鈉尿肽受體A 在食管鱗狀細胞癌中的表達及對食管癌細胞遷移和侵襲能力的影響

趙志龍，王剛，張宏亨

寶雞市中心醫(yī)院腫瘤外科，陜西寶雞 721000

近年來，中國惡性腫瘤的發(fā)病率逐年升高，嚴重危害著人類的生命與健康，作為八大常見腫瘤之一的食管癌，在所有惡性腫瘤中的病死率居第6位，中國主要的高發(fā)地區(qū)為山西及河南。食管癌具有起病隱匿、惡性程度高、預(yù)后差、生存率低等特點。因此，尋找一種特異性表達于食管鱗狀細胞癌的分子標志物，對食管鱗狀細胞癌的早期診斷、靶向治療及預(yù)后判斷尤為重要。研究發(fā)現(xiàn)，鈉尿肽受體 A（natriuretic peptide receptor A，NPRA）在多種人類腫瘤細胞株中均高表達，參與前列腺癌、肺癌、黑色素瘤等的發(fā)生、發(fā)展，發(fā)揮著癌基因的作用，但其在食管鱗狀細胞癌中的表達情況目前尚不明確。本研究探討了NPRA在食管鱗狀細胞癌組織中的表達情況及其對食管癌細胞遷移和侵襲的影響，現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選擇2011年2月至2015年11月寶雞市中心醫(yī)院收治的食管鱗狀細胞癌患者。納入標準：經(jīng)術(shù)后病理檢查證實為食管鱗狀細胞癌；術(shù)前無化療、放療及免疫治療史；臨床資料完整。排除標準：合并其他惡性腫瘤。依據(jù)納入和排除標準，本研究共納入119例食管鱗狀細胞癌患者。其中，男85例，女34例；年齡為49～72歲，中位年齡為64歲；TNM分期：I期40例，Ⅱ期47例，Ⅲ期32例；組織學(xué)分化程度：G級37例，G級53例，G級29例；有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移53例，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移66例。收集患者的食管鱗狀細胞癌組織119例和癌旁組織91例。其中，癌旁組織為距食管鱗狀細胞癌組織邊緣2 cm以上的食管組織，病理證實無腫瘤細胞浸潤，無明顯炎癥，無明顯細胞增生等病變，其所呈現(xiàn)的為正常組織表現(xiàn)。

1.2 免疫組織化學(xué)染色法檢測NPRA的表達及結(jié)果判定

取食管鱗狀細胞癌組織和癌旁組織標本，采用甲醛固定，常規(guī)石蠟包埋，制備4 μm切片，采用免疫組織化學(xué)鏈霉菌抗生物素蛋白-過氧化物酶連結(jié)（streptavidin-perosidase，SP）法進行染色，操作步驟嚴格按照說明書進行。NPRA兔抗人多克隆抗體購自美國Santa公司，NPRA抗體稀釋濃度為1∶200。采用磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）作為陰性對照。SP試劑盒與二氨基聯(lián)苯胺（diaminobenzidine，DAB）顯色劑均購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。NPRA陽性表達主要位于細胞質(zhì)或細胞核中，呈黃色顆粒。隨機選取5個高倍視野，陽性細胞百分比評分：0%～24%為1分，25%～49%為2分，50%～74%為3分，≥75%為4分；染色強度評分：無色為0分，棕黃色1分，褐色為2分。陽性細胞百分比評分與染色強度評分相乘，0～3分為低表達，4～8分為高表達。

1.3 細胞培養(yǎng)

食管癌細胞株Eca109、TE-1以及正常食管上皮細胞株Het-1A均由西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院生物醫(yī)學(xué)實驗中心提供。將細胞置于含10%胎牛血清 、100 μg/ml鏈霉素和 100 U/ml青霉素的RPMI1640培養(yǎng)液中進行培養(yǎng)。定期換液，使用2.5 g/L胰蛋白酶[含0.2 g/L乙二胺四乙酸（ethylenediamine tetraacetic acid，EDTA）]離散細胞并用于傳代。

