阿帕替尼的抗腫瘤機(jī)制研究進(jìn)展△

劉春浩，趙豪，李小毅

中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)院基本外科，北京 100730

實(shí)體腫瘤生長(zhǎng)需要大量的氧氣和營(yíng)養(yǎng)維持，因此促使大量新生血管生成，促進(jìn)腫瘤生長(zhǎng)，進(jìn)一步形成惡性循環(huán)。血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）作為血管生成的主要調(diào)控因子，在多數(shù)惡性腫瘤中極為活躍。VEGF通過(guò)結(jié)合3種膜受體酪氨酸激酶（receptor tyrosine kinase，RTK）調(diào)節(jié)內(nèi)皮細(xì)胞功能：血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子受體1（vascular endothelial growth factor receptor 1，VEGFR1）、VEGFR2和 VEGFR3。其中，VEGF的促血管生成作用主要由在血管內(nèi)皮細(xì)胞上高表達(dá)的VEGFR2介導(dǎo)，因此，VEGFR2已成為腫瘤治療的重要靶點(diǎn)。

甲磺酸阿帕替尼是一種新型的高度選擇性靶向VEGFR2的小分子酪氨酸激酶抑制劑（tyrosine kinase inhibitor，TKI）。作為一種抗血管生成藥物，阿帕替尼在多種實(shí)體腫瘤的治療中顯示出了一定的療效，已被批準(zhǔn)用于晚期胃癌的治療。新近有研究提示其在碘難治性分化型甲狀腺癌的治療中取得了令人意外的良好療效。一系列靶向藥物治療的臨床研究似乎表明靶向藥物對(duì)VEGFR2親和力越高，其抗腫瘤作用越強(qiáng)，療效越好。相關(guān)的基礎(chǔ)研究表明阿帕替尼除了具有抗血管生成作用外，同樣能夠直接作用于腫瘤細(xì)胞發(fā)揮抗腫瘤作用，包括直接抑制腫瘤細(xì)胞增殖、遷移和侵襲，逆轉(zhuǎn)腫瘤耐藥等。此外，阿帕替尼還能夠通過(guò)調(diào)節(jié)腫瘤免疫微環(huán)境發(fā)揮抑制腫瘤生長(zhǎng)的作用。因此，本文綜述阿帕替尼的研究現(xiàn)狀，為進(jìn)一步的研究與應(yīng)用提供參考。

1 阿帕替尼主要作用靶點(diǎn)

VEGFR是一種膜受體酪氨酸激酶，有3種亞型：VEGFR1（Flt1）、VEGFR2（KDR）和 VEGFR3（Flt4），與VEGF結(jié)合后發(fā)揮調(diào)節(jié)內(nèi)皮細(xì)胞功能的作用。作為最主要影響血管生成的受體，VEGFR2在大多數(shù)成人血管內(nèi)皮細(xì)胞以及循環(huán)內(nèi)皮祖細(xì)胞、胰管細(xì)胞、視網(wǎng)膜祖細(xì)胞、巨核細(xì)胞和造血細(xì)胞中表達(dá)，轉(zhuǎn)導(dǎo)VEGF的促血管生成信號(hào)，是生理和病理性血管生成中的關(guān)鍵信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)因子。VEGF是影響血管生成的主要限速因子，其主要有7種類(lèi)型：VEGFA、VEGFB、VEGFC、VEGFD、胎盤(pán)生長(zhǎng)因子（placenta growth factor，PLGF）、副痘病毒VEGFE和蛇毒VEGFF。在大多數(shù)人類(lèi)實(shí)體腫瘤中，VEGFR2通常與VEGFR3組合在腫瘤血管內(nèi)皮中高表達(dá)，同時(shí)多種腫瘤細(xì)胞也能表達(dá)VEGFR2，而且表達(dá)水平高于正常組織細(xì)胞。在VEGF和VEGFR2結(jié)合后，受體的羧基末端TK結(jié)構(gòu)域會(huì)發(fā)生自磷酸化，從而導(dǎo)致下游促血管生成信號(hào)的轉(zhuǎn)導(dǎo)。阿帕替尼可通過(guò)結(jié)合細(xì)胞內(nèi)三磷酸腺苷位點(diǎn)阻斷VEGFR2的自磷酸化，抑制多種信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑：介導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞增殖的RAF/MEK/細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶（extracellular regulated protein kinases，ERK）途徑；與內(nèi)皮細(xì)胞遷移有關(guān)的p38-促分裂原活化的蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）途徑；與內(nèi)皮細(xì)胞存活和血管通透性增加相關(guān)的磷脂酰肌醇3-激酶（phosphatidylinositol 3-hydroxy kinase，PI3K）/蛋白激酶 B（protein kinase B，PKB，又稱AKT）/雷帕霉素靶蛋白（mechanistic target of rapamycin kinase，MTOR）途徑；從而有效抑制腫瘤新生血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖、遷移，并可以降低血管通透性（圖1）。

