整合轉(zhuǎn)錄組學識別食管鱗癌關(guān)鍵基因細胞周期蛋白依賴性激酶抑制因子3

王萬鵬，張啟迪，傅承宏，陳皓瑜，周素芹，劉艷艷，何中祥，宋 堅，濮 娟

（1.南京醫(yī)科大學康達學院附屬漣水人民醫(yī)院放療科，江蘇 淮安 223400；2.南京醫(yī)科大學康達學院附屬漣水人民醫(yī)院中心實驗室，江蘇 淮安 223400；3.上海交通大學醫(yī)學院附屬上海市第一人民醫(yī)院消化科，上海 200080）

食管鱗狀細胞癌（esophageal squamous cell carcinoma，ESCC）占食管癌中的約90%，是起源于食管鱗狀上皮系統(tǒng)的惡性腫瘤，其發(fā)病是多階段、多基因、多步驟的聯(lián)合作用導致[1]。隨著腫瘤大數(shù)據(jù)的普及，網(wǎng)絡(luò)公共平臺也提供了大量的腫瘤組學數(shù)據(jù)，為研究腫瘤的生物學本質(zhì)提供了極大的便利。但單個研究樣本量較小，且各研究間存在批次、標本獲取方法、實驗?zāi)康幕驅(qū)嶒灄l件的不同，結(jié)果差異較大。雖然不同的數(shù)據(jù)整合方法也相繼出現(xiàn)，但由于每種方法都有各自的不足，限制了其廣泛應(yīng)用[2]。本研究采用秩聚合（RRA）方法整合來自公共平臺的多套ESCC 表達譜數(shù)據(jù)，在獲取相關(guān)差異表達基因（DEGs）后通過構(gòu)建蛋白互作（PPI）網(wǎng)絡(luò)進行基因模塊挖掘，使用TCGA 數(shù)據(jù)庫中的ESCC 表達數(shù)據(jù)及免疫組化方法加以實驗驗證，以期尋找影響ESCC 發(fā)病機制的關(guān)鍵基因，為進一步探究ESCC 生物標志物和分子靶點提供新的科學思路。

1 資料與方法

1.1 資料來源 收集基因表達綜合數(shù)據(jù)庫（gene expression omnibus，GEO）中ESCC 轉(zhuǎn)錄組表達譜數(shù)據(jù)原始文件（raw data）。收集標準：包含癌組織及及癌旁組織且各組至少包含3 例。共收集到9 個系列的ESCC 表達譜數(shù)據(jù)：GSE77861、GSE77861、GSE100942、GSE26886、GSE17351、GSE38129、GSE33426、GSE20347、GSE23400。各數(shù)據(jù)集資料見圖1。

圖1 9 個ESCC 表達譜數(shù)據(jù)

1.2 數(shù)據(jù)預處理及整合轉(zhuǎn)錄組學差異基因分析 采用R 語言（3.6.2 版）中的Affy 包對原始數(shù)據(jù)進行預處理，包括ReadAffy 函數(shù)讀取原始文件，RMA 函數(shù)歸一化及對數(shù)化，KNN 法補充缺失值[3]，若多個探針對應(yīng)同一基因名稱，則采用平均值法得到基因表達值。limma 包進行差異表達值計算，貝葉斯法多重檢驗校正，得到不同數(shù)據(jù)集中各基因的校正P 值及倍數(shù)變化（FC）對數(shù)值的絕對值，即|Log2FC|。得到9 個差異表達矩陣后，使用R 語言包“Robustrankaggreg”對數(shù)據(jù)集中的基因進行整合，“Robustrankaggreg”包是基于RRA 方法，該方法基于不相關(guān)輸入的無效假設(shè)篩選出持續(xù)優(yōu)于預期的基因，最終通過貝葉斯校正得出各基因的矯正P值[2]。各基因的Log2FC 由各數(shù)據(jù)集中基因的Log2FC 平均值得出。最終選擇閾值為|Log2FC|≥1.5，P＜0.05 的基因作為DEGs。

1.3 蛋白互作（PPI）網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建和模塊挖掘 應(yīng)用STRING（https://string-db.org/）數(shù)據(jù)庫分析所得DEGs 的蛋白互作網(wǎng)絡(luò)，閾值設(shè)置為confidence score≥0.4，并通過Cytoscape 3.5.1 軟件進行可視化處理。使用插件Molecular Complex Detection（MCODE）對PPI 網(wǎng)絡(luò)進行模塊分析，參數(shù)設(shè)置為節(jié)點度閾值（degree cutoff）＞5，鄰節(jié)點個數(shù)（k-core）＞5，余均為默認設(shè)置。