1.4 蛋白質(zhì)印跡法（Western blot）檢測NPRA的表達情況

將接近長滿瓶底的單層貼壁細胞用PBS輕緩洗滌2次，加入含苯甲基磺酰氟（phenylmethylsulfonyl fluoride，PMSF）的RIPA細胞裂解液，冰浴30 min，將細胞刮下置入EP管中，4℃、12 000 r/min離心15 min，取上清，置于超微量紫外分光光度計中，定量測定總蛋白濃度。取50 μg蛋白，進行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）后，半干法轉(zhuǎn)至硝酸纖維素膜上。將轉(zhuǎn)好的蛋白印跡膜在室溫下用50 g/L脫脂牛奶封閉1.5 h，應(yīng)用脫脂牛奶稀釋的一抗4℃孵育過夜，PBST洗膜10 min，共4次，應(yīng)用PBST稀釋的二抗室溫孵育1.5 h，洗膜10 min，共3次，電化學(xué)發(fā)光（electrochemiluminescence，ECL）檢測，X 光片顯影，掃描圖像，分析結(jié)果。使用Image J軟件分析條帶灰度值，以β-肌動蛋白（β-actin）為內(nèi)參，設(shè)定3個復(fù)孔，NPRA蛋白表達水平為NPRA蛋白條帶灰度值/βactin蛋白條帶灰度值。

1.5 NPRA 沉默序列的設(shè)計

采用短發(fā)夾RNA（short hairpin RNA，shRNA）沉默食管癌細胞株Eca109細胞中NPRA基因表達。根據(jù)GenBank中提供的NPRA mRNA序列，提交并委托上海吉凱生物有限公司設(shè)計并合成針對NPRA基因的沉默序列3條（sh-NPRA21897、sh-NPRA21898、sh-NPRA21899），并附1條NC序列作為陰性對照。分別將其轉(zhuǎn)染至食管癌細胞株Eca109中，作為sh-NPRA21897組、sh-NPRA21898組、sh-NPRA21899組及sh-NPRA-NC組。

1.6 Transwell 小室實驗檢測食管癌細胞株Eca109的遷移和侵襲能力

在Transwell小室中進行細胞遷移和侵襲試驗，sh-NPRA21897組、sh-NPRA21898組、sh-NPRA21899組及sh-NPRA-NC組食管癌細胞株Eca109成功轉(zhuǎn)染后，放入Transwell小室的上室，底部加入血清以誘導(dǎo)細胞進行遷移。然后培養(yǎng)8 h或24 h，細胞遷移到下室后用10%甲醛溶液固定，并采用0.5%結(jié)晶紫水合物溶液進行染色計數(shù)。

1.7 隨訪

所有患者出院后均進行5年隨訪，隨訪方式為電話或門診隨訪，隨訪截止時間為2020年1月。統(tǒng)計患者的生存情況。

1.8 統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS 18.0軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，計數(shù)資料以例數(shù)和率（%）表示，組間比較采用

χ

檢驗或Fisher確切概率法；采用Kaplan-Meier法繪制生存曲線，組間比較采用Log-rank檢驗。以

P

＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 食管鱗狀細胞癌組織和癌旁組織中NPRA表達情況的比較

食管鱗狀細胞癌組織中，NPRA陽性顆粒呈棕黃色或淡黃色，主要位于細胞質(zhì)和細胞膜中；癌旁組織中NPRA著色較弱甚至無色，陰性對照中未見棕黃色顆粒（圖1）。NPRA在食管鱗狀細胞癌組織中的高表達率為69.7%（83/119），明顯高于癌旁組織的27.5%（25/91），差異有統(tǒng)計學(xué)意義（

χ

=36.894，

P

＜0.01）。

圖1 NPRA 在食管鱗狀細胞癌組織、癌旁組織及陰性對照中的表達情況

2.2 不同臨床特征食管鱗狀細胞癌患者食管鱗狀細胞癌組織中NPRA 表達情況的比較

不同年齡、性別、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況、腫瘤部位的食管鱗狀細胞癌患者食管鱗狀細胞癌組織中NPRA的高表達率比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（

P

＞0.05）。分化程度為G～G級、TNM分期為Ⅱ～Ⅲ期的食管鱗狀細胞癌患者食管鱗狀細胞癌組織中NPRA的高表達率分別明顯高于分化程度為G級、TNM分期為I期的患者，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（

