基于數(shù)據(jù)挖掘分析人組織激肽釋放酶家族在結直腸癌中的表達和預后研究

郭佩，何寧寧，夏玉軍#

1青島大學基礎醫(yī)學院，山東 青島 266071

2煙臺毓璜頂醫(yī)院放射科，山東 煙臺 264000

結直腸癌又稱大腸癌，是結腸癌和直腸癌的總稱，是人類最常見的消化道惡性腫瘤之一。在中國，隨著經濟水平的提高以及生活方式的改變，結直腸癌的發(fā)病率逐年上升。目前，結直腸癌的主要診斷方法包括腸鏡檢查、磁共振成像（magnetic resonance imaging，MRI）和異常隱窩病灶（aberrant crypt foci，ACF）檢查。目前對結直腸癌的早期診斷仍然缺乏一種高敏感性的方法。腫瘤標志物存在于組織、血液、體液和尿液中，對腫瘤的早期診斷、預后和療效評估具有重要作用。組織激肽釋放酶家族（kallikrein-related peptidase，KLK）也稱為激肽釋放酶，屬于絲氨酸蛋白酶，它們廣泛存在于機體的各個組織中，主要參與調控心血管、腎臟、神經系統(tǒng)等的生理功能。KLK的異常表達與心臟病、腎病、炎癥反應、惡性腫瘤等疾病的發(fā)生有著密切聯(lián)系，尤其是在腫瘤中，KLK異常表達提示其可作為臨床上腫瘤早期診斷的標志物。已有研究證明，KLK5、KLK10、KLK11的異常表達與卵巢癌密切相關，KLK6的高表達與胃癌的增殖和遷移密切相關，KLK3可以作為前列腺癌診斷的生物標志物，KLK7的高表達與結腸癌細胞的增殖和侵襲密切相關。雖然人們對KLK與各種惡性腫瘤的關系進行了一些研究，但是對KLK家族基因在結直腸癌中的表達及與預后的關系未進行過系統(tǒng)分析。ONCOMINE數(shù)據(jù)庫是目前世界上最大的腫瘤基因芯片數(shù)據(jù)庫和整合數(shù)據(jù)提取平臺。TCGA數(shù)據(jù)庫是目前世界上最大的腫瘤基因組信息數(shù)據(jù)庫。STRING數(shù)據(jù)庫是一個搜尋蛋白質和蛋白質之間相互作用的系統(tǒng)，以幫助研究人員更加深入地認清相關蛋白質的功能和其調控機制。GEO是功能基因組學的數(shù)據(jù)存儲庫，可以查詢和下載樣本信息以及基因組的表達概況。本研究利用ONCOMINE、TCGA及GEO數(shù)據(jù)庫進行數(shù)據(jù)挖掘，分析人KLK基因在結直腸癌中的表達和預后意義，以及KLK作為結直腸癌標志物的可能性，為研究KLK基因在結直腸癌發(fā)生發(fā)展中的作用機制提供線索和思路，現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 利用ONCOMINE數(shù)據(jù)庫提取數(shù)據(jù)

在ONCOMINE v4.5數(shù)據(jù)庫中進行注冊，獲得數(shù)據(jù)庫的使用權限。根據(jù)實驗要求設定搜索條件，設定篩選條件。①Gene：KLK1-KLK15（依次檢索KLK家族的基因）；②THRESHOLD（P-VALUE）：0.01；③THRESHOLD（FOLD CHANGE）：2；④ THRESHOLD（GENE RANK）：ALL；⑤ Data Type：All。

1.2 分析TCGA數(shù)據(jù)庫中人KLK 基因在結直腸癌組織和正常結直腸組織中的表達情況

登錄TCGA數(shù)據(jù)庫（版本v71），獲得人KLK基因在結直腸癌組織和正常結直腸組織中的表達數(shù)據(jù)。

1.3 分析TCGA數(shù)據(jù)庫中人KLK 基因表達及其與結直腸癌患者預后的關系

登錄UALCAN在線分析工具（http://ualcan.path.uab.edu/index.html），選擇TCGA數(shù)據(jù)庫的研究，設定篩選條件。①Select Cancer Study：Colorectal cancer；②Select Genomic Profiles：Expression；③Kaplan-Meier生存曲線：Survival。然后以PDF格式導出。