1.4 關(guān)鍵基因mRNA 水平驗證 關(guān)鍵基因的mRNA表達水平驗證使用來自TCGA 數(shù)據(jù)庫中ESCC 數(shù)據(jù)。從UCSC 癌癥基因組瀏覽器（http://xena.ucsc.edu/welcome-to-ucsc-xena/）中下載來源于TCGA 的食管癌表達數(shù)據(jù)及對應(yīng)樣本的臨床資料，數(shù)據(jù)集名為“GDC TCGA Esophageal Cancer（ESCA）”，該數(shù)據(jù)集基于IlluminaHiSeq RNASeq V2 高通量RNA 測序平臺，表達數(shù)據(jù)已經(jīng)經(jīng)過歸一化的相對值。提取其中具有臨床資料的81 例ESCC 患者癌組織和11 例對照的數(shù)據(jù)進行分析。

1.5 病例收集 收集我院2013 年1 月～2015 年12 月就診的184 例ESCC 患者病理資料及蠟塊，其中男157 例，女27 例，年齡36～86 歲。納入標準：①經(jīng)過我院病理科證實病理類型為ESCC；②取樣本前均未行放化療；③入院前無感染病史和血液性疾病。排除標準：①臨床資料不全者；②伴隨嚴重感染或者自身免疫性疾病者。另外收集同期50 例癌旁組織（距離癌組織邊緣5 cm 以上）作為對照。

1.6 免疫組織化學檢測蛋白表達 CDKN3 抗體購自美國Abcam 公司（貨號：ab175393）。石蠟塊來自于我院病理科長期保存，制成4 μm 組織切片，常規(guī)脫蠟、水洗后與加入一抗（1∶200），于4 ℃濕盒內(nèi)過夜。二抗37 ℃孵育30 min、PBS 液清洗后滴加辣根過氧化物酶并于37 ℃溫箱內(nèi)孵育30 min，DAB 顯色，蘇木素復染細胞核、封片。以腫瘤細胞染色強度和陽性細胞比例進行計分，評分標準按照文獻[4]。

1.7 統(tǒng)計學分析 使用SPSS 22.0 整理及分析數(shù)據(jù)，Graphpad prime 5 制作統(tǒng)計圖片。計數(shù)資料使用KS 檢驗檢測正態(tài)分布情況，符合正態(tài)分布的計量資料使用（）表示，組間比較采用t檢驗；偏態(tài)分布資料使用四分位間距（IQR）表示，組間比較使用Mann-Whitney 檢驗；計數(shù)資料使用（n，%）表示，若出現(xiàn)理論頻次小于5 則使用Fisher 確切概率法計算相應(yīng)的χ2值和P值。所有P值均為雙尾檢驗，P＜0.05 認為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 整合轉(zhuǎn)錄分析識別差異表達基因 對GEO 數(shù)據(jù)庫中下載得到的9 套基因表達譜進行整合分析后，以|Log2FC| ≥1.5、P＜0.05 為標準，共得到ESCC 相關(guān)DEGs 244 個，其中上調(diào)93 個、下調(diào)151 個。上調(diào)和下調(diào)排名前10 位的基因見圖2。

2.2 PPI 網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建和模塊挖掘 將得到的244 個DEGs 輸入STRING 數(shù)據(jù)庫，共得到194 個節(jié)點、864個連接的PPI 網(wǎng)絡(luò)，見圖3A。為了進一步探究PPI網(wǎng)絡(luò)中可能存在的具有核心意義的蛋白互作模塊，利用Cytoscape 軟件中的MCODE 插件在網(wǎng)絡(luò)中進行了模塊挖掘和分析，結(jié)果顯示得分最高（score=23.304）的蛋白模塊包含24 個節(jié)點和268 個連接，見圖3B，其中種子（seed）基因為細胞周期蛋白依賴性激酶抑制因子3（Cyclin-dependent kinase inhibitor 3，CDKN3）。

2.3 CDKN3 mRNA 在ESCC 中的表達驗證 TCGA數(shù)據(jù)庫分析結(jié)果示，ESCC 組織中CDKN3 相對表達量為3.291（IQR：2.833～3.659），11 例對照組織相對表達量為1.184（IQR：0.734～1.720），兩者比較，差異有統(tǒng)計學意義（U=18.000，P＜0.05），見圖4A。受試者工作特性曲線（ROC）結(jié)果顯示，曲線下面積（AUC）為0.980，以2.149 為截斷值，其特異性為90.91%（95%CI：58.72%～99.77%），敏感性為92.59%（95%CI：84.57%～97.23%），見圖4B。

圖2 ESCC 差異表達基因

圖3 蛋白互作用網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

圖4 CDKN3 mRNA 在ESCC 及癌旁組織中的表達

2.4 CDKN3 蛋白在ESCC 中的表達 免疫組織化學法檢測結(jié)果顯示，50 例對照組織中CDKN3 蛋白陰性表達34 例（68.00%），陽性表達16 例（32.00%）；184 例ESCC 組織中，陰性表達71 例（38.59%），CDKN3 陽性表達113 例（61.41%），ESCC 組織中CDKN3 蛋白陽性表達率高于對照組織，差異有統(tǒng)計學意義（χ2=13.750，P＜0.05），見圖5。

