.5）℃，每8 h 更換一次藥液。

試驗開始后10 d、20 d、30 d、和40 d 時，從各質(zhì)量濃度水箱中隨機撈3 尾魚，置于冰盤內(nèi)解剖。將取出的肝臟組織用預(yù)冷的生理鹽水清洗，濾紙吸干水分后置于5 mL 離心管中，于-80℃冰箱中保存待測。

酶液制備：取不同時間的樣品，加入樣品質(zhì)量10 倍體積的預(yù)冷重蒸水，在玻璃勻漿器中冰浴勻漿，9 000～10 000 r/min 冷凍離心30 min，上層為油層，下層為沉淀，小心取中間層，3 000 r/min 再次離心后取上清液，置于4℃下保存?zhèn)溆茫?4 h 內(nèi)分析完畢。

抗氧化酶活性的測定：采用考馬斯亮藍(lán)法測定酶中液蛋白質(zhì)量濃度。采用南京建成生物技術(shù)有限公司試劑盒測定超氧化物歧化酶、過氧化氫酶活性和丙二醛含量。

1.3 數(shù)據(jù)處理

試驗數(shù)據(jù)用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差（n=9）表示，用SPSS 13.0 統(tǒng)計軟件進(jìn)行單因素方差分析，用Duncan’s 法對均值進(jìn)行多重比較，P＜0.05 為差異顯著，P＜0.01 為差異極顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 間甲酚對雜交鱘幼魚的急性毒性

不同濃度間甲酚組中雜交鱘幼魚的死亡率見表1。由表1 可知：間甲酚對雜交鱘幼魚的24 h、48 h、72 h 和96 h 的LC50分 別 為49.60 mg/L、47.26 mg/L、46.36 mg/L 和45.50 mg/L，SC 為4.55 mg/L。隨間甲酚濃度的升高，雜交鱘幼魚的死亡率上升。受試魚死亡率與間甲酚濃度呈時間-效應(yīng)關(guān)系。65.65 mg/L 濃度組中，24 h 死亡率達(dá)到90%，48 h 全部死亡；對照組無死亡現(xiàn)象。試驗發(fā)現(xiàn)，雜交鱘幼魚在短時間內(nèi)（24 h）高濃度組死亡率較高，表明高濃度間甲酚對雜交鱘幼魚的毒性較大。

2.2 間甲酚脅迫對雜交鱘幼魚肝臟中SOD 活性的影響

不同質(zhì)量濃度間甲酚組中雜交鱘幼魚肝臟SOD 的活性見表2。由表2 可知：同一時間下，肝臟中SOD 活性隨間甲酚濃度的升高呈“上升-下降”趨勢，10 d、20 d 時1.00 mg/L 組魚肝中SOD 活性最高，分別為（22.719±1.644）U/mg prot 和（23.543±1.955）U/mg prot，均極顯著高于對照組（P＜0.01），隨后隨間甲酚濃度升高，活性極顯著下降（P＜0.01）；30 d、40 d 時，0.50 mg/L 組魚肝SOD 活性最高，分別為（14.983±1.126）U/mg prot 和（13.236±0.323）U/mg prot，均極顯著高于對照組（P＜0.01）。

同一濃度下，間甲酚濃度分別為0.50 mg/L 和1.00 mg/L 時，隨時間延長，肝SOD 活性均呈“上升-下降”變化，且均在第20 d 時活性最高，0.50 mg/L組顯著高于第10 d 活性（0.01＜P＜0.05），1.00 mg/L僅稍高于第10 d，差異不顯著（P＞0.05）。間甲酚濃度為2.00 mg/L、4.00 mg/L 和8.00 mg/L 時，肝SOD活性隨時間延長呈下降趨勢，第20 d 時活性稍低于第10 d，差異不顯著（P＞0.05），但第30 d 和40 d 時極顯著低于第10 d（P＜0.01）。

表1 間甲酚對雜交鱘幼魚的試驗結(jié)果Tab.1 The effects of m-cresol on survival of the hybrid sturgeon juveniles（n=10）

表2 間甲酚對雜交鱘幼魚肝臟中SOD 酶活力的影響（U/mg prot）Tab.2 Effects of m-cresol on the activity of superoxide dismutase in liver of hybrid sturgeon juvenile