1.4 分析GEO數(shù)據(jù)庫中KLK 基因表達與結直腸癌患者預后的關系

選擇GEO數(shù)據(jù)庫（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/）的GSE39582系列數(shù)據(jù)，這個數(shù)據(jù)庫包括585個結直腸癌樣本。此數(shù)據(jù)系列還具有分子亞型分類以及臨床生存特征等信息。下載數(shù)據(jù)庫后，利用R軟件（https://www.r-project.org/，版本：3.5.3）分析KLK基因表達與結直腸癌患者預后的關系。根據(jù)基因的中位表達數(shù)，分為高表達和低表達。

1.5 從STRING 數(shù)據(jù)庫中提取KLK6、KLK8和KLK10基因相關的蛋白質-蛋白質作用網(wǎng)絡

進入STRING在線數(shù)據(jù)庫（https://string-db.org/），設定查找條件。①基因名稱：KLK6、KLK8和KLK10；②物種：homo（人種）；③證據(jù)來源（active interaction sources）：選擇實驗數(shù)據(jù)（Experiments）。從而得到KLK基因相關的蛋白質-蛋白質作用網(wǎng)絡。

1.6 臨床組織的獲取

臨床組織樣本來自于煙臺毓璜頂醫(yī)院，且是在患者知情同意且簽署知情同意書的情況下取得的。研究方案得到了青島大學醫(yī)學部倫理委員會批準。2018年6月至2019年5月，共收集了24例組織樣本，包括20例結直腸癌組織和4例正常結直腸組織。手術之前，患者未進行任何化療或放療。在手術切除后，組織樣本立即被冷凍在液氮中，保存于-80℃，供后續(xù)研究。

1.7 mRNA 提取和定量逆轉錄聚合酶鏈反應

根據(jù)mirVana miRNAIsolation kit（購自Thermo Fisher Scientific公司）的說明書進行操作，從組織中提取RNA。采用逆轉錄試劑盒[購自寶生物工程（大連）有限公司]進行cDNA的合成。采用Nanodrop測定cDNA的濃度。產物保存于-80℃，用于下一步的實驗。使用試劑盒Power SYBR-Green PCR Master Mix（購自Thermo Fisher Scientific公司）以及適當?shù)囊镞M行聚合酶鏈反應，采用ABI7500-fast thermocycler（購自Thermo Fisher Scientific公司）進行實驗數(shù)據(jù)的采集。以甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）作為內參，引物見表1。

表1 KLK和GAPDH基因的引物序列

1.8 統(tǒng)計學分析

采用Graphpad Prism 5及SPSS 24.0軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析。不符合正態(tài)分布的計量資料以中位數(shù)及四分位數(shù)[