圖5 CDKN3 在ESCC 及癌旁組織中的表達（×400）

2.5 CDKN3 蛋白表達與ESCC 患者臨床病理特征的關(guān)系 單因素分析顯示，不同性別、年齡、T 及M 分期的ESCC 患者CDKN3 蛋白表達比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；不同N 分期及臨床分期的ESCC患者CDKN3 蛋白表達比較，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），見表1。

表1 CDKN3 蛋白表達與ESCC 患者臨床特征關(guān)系（n）

3 討論

雖然與過去相比，ESCC 的診斷及治療手段已明顯進步，但由于其起病隱匿及高度惡性的特點，患者預后仍很差，約10%的患者被診斷時已為晚期，腫瘤已擴散到其他器官[5，6]。近年來，隨著微陣列和高通量測序技術(shù)的不斷發(fā)展，腫瘤研究進入大數(shù)據(jù)時代，通過高通量技術(shù)對腫瘤的檢測不僅可以明確其遺傳學改變，還可以了解腫瘤患者的個體化情況，輔助腫瘤個體化治療。但對于不同的研究，其重復性仍然不能令人完全滿意，主要原因如下：①各單獨實驗所包含的疾病例數(shù)較少；②各中心標本取材、存儲手段及條件等客觀因素的存在，因此標本質(zhì)量也無法完全一致；③各中心的高通量數(shù)據(jù)往往基于不同的平臺。因此，不同中心所得出的高通量數(shù)據(jù)之間無論是在數(shù)據(jù)表達還是數(shù)據(jù)構(gòu)成上均存在差異，這種差異易造成假陽性及假陰性的產(chǎn)生。

基于此，面對各種不同平臺提供的海量高通量數(shù)據(jù)，一方面給予研究人員提供了極大的便利，一方面又對于數(shù)據(jù)整合方法提出了新的要求。目前常用的數(shù)據(jù)整合方法主要包括：①通過分析不同表達譜的差異基因[7]，然后取得交集。雖然這種方法非?？煽浚诓僮饕讈G失大量的信息，產(chǎn)生假陰性；②可采用R 語言sva 包中combat 函數(shù)去除批次效應(yīng)[8]，但這種方法存在一定的缺點：需要被合并的表達矩陣必須具有相同的探針，因此只能在同一平臺內(nèi)合并，跨平臺整合數(shù)據(jù)則無法實現(xiàn)，最終仍需要取得基于不同平臺的DEGs 交集。本研究采取秩聚合方法進行整合不同表達譜，主導思想是通過不同實驗的差異分析結(jié)果，優(yōu)先排序的基因列表是基因組數(shù)據(jù)分析應(yīng)用程序中常見的結(jié)果表示方法[2]。因此，秩聚合方法可以成為這一類問題有用且通用的解決方案，通過這種方法不再受限于平臺，同時又可以擴大樣本量。最終本研究得到DEGs 共244 個，其中多個基因已經(jīng)被報道在ESCC 中發(fā)揮著重要作用，如MMP1[9]、MAGEA6[10]、MAL[11]等，該結(jié)果從側(cè)面說明了秩聚合方法的可靠性。

ESCC 發(fā)生機制極其復雜，涉及多種通路及因子，但傳統(tǒng)的生物學研究以單基因或蛋白為出發(fā)點，難以對系統(tǒng)進行全面的探索?；诖?，本研究通過構(gòu)建由DEGs 組成的PPI 網(wǎng)絡(luò)，并挖掘其中重要的基因互作模塊，結(jié)果顯示其中最重要的PPI 模塊由FOXM1[12]、DTL[13]等24 個基因構(gòu)成的模塊，既往研究也顯示其中很多基因也被認為是ESCC 相關(guān)基因。進一步分析顯示，該基因模塊的中心基因為CDKN3，因此可以推斷其生物功能在ESCC 的發(fā)生發(fā)展中具有核心地位。CDKN3 是一種細胞周期調(diào)控蛋白，可直接或間接與細胞周期蛋白依賴性激酶（cyclin-dependent protein kinase，CDK）等細胞周期調(diào)控因子作用，參與細胞周期調(diào)控，因此與多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[14]。本研究結(jié)果顯示，ESCC 組織中CDKN3 mRNA 表達量較正常組織升高；以2.149為截斷值，CDKN3 mRNA 對于ESCC 具有較高的診斷價值，其特異性為90.91%，敏感性為92.59%。此外，通過免疫組織化學，進一步驗證了CDKN3 在蛋白水平的表達異常，初步提示CDKN3 可能參與ESCC 的進展。同時，有研究已經(jīng)在細胞水平證實CDKN3 可以通過依賴或非依賴的AKT 信號通路參與ESCC 的增殖、侵潤及轉(zhuǎn)移，這也在分子水平佐證了本研究所用生物信息學方法的可靠性。

綜上所述，CDKN3 在食管鱗狀細胞癌組織及癌旁組織中表達存在差異，其可能是食管鱗狀細胞癌的關(guān)鍵基因；另外，CDKN3 的表達與患者N 分期及臨床分期有關(guān)，其可作為臨床診斷食管鱗狀細胞癌的生物標志物。