圖1 阿帕替尼抑制VEGFR2信號(hào)通路抑制血管生成

2 阿帕替尼抗腫瘤機(jī)制

阿帕替尼最初是作為一種抗血管生成藥物應(yīng)用于臨床，通過(guò)抑制腫瘤血管生成，發(fā)揮其抑制腫瘤生長(zhǎng)的作用，但是不少的實(shí)驗(yàn)研究表明，除了抗血管生成作用外，阿帕替尼同樣能夠直接抑制腫瘤細(xì)胞的增殖，并通過(guò)多種不同的信號(hào)通路發(fā)揮其抗腫瘤作用。此外，阿帕替尼還可以通過(guò)影響多藥耐藥基因的表達(dá)以及調(diào)節(jié)免疫微環(huán)境而發(fā)揮抗腫瘤作用。

2.1 直接抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞

作為抗血管生成藥物，在體外實(shí)驗(yàn)中，阿帕替尼能夠以劑量依賴的方式抑制人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（human umbilical vein endothelial cell，HUVEC）增殖、遷移和脈管形成，阿帕替尼作用后HUVEC脈管形成能力較對(duì)照組明顯降低，抑制率可達(dá)80%。在肺癌、胰腺內(nèi)分泌腫瘤、甲狀腺未分化癌和肝細(xì)胞肝癌的移植瘤模型中，給予阿帕替尼治療后，血管內(nèi)皮標(biāo)志物CD31/血小板-內(nèi)皮細(xì)胞黏附分子-1（platelet endothelial cell adhesion molecule-1，PECAM-1）的表達(dá)和微血管密度顯著降低，表明阿帕替尼能夠在體內(nèi)減少腫瘤組織的血管生成，抑制腫瘤生長(zhǎng)。這一過(guò)程主要涉及3條細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路：RAF/MEK/ERK 通 路 、p38/MAPK 通 路 、PI3K/AKT/MTOR通路。Zhou等通過(guò)蛋白質(zhì)印跡法（Western blot）研究發(fā)現(xiàn)，阿帕替尼以劑量依賴性方式顯著降低HUVEC中VEGF誘導(dǎo)的ERK、p38、PI3K、AKT蛋白的磷酸化，在低氧條件下這種抑制更顯著；在免疫熒光實(shí)驗(yàn)中，阿帕替尼組的熒光信號(hào)較對(duì)照組顯著降低，表明RAF/MEK/ERK、p38/MAPK和PI3K/AKT3條信號(hào)通路受到明顯抑制。

在阿帕替尼對(duì)新生血管作用的研究中，存在一個(gè)值得注意的現(xiàn)象：移植瘤在低劑量（60 mg/kg）阿帕替尼作用3～7天后，基質(zhì)金屬蛋白酶2（matrix metalloproteinase 2，MMP2）和 MMP9表達(dá)顯著下降，明顯減少了血管基底膜的降解、血管結(jié)構(gòu)的破壞；同時(shí)，這一過(guò)程中阿帕替尼還顯著提高了腫瘤α-平滑肌肌動(dòng)蛋白（α-smooth muscle actin，α-SMA）陽(yáng)性血管與陰性血管的比率（通過(guò)α-SMA可以染色定位血管內(nèi)皮細(xì)胞周?chē)闹芗?xì)胞，而周細(xì)胞缺乏通常是新脈管系統(tǒng)不成熟的表現(xiàn)）。這些現(xiàn)象表明低劑量阿帕替尼在一定時(shí)間窗內(nèi)可以促進(jìn)血管成熟及正?；瑥亩寡芡暾院凸δ艿玫礁纳?。研究顯示，在此時(shí)間窗內(nèi)阿帕替尼可以有效提高化療藥物的療效。但是使異常腫瘤血管正?；赡軙?huì)增加腫瘤細(xì)胞的營(yíng)養(yǎng)和氧氣供應(yīng)，并且理論上可以加速腫瘤的生長(zhǎng)，這一過(guò)程對(duì)于阿帕替尼抗腫瘤作用的影響可能需要進(jìn)一步的研究去探索。