M

（

Q

，

Q

）]表示，組間比較采用非參數(shù)檢驗；符合正態(tài)分布的計量資料以均數(shù)±標準差（

x-

±

s

）表示，組間比較采用

t

檢驗。采用Kaplan-Meier法繪制生存曲線，組間比較采用Logrank檢驗。采用AdobeIllustrator CS4軟件對圖片進行整理。以

P

＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 人KLK 基因在各種腫瘤類型中的表達

在ONCOMINE v4.5數(shù)據(jù)庫中共收集了包括乳腺癌、結直腸癌和肺癌等20個不同腫瘤類型的統(tǒng)計結果。結果顯示，

KLK6

、

KLK8

、

KLK10

和

KLK11

基因在結直腸癌組織中具有高水平的表達，

KLK7

和

KLK12

具有相對較高的表達水平，

KLK1

和

KLK15

具有較低的表達水平。其中

KLK6

在13組數(shù)據(jù)、

KLK8

在6組數(shù)據(jù)，

KLK10

在17組數(shù)據(jù)、

KLK11

在10組數(shù)據(jù)中顯示具有高水平的表達（且基因排序超過1%）。（圖1）

圖1 ONCOMINE數(shù)據(jù)庫中人KLK 基因在各種腫瘤類型中的表達情況

2.2 TCGA數(shù)據(jù)庫中人KLK 基因在結直腸癌組織和正常結直腸組織中的表達情況

在TCGA數(shù)據(jù)庫中獲取人

KLK

基因在結直腸癌組織和正常結直腸組織中的表達結果，對具有顯著性差異的數(shù)據(jù)進行比較分析。結果顯示，結直腸癌組織中人

KLK6

、

KLK7

、

KLK8

、

KLK10

、

KLK11

和

KLK12

基因的表達水平均明顯高于正常結直腸組織，差異均有統(tǒng)計學意義（

P

＜0.01）。（表2）

表2 TCGA數(shù)據(jù)庫中人KLK基因在結直腸癌組織和正常結直腸組織中的表達情況

2.3 人KLK 基因表達與結直腸癌預后的關系

為進一步明確人

KLK

基因表達與結直腸癌預后的關系，本研究利用UALCAN在線工具分析TCGA數(shù)據(jù)庫中人

KLK

mRNA表達水平與結直腸癌預后的相關數(shù)據(jù)。結果表明，

KLK

基因表達與結直腸癌預后無關。TCGA數(shù)據(jù)庫包括121例具有預后信息的結直腸癌組織，進一步選擇GEO數(shù)據(jù)庫中的GSE39582系列數(shù)據(jù)，此系列數(shù)據(jù)包括578例具有預后信息的結直腸癌組織。利用R軟件進行數(shù)據(jù)處理和分析，結果顯示，

KLK6

、

KLK8

、

KLK10

和

KLK12

基因低表達患者的預后分別優(yōu)于上述基因高表達的患者，差異均有統(tǒng)計學意義（

P

=0.0008、0.0392、0.0013、0.0203）（圖2）。

圖2 人KLK 基因高表達與低表達結直腸癌患者的生存曲線

2.4 臨床樣本中人KLK 基因在結直腸癌組織和正常結直腸組織中的表達

為進一步驗證

KLK

基因在結直腸癌組織中的表達情況，對臨床收集的20例結直腸癌組織和4例正常結直腸組織進行定量逆轉錄聚合酶鏈反應。結果顯示，結直腸癌組織中

KLK1

基因的表達水平低于正常結直腸組織，

KLK6

、

KLK7

、

KLK8

、

KLK10

和

KLK11

基因的表達水平均高于正常結直腸組織，差異均有統(tǒng)計學意義（

P

＜0.05）（表3）。綜合數(shù)據(jù)挖掘結果和臨床樣本驗證的結果，

KLK6

、

KLK8

和

KLK10

基因具有很高的可能性作為結直腸癌標志物。

表3 臨床樣本中人KLK基因在結直腸癌組織和正常結直腸組織中的表達水平

2.5 KLK6、KLK8和KLK10基因相關的蛋白質-蛋白質作用網(wǎng)絡

為了進一步明確與KLK6、KLK8和KLK10相互作用的蛋白，通過挖掘STRING數(shù)據(jù)庫構建KLK6、KLK8和KLK10蛋白質-蛋白質作用網(wǎng)絡。結果表明，KLK6和5個蛋白[YY1關聯(lián)因子2（YY1 associated factor 2，YAF2）、α-突觸核蛋白（alpha-synuclein，SNCA）、α2-巨球蛋白樣蛋白 1（alpha-2-macroglobulin like protein 1，A2ML1）、絲氨酸蛋白酶抑制劑Kazal型5（serine peptidase inhibitor Kazal type 5，SPINK5）和絲氨酸蛋白酶抑制劑Kazal 型 9（serine peptidase inhibitor Kazal type 9，SPINK9）]相關，KLK10 和 2 個蛋白（SPINK5 和KLK8）相關，KLK8和8個蛋白[SPINK5、SPINK9、KLK5、半胱天冬酶 1（caspase-1，CASP1）、半胱天冬酶募集結構域16（caspase recruitment domain 16，CARD16）、絲氨酸蛋白酶抑制劑B6（serine proteinase inhibitor B6，SERPINB6）、絲氨酸蛋白酶抑制劑B5（serine proteinase inhibitor B5，SERPINB5）和KLK10]相關。進一步對KLK6、KLK8和KLK10相關的10個相互作用蛋白的生物學功能進行分析，發(fā)現(xiàn)這些相互作用分子主要參與對細胞增殖和凋亡的調節(jié)。（圖3）

