嘔吐毒素毒性及其對水產(chǎn)養(yǎng)殖影響的研究進(jìn)展

劉虎,李玲,梁金榮,操玉濤,郭慧,申玉春

（廣東海洋大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院，湛江市海洋生態(tài)與養(yǎng)殖環(huán)境重點實驗室，廣東 湛江 524025）

嘔吐毒素又名脫氧雪腐鐮刀菌烯醇（deoxynivalenol,DON），分子式為C15H20O6，相對分子質(zhì)量為296，化學(xué)名稱為3,7,15-三羥基-12,13-環(huán)氧單端孢霉-9-烯-8-酮，是一種無色針狀結(jié)晶，熔點151～153℃，可溶于水和極性溶劑，具有較強的熱抵抗力和耐酸性，在乙酸乙酯中可長期保存[1]。DON是一種單端孢霉烯族霉菌產(chǎn)生的有毒次級代謝產(chǎn)物，是小麥、玉米等多種農(nóng)作物、飼料及其原料的主要污染物。雖然它的毒性較同族其他真菌毒素小，但它廣泛存在并大量污染谷物，對動物和人類危害很大，聯(lián)合國糧農(nóng)組織和世界衛(wèi)生組織將單端孢酶烯族毒素列為最危險的自然發(fā)生食品污染物，納入國際研究的優(yōu)先地位[2]。

1 DON 的產(chǎn)生和污染現(xiàn)狀

DON 的產(chǎn)生需要合適的溫度、濕度、氧氣和能量。當(dāng)谷物的含水量為22%，濕度達(dá)85%左右，溫度為20 ℃時,，被霉菌污染的谷物即可產(chǎn)生大量的DON[3]。據(jù)統(tǒng)計，世界上每年大約有25%的谷物受到霉菌毒素的污染，近年來的眾多調(diào)查數(shù)據(jù)表明，DON 在全國以及世界范圍內(nèi)的糧食作物中普遍存在，且污染程度以糧谷作物種類不同而異（表1）。

2 DON 的毒性作用

DON 是由3 個分子的甲戊酸合成的倍半萜化合物，性質(zhì)相當(dāng)穩(wěn)定，在飼料加工、儲藏和運輸過程中很難被降解。霉菌毒素在動物體內(nèi)的代謝途徑主要有三種：一是經(jīng)消化道之后直接排出體外；二是通過腸道吸收后進(jìn)入體循環(huán),到達(dá)相應(yīng)的靶器官進(jìn)行代謝或沉積,或經(jīng)泌尿系統(tǒng)排出體外；三是在機體的腸肝循環(huán)中被反復(fù)重吸收[18]。在已知的單端孢酶烯族毒素中，DON 的毒性雖比較弱，但它存在范圍較為廣泛，且檢出濃度較高，對人和動物仍有很大的危害，其主要具有腸道毒性、細(xì)胞毒性、免疫毒性和神經(jīng)毒性。

表1 近10 年DON 污染現(xiàn)狀Tab.1 Researches on DON pollution in the past 10 years

2.1 腸道毒性

腸道不僅是動物吸收營養(yǎng)物質(zhì)的主要場所，還是機體抵抗外源病原的天然屏障。動物攝食DON后主要在消化道中吸收，因此腸道是DON 毒性攻擊的第一靶標(biāo)。研究發(fā)現(xiàn)，DON 對腸道的毒性作用主要有三個方面：一是破壞腸道形態(tài)；二是損傷腸道屏障功能；三是破壞腸道微生物平衡。首先，當(dāng)腸道暴露在DON 的環(huán)境中，DON 會影響腸道的形態(tài)結(jié)構(gòu)。Awad 等[19]發(fā)現(xiàn)，DON 濃度為1 mg/kg 或5 mg/kg時，肉雞小腸絨毛長度和吸收表面積減少。其次，腸道屏障功能主要是抵御外來病原或污染物，其中，緊密連接蛋白在腸道屏障功能中發(fā)揮著重要作用。ZO-1 蛋白是緊密結(jié)點結(jié)構(gòu)的重要組成部分，在形成及維持腸道屏障的不通透性有重要作用[20]。Anderson 等[21]研究表明，DON 濃度為2 000 ng/mL 時，顯著抑制ZO-1 的表達(dá)，表明DON 能夠抑制緊密裂解蛋白的表達(dá)，進(jìn)而破壞腸道的屏障功能。Awad 等[22]也發(fā)現(xiàn)，DON 主要通過改變雞和豬腸道的TEER（跨膜上皮電阻）或Gt（經(jīng)上皮的離子導(dǎo)電性），降低腸道細(xì)胞間離子傳遞和腸道細(xì)胞完整性，損傷雞和豬的腸道屏障功能。另外，腸道微生物的平衡有助于維持腸道微生態(tài)環(huán)境的穩(wěn)定，有助于腸道營養(yǎng)物質(zhì)的吸收，并在腸道免疫方面具有重要作用[23]。Waché 等[24]研究表明，DON 能夠影響腸道微生物區(qū)系的多態(tài)性，改變腸道微生物的組成、數(shù)量及分布等，影響腸道免疫，進(jìn)而影響動物的生產(chǎn)性能。