P

＜0.01）。（表1）

表1 不同臨床特征食管鱗狀細胞癌患者食管鱗狀細胞癌組織中NPRA表達情況的比較（n=119）

2.3 生存情況的比較

NPRA低表達患者的5年生存情況優(yōu)于NPRA高表達患者，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（

χ

=5.032，

P

=0.025）。（圖 2）

圖2 NPRA高表達（n=83）和NPRA低表達（n=36）食管鱗狀細胞癌患者的生存曲線

2.4 食管癌細胞株Eca109、TE-1以及正常食管上皮細胞株Het-1A中NPRA表達情況的比較

Western blot檢測結(jié)果顯示，NPRA在食管癌細胞株Eca109、TE-1中的表達水平分別為（0.68±0.03）和（0.57±0.02），均高于正常食管上皮細胞株Het-1A的（0.05±0.02），差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（

t

=15.365、13.893，

P

＜0.05）；而食管癌細胞株Eca109、TE-1中NPRA的表達水平比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（

P

＞0.05）。（圖3）

圖3 Western blot 檢測食管癌細胞株Eca109、TE-1以及正常食管上皮細胞株Het-1A中NPRA的表達情況

2.5 不同組別食管癌細胞株Eca109中NPRA表達情況的比較

Western blot檢測結(jié)果顯示，sh-NPRA21897組、sh-NPRA21898組、sh-NPRA21899組中NPRA的表達水平分別為（0.08±0.03）、（0.06±0.02）、（0.09±0.03），均低于sh-NPRA-NC組的（0.78±0.02），差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（

t

=32.135、35.362、28.733，

P

＜0.05）。（圖4）

圖4 Western blot 檢測不同組別食管癌細胞株Eca109中NPRA的表達情況

2.6 NPRA 對食管癌細胞株Eca109細胞遷移和侵襲的影響

使用未加基質(zhì)膠的Transwell小室測定細胞的遷移能力，加基質(zhì)膠的Transwell小室測定細胞的侵襲能力。結(jié)果顯示，sh-NPRA21897組、sh-NPRA21898組、sh-NPRA21899組細胞的遷移數(shù)目和侵襲數(shù)目均明顯低于sh-NPRA-NC組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（

P

＜0.01）。（表2、圖5）

表2 不同組別食管癌-細胞株Eca109中細胞遷移和侵襲數(shù)目的比較（個，x±s）

圖5 Transwell 實驗檢測不同組別食管癌細胞株Eca109的遷移和侵襲情況（結(jié)晶紫染色，×200）

3 討論

NPRA是鈉尿肽受體家族中的一員，主要通過與心房鈉尿肽（atrial natriuretic peptide，ANP）和腦鈉尿肽（brain natriuretic peptide，BNP）結(jié)合來發(fā)揮其病理生理作用。文獻檢索后發(fā)現(xiàn)，NPRA在心血管系統(tǒng)中的研究較多，作用較為明確，其對舒張血管、抑制心肌纖維化、維持心血管穩(wěn)定具有顯著作用。隨著對NPRA研究的不斷深入，發(fā)現(xiàn)NPRA亦參與了機體的免疫和炎癥反應(yīng)，在肺癌、前列腺癌等多種惡性實體腫瘤組織與細胞中均顯著高表達，參與了腫瘤的發(fā)生與發(fā)展過程，但其具體作用機制尚不明確。對其信號通路的研究發(fā)現(xiàn)，通過產(chǎn)生第二信使環(huán)磷酸鳥苷（cyclic guanosine monophosphate，cGMP）和活化型依賴cGMP的蛋白激酶（cGMP-dependent protein kinase，PKG），活化的PKG反過來激活離子轉(zhuǎn)運蛋白和轉(zhuǎn)錄因子，共同影響細胞的增殖和凋亡過程。NPRA在腫瘤中的特異性表達有望成為腫瘤診斷與預(yù)后預(yù)測的分子標志或治療靶點。

NPRA在人類多種惡性腫瘤組織或細胞中高表達，其表達水平與腫瘤的惡性程度有關(guān)。本研究結(jié)果顯示，食管鱗狀細胞癌組織中，NPRA陽性顆粒呈棕黃色或淡黃色，主要位于細胞質(zhì)和細胞膜中。NPRA在食管鱗狀細胞癌組織中的高表達率為69.7%，明顯高于癌旁組織的27.5%，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（

