七葉皂苷鈉通過調(diào)節(jié)Keap1/Nrf2/HO-1信號通路抑制神經(jīng)元細(xì)胞凋亡改善蛛網(wǎng)膜下腔出血后的早期腦損傷

李侑埕，陳立剛，孔睿，梁國標(biāo)

（1.錦州醫(yī)科大學(xué)北部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院研究生培養(yǎng)基地神經(jīng)外科，遼寧沈陽 121001；2.北部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院神經(jīng)外科，遼寧沈陽 110016）

蛛網(wǎng)膜下腔出血（subarachnoid hemorrhage，SAH）具有相當(dāng)高的死亡率和發(fā)病率[1-2]。因此，預(yù)防和減輕蛛網(wǎng)膜下腔出血后的腦損傷具有重要的意義。目前，早期腦損傷（early brain injury，EBI）被指出可能是蛛網(wǎng)膜下腔出血患者的主要死亡原因[3]，成為新的研究熱點。天師栗，是七葉樹科植物天師栗Aesculus wilsoniiRehd.及七葉樹A.chinensisBge.的果實或種子，通稱娑羅子，具有寬中、下氣、殺蟲的功效，用于治療胃寒疼痛，脘腹脹滿，疳積蟲痛，痢疾，瘧疾。七葉皂苷鈉是天師栗成熟種子的三萜皂苷的鈉鹽提取物。研究表明，七葉皂苷鈉具有抗炎、消腫、抗?jié)B出，改善微循環(huán)、增強血管張力收縮性，抗氧化、清除自由基，抗腫瘤，神經(jīng)保護(hù)等作用，對軟組織損傷、心腦血管疾病和滲出性疾病具有治療價值[4]。已有大量臨床和實驗研究表明，七葉皂苷鈉對腦損傷有修復(fù)作用[5]?；诖?，本研究探討七葉皂苷鈉是否對蛛網(wǎng)膜下腔出血后的早期神經(jīng)損傷發(fā)揮保護(hù)作用，以期為七葉皂苷鈉臨床治療蛛網(wǎng)膜下腔出血提供依據(jù)?，F(xiàn)將研究結(jié)果報道如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物雄性C57BL/6J小鼠，體質(zhì)量18～22 g，清潔級，購自北部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院實驗動物中心，實驗動物生產(chǎn)許可證號：SCXK（遼）2014-0002。小鼠分籠飼養(yǎng)，每籠5～8只，飼養(yǎng)室溫為23～25℃，相對濕度40%～80%，自由飲水進(jìn)食。本研究獲北部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院實驗動物倫理委員會批準(zhǔn)。

1.2 藥物、試劑與儀器七葉皂苷鈉購自山東綠葉制藥有限公司（批號：H20003239），分子量1 124.2。七葉皂苷鈉用生理鹽水使之充分溶解，工作液濃度為2.8 mg/kg，現(xiàn)用現(xiàn)配[6]。Kelch樣環(huán)氧氯丙烷相關(guān)蛋白1（Keap1）、血紅素氧合酶1（HO-1）等抗體（美國Abcam公司）；核因子E2相關(guān)因子2（Nrf2）、β-actin（美國Santa Cruz公司）；伊文思藍(lán)（美國Sigma-Aldrich公司）；二喹啉甲酸（BCA）蛋白定量試劑盒、放射免疫沉淀分析（RIPA）裂解液、原位末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶（TdT）標(biāo)記（TUNEL）染色試劑盒、4’，6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）、電化學(xué)發(fā)光（ECL）試劑盒（碧云天公司）；神經(jīng)元核抗原（NeuN）抗體（美國Abcam公司）；Alexa Fluor 594熒光抗體（美國Sigma公司）。ar-2130型分析天平（美國安泰克公司）；dhg-9240a型鼓風(fēng)干燥箱（上海精密科學(xué)儀器公司）；rad3cell型微量蛋白電泳儀（美國北京伯樂分析生化儀器公司）。

1.3 分組、造模與給藥將小鼠隨機分為3組，包括假手術(shù)組（32只）、模型組（48只）、七葉皂苷鈉組（38只）。參考文獻(xiàn)[3，7]采用頸內(nèi)動脈穿刺法建立小鼠蛛網(wǎng)膜下腔出血模型。方法：將小鼠用10 g/L戊巴比妥鈉（35 mg/kg）腹腔注射麻醉后，仰臥位固定，顯露頸總動脈、頸內(nèi)動脈和頸外動脈，結(jié)扎頸外動脈；經(jīng)頸外動脈向頸內(nèi)動脈插入4-0尼龍線，進(jìn)一步插入顱內(nèi)頸內(nèi)動脈，直到感覺到阻力，然后再推入5 mm，以穿透頸內(nèi)動脈壁。假手術(shù)組接受除不刺穿頸內(nèi)動脈外相同的手術(shù)。造模結(jié)束1 h后，七葉皂苷鈉組小鼠給予一次性腹腔注射七葉皂苷鈉2.8 mg/kg，假手術(shù)組和模型組小鼠給予一次性腹腔注射等體積生理鹽水。