2.2 細(xì)胞毒性

DON 有很強的細(xì)胞毒性，主要作用于動物增殖活躍的細(xì)胞，如黏膜上皮細(xì)胞和淋巴細(xì)胞。腸道黏膜上皮細(xì)胞是腸道細(xì)胞中最先接觸DON 的細(xì)胞之一，也是DON 主要攻擊的靶標(biāo)。暴露于DON 后，豬腸道上皮細(xì)胞IPEC-1 和IPEC-J2 的數(shù)量顯著減少，其增殖受到抑制，細(xì)胞停滯在G2/M 期[25,26]。當(dāng)DON濃度為4 000 ng/mL 時，豬腸道上皮細(xì)胞（IPECJ2）層的TEER（跨膜上皮電阻）顯著下降[27]，使腸道上皮細(xì)胞層極化、細(xì)胞通透性增強，致病分子等更易跨胞轉(zhuǎn)運以及腸道微生物更易發(fā)生遷移，增加動物的易感性[28]。

淋巴細(xì)胞是免疫系統(tǒng)的重要組成部分[29]。體外實驗表明，小劑量DON（50 ng/mL、100 ng/mL）可延遲或損害CD4+T 細(xì)胞的增殖，而大劑量DON（250 ng/mL、500 ng/mL）則完全抑制CD4+T 細(xì)胞的增殖[30]。Suzuki K 等[31]研究表明，DON 可以減少CD8+T 淋巴細(xì)胞的數(shù)量，推測可能與DON 抑制蛋白質(zhì)的合成或CD8+T 淋巴細(xì)胞對DON 的高敏感度有關(guān)。DON可以綁定細(xì)胞的28S 核糖體肽?；D(zhuǎn)移酶位點，引起核糖體毒性應(yīng)激反應(yīng)，激活MAPKs 信號途徑，介導(dǎo)細(xì)胞凋亡和促炎癥細(xì)胞因子（如TNF-α、IL-6、COX-2 等）的表達(dá)[32,33]，引起機體的炎癥反應(yīng)。在炎癥反應(yīng)中，活性氧（ROS）可能作為信號分子，調(diào)控細(xì)胞吞噬、凋亡和基因表達(dá)等重要環(huán)節(jié)，導(dǎo)致免疫系統(tǒng)失調(diào)。DON 可以通過損傷IPEC-J2 細(xì)胞中線粒體形態(tài)和自噬體的共定位，增加細(xì)胞內(nèi)活性氧（ROS）或線粒體特異性ROS 水平，且呈劑量依賴性[34]。Mishra 等[35]也通過研究表明，DON 能導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生大量的ROS，使細(xì)胞凋亡和DNA 損傷。除此之外，DON 還可以干擾轉(zhuǎn)錄過程與蛋白合成，破壞細(xì)胞的形態(tài)和功能，影響細(xì)胞活性，從而引起機體過氧化損傷。Dinu 等[36]研究發(fā)現(xiàn)：Hek-293 細(xì)胞暴露于DON 后，細(xì)胞活性隨劑量和作用時間的增加而下降，當(dāng)DON 濃度為2.5 μmol/L 或5 μmol/L 時，可誘導(dǎo)Hek-293 細(xì)胞產(chǎn)生MDA，降低GSH 含量，改變抗氧酶SOD 和CAT 的活性，誘發(fā)細(xì)胞脂質(zhì)過氧化作用，導(dǎo)致細(xì)胞死亡。