2.2 直接對(duì)腫瘤細(xì)胞的作用

2.2.1 直接抑制腫瘤細(xì)胞增殖、促進(jìn)凋亡 研究發(fā)現(xiàn)，在膽管細(xì)胞癌、肝癌、骨肉瘤、結(jié)腸癌、胰腺癌和甲狀腺癌中，阿帕替尼可以通過(guò)作用于腫瘤細(xì)胞表面的VEGFR2，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡，發(fā)揮直接的抗腫瘤細(xì)胞作用（表1）。目前研究提示，這一作用主要涉及2條細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路：VEGFR2/PI3K/AKT/MTOR 和 VEGFR2/信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活因子3（signal transduction and activator of transcription 3，STAT3）/B 細(xì)胞淋巴瘤/白血病-2（B cell lymphoma/leukemia-2，Bcl-2）。作為 VEGFR2下游的信號(hào)通路，PI3K可以被細(xì)胞表面的受體（VEGFR2）激活，形成 p-PI3K，p-PI3K 可以激活A(yù)KT和其下游效應(yīng)因子MTOR，將各種生長(zhǎng)因子和細(xì)胞因子的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)給細(xì)胞，從而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖和侵襲。磷酸化的AKT可以作用于Bcl-2家族和caspase家族中的蛋白質(zhì)，抑制細(xì)胞凋亡，進(jìn)而導(dǎo)致過(guò)度的細(xì)胞生長(zhǎng)和增殖。Bcl-2和Bcl-2相關(guān)蛋白X（Bcl-2 associated X，BAX）均屬于凋亡調(diào)節(jié)蛋白，Bcl-2能夠抑制腫瘤細(xì)胞凋亡，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞存活，BAX能夠拮抗Bcl-2對(duì)細(xì)胞凋亡的抑制作用，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡。caspase 9是線粒體凋亡途徑中的關(guān)鍵因素，激活的caspase 9可以進(jìn)一步激活下游的caspase 3，進(jìn)而導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞凋亡。在肝內(nèi)膽管細(xì)胞癌、肝癌和胃癌中阿帕替尼可以顯著下調(diào)VGEFR2/PI3K/AKT/MTOR信號(hào)通路中多種蛋白的磷酸化水平（p-VGEFR2、p-PI3K、p-AKT、p-MTOR），并改變凋亡相關(guān)基因的表達(dá)（促凋亡基因BAX、caspase 3，caspase 9的表達(dá)增加，以及抗凋亡基因Bcl-2的表達(dá)降低）而促進(jìn)凋亡，直接抑制腫瘤細(xì)胞增殖。新近Yu等在甲狀腺癌中發(fā)現(xiàn)，阿帕替尼同樣能夠通過(guò)抑制VEGFR2/PI3K/AKT/MTOR信號(hào)通路抑制腫瘤細(xì)胞增殖（表2）。

表1 阿帕替尼直接作用于腫瘤細(xì)胞內(nèi)的作用通路相關(guān)研究

在骨肉瘤中，阿帕替尼則是通過(guò)抑制VEGFR2/STAT3/Bcl-2信號(hào)通路促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡。研究結(jié)果顯示在阿帕替尼作用組，STAT3表達(dá)較對(duì)照組顯著下降。作為許多致癌信號(hào)通路的匯合點(diǎn)，STAT3通過(guò)下游信號(hào)分子（如Bcl-2和細(xì)胞周期蛋白D1）參與調(diào)節(jié)細(xì)胞生長(zhǎng)。