圖3 KLK6、KLK8和KLK10基因相關的蛋白質-蛋白質作用網(wǎng)絡圖

3 討論

結直腸癌是臨床上一種常見的消化道腫瘤，對人類的健康和生命危害極大，并且經常伴隨多種并發(fā)癥。結直腸癌的醫(yī)學研究一直是腫瘤研究的熱點之一。目前治療結直腸癌的主要方法是外科手術和結腸鏡治療，結直腸癌可經手術治愈，但術后復發(fā)轉移率高，可達40%～50%。因此，早期發(fā)現(xiàn)是治療結直腸癌的關鍵，提前發(fā)現(xiàn)將會發(fā)生癌變的患者是醫(yī)學的研究重點。發(fā)現(xiàn)有效的結直腸癌標志物對了解腫瘤成因及患者預后具有關鍵作用。

20世紀90年代中期發(fā)展起來的基因組學是生物信息學的主要研究內容之一。在病理生理、疾病檢測、藥物開發(fā)、疾病預防和功能基因組方面得到了廣泛的應用。在腫瘤研究領域，利用公開的組學數(shù)據(jù)庫尋找腫瘤標志物成為目前科學研究的重要手段之一。本研究通過ONCOMINE數(shù)據(jù)庫的整合分析發(fā)現(xiàn)，KLK6、KLK8、KLK10和KLK11基因在結直腸癌組織中具有高水平的表達，KLK7和KLK12基因具有相對較高的表達水平。通過TCGA數(shù)據(jù)庫收集KLK mRNA在結直腸癌組織和正常結直腸組織中的表達水平，結果發(fā)現(xiàn)，結直腸癌組織中人 KLK6、KLK7、KLK8、KLK10、KLK11和KLK12基因的表達水平均明顯高于正常結直腸組織（P＜0.01）。TCGA數(shù)據(jù)庫雖然是目前世界上最大的腫瘤基因組信息數(shù)據(jù)庫，但是它只有121例具有預后信息的結直腸癌組織，因此，本研究進一步選擇了GEO數(shù)據(jù)庫中包括578例具有預后信息的結直腸癌組織的GSE39582系列數(shù)據(jù)進行生存分析，采用Kaplan-Meier法繪制生存曲線。結果發(fā)現(xiàn)，KLK6、KLK8、KLK10和KLK12基因低表達患者的預后分別優(yōu)于上述基因高表達的患者，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。本研究還對臨床收集的結直腸癌組織和正常結直腸組織樣本中的KLK基因進行檢測，結果發(fā)現(xiàn)，結直腸癌組織中KLK6、KLK7、KLK8、KLK10和KLK11基因的表達水平均高于正常結直腸組織，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。綜合分析，KLK6、KLK8和KLK10基因具有很大的可能性作為結直腸癌標志物。之前的研究已經發(fā)現(xiàn)KLK6在結直腸癌中具有較高的表達水平以及靶向KLK6作為結直腸癌治療策略的可能性。另外，本研究通過挖掘STRING數(shù)據(jù)庫構建了KLK6、KLK8和KLK10基因相關的蛋白質-蛋白質作用網(wǎng)絡圖。通過分析相關的10個相互作用蛋白的生物學功能，進一步證明了KLK6、KLK8和KLK10對細胞增殖和凋亡具有調節(jié)作用。

綜上所述，本研究通過對公共數(shù)據(jù)庫中腫瘤相關基因信息和預后信息深入挖掘，發(fā)現(xiàn)KLK6、KLK8和KLK10基因在結直腸癌組織中高表達，且與結直腸癌患者的預后有關，將為進一步闡明KLK6、KLK8和KLK10在結直腸癌發(fā)生發(fā)展中的作用奠定理論基礎。