1.4 觀察指標(biāo)與方法

1.4.1 神經(jīng)功能評分 于蛛網(wǎng)膜下腔出血后24 h行盲法評定神經(jīng)學(xué)評分，包括改良的Garcia評分和平衡木測試[8]。改良的Garcia評分細(xì)則見表1。平衡木測試：將90 cm長、1 cm寬的圓柱形橫木放在2個平板中間，實驗前將大鼠在兩側(cè)平板上分別放置10 s，然后把大鼠放在橫木中間，觀察其移動。根據(jù)步行距離進(jìn)行評分：40 s內(nèi)沒有移動，且直接從橫木上跌落，計0分；40 s內(nèi)沒有跌落，也沒有移動，計1分；40 s內(nèi)移動了22 cm（放置位置到平板的一半）并且停留在該位置至少25 s，計2分；40 s內(nèi)移動了超過22 cm（放置位置到平板的一半）并且停留在該位置至少25 s，計3分；40 s內(nèi)到達(dá)平板或者25 s內(nèi)走完一半的距離沒爬上平板，計4分；25 s內(nèi)到達(dá)平板，計5分。計算連續(xù)次試驗的平均得分。分?jǐn)?shù)越高，表示神經(jīng)功能越好。

1.4.2 蛛網(wǎng)膜下腔出血分級 深度麻醉小鼠后取腦組織，進(jìn)行蛛網(wǎng)膜下腔出血評分[9]。將Willis動脈環(huán)和基底動脈環(huán)分為6段，根據(jù)蛛網(wǎng)膜下腔血凝塊的多少，各節(jié)段評分0～3分。蛛網(wǎng)膜下腔出血分級分為3組：輕度，0～7分；中度，8～12分；重度：13～18分。

1.4.3 腦含水量 于蛛網(wǎng)膜下腔出血后24 h深麻醉小鼠取腦。取出后立即稱濕質(zhì)量，在10℃烘箱中烘干72 h后稱干質(zhì)量，計算腦含水量。公式[10]：腦含水量=（濕質(zhì)量-干質(zhì)量）/濕質(zhì)量×100%。

1.4.4 伊文思藍(lán)滲出法檢測血腦屏障完整性 于蛛網(wǎng)膜下腔出血后24 h，經(jīng)尾靜脈注射伊文思藍(lán)染料（20 g/L；5 mL/kg）。60 min后深度麻醉小鼠，經(jīng)心內(nèi)灌注磷酸鹽緩沖液（PBS）去除血管內(nèi)伊文思藍(lán)。取出大腦，稱量腦組織加入PBS勻漿，以5 000×g離心40 min。將上清液與等體積的含有三氯乙酸和乙醇（1∶3）的溶液混合，4℃孵育過夜，以15 000×g離心30 min，取上清液。用熒光分光光度計測定上清液中伊文思藍(lán)的濃度。

1.4.5 TUNEL/NeuN/DAPI三色免疫熒光染色法觀察神經(jīng)元細(xì)胞凋亡 將腦組織切片用蛋白酶37℃消化15 min，PBS水洗，滴加TDT+DIGUTP混合液，37℃孵育2 h，PBS水洗；滴加封閉液置室溫孵育30 min，滴加抗地高辛抗體+NeuN抗體混合液4℃孵育過夜。PBS洗后滴加熒光二抗37℃孵育30 min。最后以DAPI復(fù)染細(xì)胞核，顯微鏡下觀察。計數(shù)TUNEL和NeuN陽性細(xì)胞數(shù)。

1.4.6 蛋白免疫印跡法檢測腦組織Keap1、Nrf2、HO-1表達(dá) 于蛛網(wǎng)膜下腔出血后24 h取小鼠左側(cè)大腦半球，加入RIPA裂解液提取蛋白，用BCA試劑盒進(jìn)行蛋白定量。用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）分離蛋白，并轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上，分別與Keap1、Nrf2、HO-1、β-actin等一抗共同置于4℃孵育過夜，再以二抗室溫處理1 h。用ECL試劑盒將電泳條帶可視化，用ImageJ軟件分析電泳條帶的灰度值。以β-actin為內(nèi)參，以目的蛋白的灰度值與β-actin灰度值的比值表示目的蛋白的相對表達(dá)水平。