此外，在肝外膽管細(xì)胞癌和胃癌的研究中，一些研究者發(fā)現(xiàn)阿帕替尼能夠通過(guò)抑制VEGFR2/磷脂酶 C（phospholipases C，PLC）/ERK1/ERK2信號(hào)通路，抑制VEGF的產(chǎn)生，抑制VEGF/VEGFR2自分泌環(huán)，減弱VEGF/VEGFR2信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，發(fā)揮抗腫瘤作用（圖2）。

圖2 阿帕替尼通過(guò)VEGFR2/PLC/ERK1/ERK2信號(hào)通路抑制腫瘤細(xì)胞VEGF/VEGFR自分泌環(huán)

2.2.2 抑制腫瘤細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移 上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）代表一種生物學(xué)程序，通常在生物體發(fā)育、傷口愈合和組織纖維化期間觀察到，在此過(guò)程中上皮細(xì)胞失去其細(xì)胞特性并獲得間充質(zhì)表型，同時(shí)伴隨著細(xì)胞形態(tài)的急劇變化，細(xì)胞與細(xì)胞、細(xì)胞與基質(zhì)黏附的喪失和重塑，而獲得遷移能力。該過(guò)程可被腫瘤細(xì)胞利用，使腫瘤細(xì)胞發(fā)生侵襲和轉(zhuǎn)移。在骨肉瘤細(xì)胞的研究中，Zheng等發(fā)現(xiàn)阿帕替尼能夠明顯抑制腫瘤細(xì)胞的遷移和侵襲，使腫瘤細(xì)胞上皮標(biāo)志物E-cadherin表達(dá)升高，降低間質(zhì)標(biāo)志物（包括波形蛋白、N-cadherin）、轉(zhuǎn)錄因子Slug和MMP9的表達(dá)。同樣在膽管細(xì)胞癌中，阿帕替尼也可以顯著抑制腫瘤細(xì)胞的遷移和侵襲，抑制轉(zhuǎn)錄因子Slug、Snail1和MMP9的表達(dá)。上述蛋白是EMT的重要調(diào)控因子，在腫瘤細(xì)胞的遷移和侵襲中發(fā)揮著重要作用。由此可見(jiàn)，阿帕替尼可以通過(guò)抑制上述轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)，調(diào)控EMT抑制腫瘤細(xì)胞的遷移和侵襲。

2.2.3 抑制腫瘤細(xì)胞多藥耐藥基因的表達(dá) 多藥耐藥（multidrug resistance，MDR）是腫瘤治療中的主要問(wèn)題之一，其影響著抗腫瘤藥物的治療效果。細(xì)胞膜ATP結(jié)合盒（ATP-binding cassette transporter，ABC）的廣泛表達(dá)會(huì)從腫瘤細(xì)胞中外排出化學(xué)藥物，這在削弱抗腫瘤藥物的療效中起著主要作用。迄今為止，在人類(lèi)中已經(jīng)識(shí)別出48種ABC蛋白，根據(jù)序列相似性將其分為7個(gè)亞家族（A～G）。3個(gè)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白亞家族在腫瘤細(xì)胞的MDR產(chǎn)生中具有關(guān)鍵作用，包括ABC B成員1（ABCB1/MDR1）、C家族成員1（ABCC1/MRP1）以及G家族成員2（ABCG2/BCRP）。ABCB1有能力轉(zhuǎn)移多種化療藥物，如蒽環(huán)類(lèi)、長(zhǎng)春花生物堿、紫杉烷類(lèi)。ABCG2可以排出不同的抗腫瘤藥物，如米托蒽醌和蒽環(huán)類(lèi)、拓?fù)洚悩?gòu)酶I抑制劑等。Liu等研究發(fā)現(xiàn)阿帕替尼以劑量依賴的方式抑制順鉑耐藥A549細(xì)胞（A549/DDP）中MDR1基因的表達(dá)，同時(shí)抑制ERK信號(hào)通路的活性，恢復(fù)A549/DDP細(xì)胞對(duì)DDP的敏感性。Mi等發(fā)現(xiàn)阿帕替尼可以通過(guò)直接抑制ABCB1和ABCG2功能，逆轉(zhuǎn)ABCB1和ABCG2介導(dǎo)的MDR，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)化療藥物濃度升高。一個(gè)值得注意的現(xiàn)象是，阿帕替尼在沒(méi)有明顯影響AKT和ERK信號(hào)通路的磷酸化情況下發(fā)揮了逆轉(zhuǎn)腫瘤耐藥的作用，一定程度上表明MDR的逆轉(zhuǎn)與酪氨酸激酶的阻斷無(wú)關(guān)?；谝陨蠙C(jī)制，阿帕替尼與其他常規(guī)化療藥物組合可能克服腫瘤化療中的化療耐藥。