2.3 免疫毒性

研究表明，DON 既是一種免疫抑制劑,又是一種免疫促進(jìn)劑，其作用與劑量和作用時間有關(guān)[37]。低濃度的DON 能夠上調(diào)細(xì)胞因子、趨化因子和基因的表達(dá)，表現(xiàn)為免疫刺激[38]。高濃度的DON 能增加轉(zhuǎn)錄激活因子3（activating transcription factor 3,ATF3）的表達(dá)，增強PKR 的磷酸化，激活p38 信號途徑[39]，促進(jìn)機體白細(xì)胞凋亡而表現(xiàn)為免疫抑制[40]。一般認(rèn)為，免疫抑制與抑制翻過程有關(guān)，而免疫刺激與干擾了正常的免疫調(diào)節(jié)機制有關(guān)。在體外，DON 可以誘導(dǎo)T 淋巴細(xì)胞和B 淋巴細(xì)胞的凋亡[41]；在體內(nèi)，DON 可以破壞淋巴組織，誘使肝臟、脾臟等免疫器官輕度變性，使機體免疫系統(tǒng)受損。李群偉等[42]通過組織病理學(xué)觀察發(fā)現(xiàn)，家兔長期暴露于DON 時，肝臟和脾臟在內(nèi)的多個臟器嚴(yán)重病變，主要表現(xiàn)為肝細(xì)胞明顯腫脹，胞質(zhì)內(nèi)大量空泡，脾血竇擴張充血，脾小體和脾索內(nèi)有炎性細(xì)胞浸潤。免疫球蛋白是免疫病理結(jié)果的一種特征指標(biāo)，為DON對動物免疫系統(tǒng)的影響提供了一種新的路徑[43]。研究表明，DON 可以誘導(dǎo)機體內(nèi)免疫球蛋白分泌紊亂[44]，包括血清中IgA 和IgE 水平的升高，循環(huán)免疫復(fù)合物IgA、腎臟系膜IgA 的沉積和血尿等。低劑量的DON 能輕微刺激機體分泌IgA，表現(xiàn)為免疫促進(jìn)；高劑量DON 能損傷免疫細(xì)胞，降低起IgA 和IgM含量[45]。

2.4 神經(jīng)毒性

研究表明，DON 能迅速通過豬和羊的血腦屏障，增加腦部不同部位去甲腎上腺素及5-羥色胺，減少多巴胺含量，降低免疫應(yīng)答效應(yīng)[46]，進(jìn)而影響動物攝食。Hooft 等[47]給虹鱒Oncorhynchus mykiss飼喂含有DON 的飼料，發(fā)現(xiàn)其攝食量降低，推測與DON 對腦神經(jīng)遞質(zhì)的影響密切相關(guān)，并指出DON對區(qū)域腦神經(jīng)化學(xué)的影響可能有助于減少魚體對DON 濃度不斷增加的飼料的攝入量。Gon alves 等[48]研究發(fā)現(xiàn)：受DON 的影響，虹鱒腦NPY 的水平升高。NPY 及其表達(dá)水平具有直接控制攝食量的生理作用,是調(diào)節(jié)攝食行為的關(guān)鍵因素。Chamorro 等[49]研究表明，腦NPY 水平的升高會提高動物對飼料的攝入量，與Gon?alves 等的研究結(jié)果有所不同[48]。

3 DON 對水產(chǎn)養(yǎng)殖的影響

我國是水產(chǎn)養(yǎng)殖大國，水產(chǎn)動物飼料的需求量和生產(chǎn)居世界首位。隨著植物飼料在水產(chǎn)動物飼料的應(yīng)用日益廣泛，霉菌毒素對水產(chǎn)動物的危害日益嚴(yán)重，其風(fēng)險不僅來自于飼料生產(chǎn)過程中毒素的引入，還來自于儲藏過程中毒素產(chǎn)量的增加。

目前，關(guān)于DON 對水產(chǎn)動物影響的研究主要體現(xiàn)在生產(chǎn)性能方面。Woodward 等[50]將飼料中DON 的含量從1 mg/kg 增加到13 mg/kg，發(fā)現(xiàn)虹鱒的攝食率明顯下降；當(dāng)濃度達(dá)到20 mg/kg 時，虹鱒出現(xiàn)拒食現(xiàn)象。Hendricks 等[51]的研究再次證實了這一結(jié)論。Trigostockli 等[52]的研究表明：當(dāng)日糧中含有0.2 mg/kg、0.5 mg/kg 和1.0 mg/kg 的DON 時，顯著降低了南美白對蝦Litopenaeus vannamei 的體質(zhì)量和生長速度。用DON 含量為3.7 mg/kg 的飼料養(yǎng)殖大西洋鮭Salmo salar 15 周后和用DON 含量為0.3～2.6 mg/kg 的飼料養(yǎng)殖虹鱒56 d 后，均出現(xiàn)攝食率和增重下降的現(xiàn)象[47,53]。為了驗證DON 對虹鱒生長性能的影響是否只是與減少其攝食率有關(guān)，Hooft等[47]對虹鱒胴體的成分進(jìn)行了分析。發(fā)現(xiàn)隨著DON的增加，虹鱒機體粗蛋白（CP）濃度呈明顯的線性下降。