2.3 間甲酚脅迫對雜交鱘幼魚肝臟中CAT 活性的影響

不同質(zhì)量濃度間甲酚中雜交鱘幼魚肝臟CAT的活性見表3。由表3 可知：同一時間下，肝臟中CAT 活性隨間甲酚濃度的升高呈“上升-下降”趨勢，第10 d 時，各濃度組酶活性均極顯著高于對照組（P＜0.01），4.00 mg/L 組CAT 活性最高，為（133.474±1.659）U/mg prot。第20 d 時，2.00mg/L 組CAT 活性最高，為（100.019±0.974）U/mg prot，隨后降低，8.00 mg/L 時酶活性極顯著低于對照組（P＜0.01）。第30 d 時，酶活性在1.00 mg/L 時最高，為（112.549±2.018）U/mg prot，極顯著高于對照組（P＜0.01），隨后隨間甲酚濃度升高活性極顯著下降，4.00 mg/L、8.00 mg/L 時極顯著低于對照組（P＜0.01）。第40 d 時，0.50 mg/L 時酶活性最高，為（113.217±2.059）U/mg prot，極顯著高于對照組（P＜0.01），隨后其活性急劇下降，各濃度組酶活均極顯著低于對照組（P＜0.01）。

同一濃度下，0.50 mg/L 組中，肝CAT 活性隨時間延長而上升，第20 d 時其活性顯著高于第10 d（P＜0.05），第30 d、40 d 時極顯著高于第10 d（P＜0.01）。1.00 mg/L、2.00 mg/L 組中，肝CAT 活性隨時間延長呈“上升-下降”變化，第30 d 時，1.00 mg/L組酶活性最大；第20 d 時2.00 mg/L 組酶活性最大，隨后下降，極顯著低于對照組（P＜0.01）。4.00 mg/L組和8.00 mg/L 組CAT 活性均隨時間延長而極顯著下降趨勢（P＜0.01）。

2.4 間甲酚脅迫對雜交鱘幼魚肝臟中MDA 含量的影響

不同質(zhì)量濃度間甲酚組雜交鱘幼魚肝臟中MDA 的含量見表4。由表4 可知：同一時間下，肝臟中MDA 含量隨間甲酚濃度的升高而上升，各組間MDA 含量均極顯著高于對照組（P＜0.01）。同一濃度下，MDA 含量隨時間延長而上升，第20 d MDA含量顯著高于第10 d（0.01＜P＜0.05），第30 d 和第40 d 時MDA 含量均極顯著高于第10 d（P＜0.01）。

3 討論

在污染物脅迫下，生物體內(nèi)會產(chǎn)生大量活性氧等自由基，如H2O2和O-2等，若不及時清除，就會對機體造成氧化脅迫，損傷DNA，酶失活和脂質(zhì)過氧化以至細(xì)胞死亡。SOD 和CAT 是重要的抗氧化酶。SOD 可直接將超氧陰離子自由基分解為過氧化氫和氧氣，CAT 又可將過氧化氫分解為水和氧氣，兩種酶共同作用清除機體中過量的自由基，保護機體免受外界氧化損傷[13]。MDA 是機體脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物，其含量可反映機體的損傷程度。脂質(zhì)過氧化使脂的通透性增加，損傷膜結(jié)構(gòu)及其功能，是氧化損傷生物體的主要原因，最終損傷生物體[14]。

表3 間甲酚對雜交鱘幼魚肝臟CAT 酶活性的影響（U/mg prot）Tab.3 Effects of m-cresol on the activity of catalase in liver of hybrid sturgeon juvenile

表4 間甲酚對雜交鱘幼魚肝臟中MDA 含量的影響（nmol/mL）Tab.4 Effects of m-cresol on malondialdehyde content in liver of hybrid sturgeon juvenile