2.3 免疫調(diào)節(jié)相關(guān)抗腫瘤機(jī)制

程序性死亡受體配體1（programmed cell death 1 ligand 1，PDCD1LG1，也稱PD-L1）是程序性死亡受體1（programmed cell death 1，PDCD1，也稱PD-1）的配體，其相互作用抑制T細(xì)胞功能并導(dǎo)致免疫逃逸。在骨肉瘤中，研究人員通過(guò)免疫組織化學(xué)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)PD-L1主要在骨肉瘤細(xì)胞中表達(dá)，陽(yáng)性率為35.5%（33/93），同時(shí)PD-L1的高表達(dá)與預(yù)后不良相關(guān)；體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)顯示，阿帕替尼可通過(guò)抑制VEGFR2/STAT3信號(hào)通路，降低骨肉瘤細(xì)胞中PD-L1的表達(dá)，激活免疫調(diào)節(jié)作用，抑制腫瘤細(xì)胞的遷移和侵襲（圖3）?，F(xiàn)已明確在肝細(xì)胞肝癌中NK細(xì)胞百分比的下降和功能障礙可促進(jìn)腫瘤的進(jìn)展。Liu等研究發(fā)現(xiàn)，阿帕替尼能夠增加肝細(xì)胞肝癌移植瘤中NK細(xì)胞的浸潤(rùn)，增加腫瘤內(nèi)NK細(xì)胞比例，顯著上調(diào)NK細(xì)胞上激活受體NK細(xì)胞組群2D受體（NK group 2D receptor，NKG2D）的表達(dá)，下調(diào)共抑制受體具有Ig和ITIM結(jié)構(gòu)域的T細(xì)胞免疫受體（T cell immunoreceptor with Ig and ITIM domain，TIGIT）的表達(dá)，NK細(xì)胞活化標(biāo)志物CD69和細(xì)胞毒性分子CD107a的表達(dá)明顯增強(qiáng)，表明阿帕替尼可以逆轉(zhuǎn)腫瘤細(xì)胞中的NK細(xì)胞功能障礙，抑制腫瘤生長(zhǎng)。

圖3 阿帕替尼通過(guò)減少PD-L1的表達(dá)激活T細(xì)胞示意圖

另外，需要注意的一個(gè)問(wèn)題是，阿帕替尼可能會(huì)增加腫瘤細(xì)胞的自噬，影響其抗腫瘤作用。自噬具有雙重作用，在早期自噬可以防止腫瘤的發(fā)生并抑制腫瘤進(jìn)展；而在晚期腫瘤的低氧環(huán)境中，自噬能夠促進(jìn)腫瘤的存活和生長(zhǎng)，并促進(jìn)腫瘤轉(zhuǎn)移，目前研究顯示聯(lián)合應(yīng)用自噬抑制劑可以提高阿帕替尼的抗腫瘤效果。

綜上所述，除了抗血管生成作用外，目前的研究發(fā)現(xiàn)了阿帕替尼更多的抗腫瘤途徑，主要包括對(duì)腫瘤細(xì)胞的直接抑制作用及免疫調(diào)節(jié)等作用。這些作用主要涉及細(xì)胞內(nèi)的多條信號(hào)通路，但是針對(duì)每一種腫瘤的臨床療效及機(jī)制需要進(jìn)一步探討。