另有研究表明，DON 對虹鱒生長性能的影響不僅是DON 能降低其攝食率，而是直接或間接影響其營養(yǎng)代謝。Pietsch[54]等研究發(fā)現(xiàn)：用濃度為352 μg/kg、619 μg/kg 和953 μg/kg 的DON 飼 喂 鯉Cyprinus carpio 6 周后，生長幾乎未受影響，但在用最高濃度DON 飼喂的鯉的肝、頭腎和脾臟中脂質(zhì)過氧化反應(yīng)都有所增加，整個魚體的脂肪和能量也都有所增加，腎臟和肌肉乳酸脫氫酶（LDH）活性的變化和血清乳酸水平的升高表明：DON 能影響鯉厭氧代謝；血清白蛋白的降低可能與DON 的核毒性作用有關(guān)。

DON 除了影響動物的營養(yǎng)代謝，也能損傷動物免疫系統(tǒng)。在濃度1.4 mg/kg 或更高濃度DON 污染的飼料喂養(yǎng)下，組織病理學(xué)觀察發(fā)現(xiàn)，大西洋鮭的肝臟均發(fā)生變化和損傷，包括肝細(xì)胞外觀的改變、包膜下水腫和脂肪堆積[53]。?i?perová 等[55]發(fā)現(xiàn)，給虹鱒喂食DON 含量為2 mg/kg 的飼料一段時間后，腎臟、肝臟和鰓中的過氧化氫酶（CAT）、谷胱甘肽還原酶（GR）、谷胱甘肽過氧化酶（GPX）和谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶（GST）活性均有明顯變化。Pietsch 等[56]發(fā)現(xiàn)，在低劑量DON（352 μg/kg）飼料喂養(yǎng)的鯉體內(nèi)CAT 和超氧化物歧化酶（SOD）活性升高；不同濃度DON 飼喂4 周后，鯉白細(xì)胞的促炎免疫反應(yīng)均下調(diào)，但沒有觀察到明顯的抗炎免疫反應(yīng)參與。Pietsch 等[57]通過觀察鯉口服DON 后先天免疫反應(yīng)的過程，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，鯉的免疫調(diào)節(jié)作用主要通過激活促炎細(xì)胞因子和抗炎性酶來應(yīng)對DON 的急性反應(yīng)，26 d 后，在鯉的頭腎白細(xì)胞中檢測到精氨酸酶（ARG）活性升高，表明鯉對DON 的亞慢性反應(yīng)的特征是精氨酸酶的激活。Gon?alves 等[48]用含有DON 的飼料飼喂虹鱒后觀察到其消化酶（主要為活性和mRNA 表達(dá)）受到影響，但無法確定這一現(xiàn)象是由于DON 的攝入還是因為攝食量的降低。同時，該研究還發(fā)現(xiàn)虹鱒體內(nèi)的蛋白質(zhì)、脂肪和能量的利用率顯著下降，這表明DON 能影響營養(yǎng)物質(zhì)的運輸和攝取。該研究還觀察到，DON 會影響虹鱒胰蛋白酶的產(chǎn)生，推斷胰蛋白酶可能影響魚體胰島素的水平，從而影響其對必需氨基酸的攝取。然而，這一觀點還需要進(jìn)一步的研究來驗證。

4 小結(jié)

近年來，隨著人們對霉菌毒素關(guān)注度的提高，分子生物學(xué)技術(shù)的快速發(fā)展，對DON 的研究也越來越深入，DON 對動物的毒害作用及其機理得到了更多的闡述，但目前的研究對象大多為禽畜類，水產(chǎn)動物的研究還很缺少。隨著植物性蛋白源替代動物性蛋白源在水產(chǎn)飼料中的應(yīng)用，DON 對水產(chǎn)動物的影響也將更加嚴(yán)重，今后應(yīng)重點研究DON 對水產(chǎn)動物的作用劑量、毒性機理和對機體免疫的影響以及與其他毒素之間的聯(lián)合毒性等。