大量研究表明：烷基酚類化合物會誘導(dǎo)或抑制水生動物抗氧化酶的活性，但因生物的敏感性、脅迫強度和脅迫時間不同，以致誘導(dǎo)或抑制作用的時間不同。楊琦等[15]研究表明，壬基酚對雜交鱘幼魚肝臟總抗氧化能力和谷胱甘肽S 轉(zhuǎn)移酶活性隨壬基酚濃度的升高而降低；泥鰍Misgurnus anguillicaudatus 肝臟中CAT 和T-SOD 的活性隨著壬基酚濃度的升高表現(xiàn)為誘導(dǎo)-抑制規(guī)律，說明兩種酶活性與水中壬基酚的濃度直接相關(guān)[16]。本研究表明，同一時間下，肝臟中SOD 和CAT 活性均隨間甲酚濃度的升高呈“升高-降低”趨勢，即在低劑量間甲酚濃度下（0.5 mg/L 和1.00 mg/L），2 種酶活性隨間甲酚濃度的增加而升高，之后隨間甲酚濃度的升高而下降，說明間甲酚暴露時間不同對魚體的毒性效應(yīng)也不同。類似的結(jié)果在宋波瀾等[17]研究鋅離子對雜交鱘幼魚SOD 和CAT 活力的影響；戚珍珠等[18]研究壬基酚對幼齡泥鰍SOD 和CAT 活力的影響中也得到證實。這說明在低濃度間甲酚下，SOD 和CAT 被激活，來驅(qū)除間甲酚所產(chǎn)生的過量自由基，保護機體免受氧化損傷。一旦間甲酚濃度超過閾值，一些未得到清除的自由基對雜交鱘肝臟細(xì)胞和組織產(chǎn)生了不可逆的傷害，細(xì)胞的衰老加速，酶活性逐漸降低[19]。雜交鱘幼魚肝臟中SOD 和CAT 活性隨間甲酚濃度升高和暴露時間延長而降低，說明濃度與暴露時間存在顯著的協(xié)同作用。

Nagaraj 等[20]研究表明，污染物通過與酶發(fā)生相互作用而改變其蛋白結(jié)構(gòu)和功能活性。當(dāng)雙酚A 和壬基酚質(zhì)量濃度逐漸升高時，河蜆Corbicula fluminea 體內(nèi)SOD 和CAT 等酶在細(xì)胞應(yīng)激作用產(chǎn)生大量的酶蛋白，引發(fā)體內(nèi)相關(guān)酶活性升高，更好地清除代謝中產(chǎn)生的H2O2，保護物體免受較大的氧化損傷[21]。本試驗中，同一濃度下，肝臟中SOD 和CAT活性隨時間的延長呈“上升-下降”趨勢，且在高濃度間甲酚條件下酶活峰值先出現(xiàn)，說明高濃度間甲酚下魚體氧化應(yīng)激作用快，短時間內(nèi)迅速提高抗氧化系統(tǒng)酶活性來應(yīng)對外界的氧化脅迫，提高了魚體的抗氧化能力。這種在毒物作用下，生物酶的增益現(xiàn)象是一種“毒物興奮效應(yīng)”[22]。但這種“效應(yīng)”時間短，無法長時間發(fā)揮作用，其對肝臟中SOD 和CAT的誘導(dǎo)有差別，不同抗氧化酶對間甲酚脅迫的生理適應(yīng)程度不同，但具體代謝補償適應(yīng)機制仍待進(jìn)一步研究。

肝臟是魚類新陳代謝的中心和各種外源異生物質(zhì)的解毒器官，在有毒環(huán)境中呼吸和消化時，肝臟的損傷程度更加明顯。戚珍珠等[23]研究表明，高劑量壬基酚暴露對1 月齡泥鰍肝臟組織的損傷更嚴(yán)重，且其毒性隨著暴露濃度增加、作用時間的延長而增強。張正勇[6]的研究也證實，間甲酚對斑馬魚組織結(jié)構(gòu)損傷與化合物濃度具有明顯的劑量效應(yīng)關(guān)系，與染毒時間成正相關(guān)；高濃度的組織病變比低濃度更明顯。本試驗結(jié)果顯示，肝臟中MDA 含量隨間甲酚濃度的升高和暴露時間的延長呈上升趨勢，說明間甲酚在雜交鱘幼魚肝臟中產(chǎn)生了生物蓄積作用，自由基積累使肝臟組織遭受氧化損傷，加劇了膜脂過氧化，破壞了膜的結(jié)構(gòu)和功能，MDA 含量升高。梁琍等[7]研究間甲酚對雜交鱘幼魚肝臟的組織學(xué)損傷也證實了這一結(jié)果。