P

＜0.01）。該結(jié)果與Wang等在前列腺癌中的研究結(jié)果一致，NPRA在前列腺癌組織和高級上皮內(nèi)瘤變組織中的表達水平明顯高于正常前列腺組織和良性前列腺增生組織；NPRA在前列腺癌中主要定位在細胞質(zhì)，但在多數(shù)良性前列腺增生和輕度上皮內(nèi)瘤變的細胞質(zhì)中NPRA染色卻非常少，而主要表達在這類細胞的細胞核中，提示

NPRA

在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中具有促癌作用，發(fā)揮著癌基因的功能。前列腺癌中NPRA高表達可能與炎癥因子白細胞介素（interleukin，IL）-6、巨噬細胞抑制因子（macrophage inhibition factor，MIF）有關(guān)，Wang等也通過基因敲除技術(shù)證明了這點，并推測NPRA可能是MIF的上游調(diào)控因子，其可能通過MIF調(diào)控IL-6的表達，從而發(fā)揮促癌作用，但其具體的作用機制仍需進一步研究。

本研究對患者的臨床特征及生存情況進行分析，結(jié)果顯示，分化程度為G～G級、TNM分期為Ⅱ～Ⅲ期的食管鱗狀細胞癌患者食管鱗狀細胞癌組織中NPRA的高表達率分別明顯高于分化程度為G級、TNM分期為I期的患者，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。NPRA低表達患者的5年生存情況優(yōu)于NPRA高表達患者。Zhang等在胃癌細胞和組織中研究NPRA的表達時發(fā)現(xiàn)，沉默NPRA的表達后，電壓門控鉀離子通道蛋白KCNQ1的表達明顯降低，同時在一定程度上抑制了腫瘤細胞的增殖和轉(zhuǎn)移，而對其預(yù)后生存的研究發(fā)現(xiàn)NPRA蛋白高表達提示著更差的預(yù)后。

Kong等在研究NPRA基因敲除小鼠的生物學(xué)性狀時發(fā)現(xiàn)，與正常小鼠相比，NPRA基因敲除小鼠支氣管灌洗液中 IL-4、IL-5、IL-6 等促炎因子水平明顯降低，具有更嚴重的氣道阻塞癥狀和杯狀細胞化生等；核因子κB（nuclear factor of kappa B，NF-κB）已被證實在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中具有重要作用，可能在腫瘤晚期階段通過誘導(dǎo)細胞凋亡而發(fā)揮作用，如在肝癌、乳腺癌等多種腫瘤細胞系中均發(fā)現(xiàn)了NF-κB處于活化狀態(tài)。在NPRA基因敲除小鼠中，可以觀察到NF-κB活性降低，促炎因子減少，提示NPRA的表達與炎癥反應(yīng)密切相關(guān)，其可能是通過抑制腫瘤相關(guān)炎癥反應(yīng)而間接對腫瘤生長產(chǎn)生抑制作用。研究提示，在敲除NPRA基因的小鼠心肌纖維中，基質(zhì)金屬蛋白酶（matrix metalloproteinase，MMP）2與MMP9的表達量明顯增加了3～5倍，同時NF-κb的信號也增強了4倍。本研究結(jié)果顯示，NPRA基因敲除后可以明顯降低食管癌細胞的遷移和侵襲能力，之后將對其下游分子進一步研究，分析NPRA是否與腫瘤侵襲與轉(zhuǎn)移相關(guān)因子MMP2和MMP9相關(guān)。

基因治療是目前腫瘤治療的一個熱點，尋找有助于腫瘤早期診斷、靶向治療、預(yù)后判斷的分子標志物顯得尤為重要。本研究通過細胞及組織學(xué)層面推測NPRA在食管鱗狀細胞癌中發(fā)揮著癌基因的作用，且其高表達與腫瘤的TNM分期、分化程度以及預(yù)后密切相關(guān)，并可促進食管癌細胞的侵襲與遷移，至于哪些基因在食管鱗狀細胞癌中被NPRA調(diào)控，還有待后續(xù)對其上下游調(diào)控因子進一步研究。