1.5 統(tǒng)計方法采用Graph Pad Prism 5軟件和SPSS 16.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多組比較用單因素方差分析，然后進(jìn)行Tukey事后檢驗。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 七葉皂苷鈉對蛛網(wǎng)膜下腔出血小鼠死亡率、出血量及神經(jīng)功能的影響圖1-A結(jié)果顯示，假手術(shù)組小鼠死亡率為0%（0/32），模型組小鼠死亡率為33.33%（16/48），七葉皂苷鈉組為15.79%（6/38），表明七葉皂苷鈉干預(yù)后明顯降低了蛛網(wǎng)膜下腔出血小鼠的死亡率。圖1-B結(jié)果顯示，模型組小鼠蛛網(wǎng)膜下腔出血評分較假手術(shù)組顯著增加（P＜0.05），七葉皂苷鈉組小鼠蛛網(wǎng)膜下腔出血評分較模型組顯著降低（P＜0.05），表明七葉皂苷鈉可減少蛛網(wǎng)膜下腔出血小鼠的出血量。對蛛網(wǎng)膜下腔出血后24 h小鼠神經(jīng)功能進(jìn)行評估，結(jié)果如圖1-C、D所示，模型組Garcia評分和平衡木測試評分較假手術(shù)組顯著降低，而七葉皂苷鈉組Garcia評分和平衡木測試評分較模型組升高（P＜0.05），提示七葉皂苷鈉能夠促進(jìn)蛛網(wǎng)膜下腔出血小鼠神經(jīng)功能的恢復(fù)。

圖1 七葉皂苷鈉對蛛網(wǎng)膜下腔出血小鼠死亡率、出血量及神經(jīng)功能的影響Figure 1 Effects of sodium aescinate on mortality，subarachnoid hemorrhage and nerve function in mice with subarachnoid hemorrhage

2.2 七葉皂苷鈉對小鼠蛛網(wǎng)膜下腔出血后血腦屏障的影響圖2-A結(jié)果顯示，模型組小鼠蛛網(wǎng)膜下腔出血后24 h腦含水量較假手術(shù)組顯著增加，七葉皂苷鈉組腦含水量較模型組顯著減少。表明七葉皂苷鈉給藥后可顯著減少小鼠蛛網(wǎng)膜下腔出血引起的腦水腫。圖2-B結(jié)果顯示：與假手術(shù)組比較，模型組小鼠腦組織伊文思藍(lán)滲出量增加（P＜0.05）；與模型組比較，七葉皂苷鈉組腦組織伊文思藍(lán)滲出量減少（P＜0.05）。表明小鼠蛛網(wǎng)膜下腔出血后24 h全腦血腦屏障完整性被破壞，七葉皂苷鈉可減輕腦水腫，對全腦血腦屏障有保護(hù)作用。

圖2 七葉皂苷鈉對小鼠蛛網(wǎng)膜下腔出血后血腦屏障的影響Figure 2 Effects of sodium aescinate on blood-brain barrier in mice with subarachnoid hemorrhage

2.3 七葉皂苷鈉對小鼠蛛網(wǎng)膜下腔出血后神經(jīng)元凋亡的影響采用TUNEL/NeuN/DAPI三色免疫熒光染色法觀察七葉皂苷鈉對小鼠蛛網(wǎng)膜下腔出血后神經(jīng)元凋亡的影響，“NeuN”標(biāo)志神經(jīng)元細(xì)胞，“TUNEL”染色顯示凋亡細(xì)胞，“Merge”表示神經(jīng)元細(xì)胞凋亡，如圖3所示。圖4結(jié)果表明，模型組蛛網(wǎng)膜下腔出血小鼠神經(jīng)元凋亡陽性細(xì)胞數(shù)目增加，而七葉皂苷鈉干預(yù)后神經(jīng)元凋亡陽性細(xì)胞數(shù)目減少，表明七葉皂苷鈉能夠抑制小鼠蛛網(wǎng)膜下腔出血后神經(jīng)元細(xì)胞的凋亡，具有保護(hù)神經(jīng)的作用。

圖3 各組小鼠腦組織TUNEL/NeuN/DAPI三色熒光染色圖像比較Figure 3 Comparison of TUNEL/NeuN/DAPI immunofluorescence staining images in various groups of mice

圖4 七葉皂苷鈉對小鼠蛛網(wǎng)膜下腔出血后神經(jīng)元凋亡的影響Figure 4 Effects of sodium aescinate on the apoptosis of nerve cells in mice of subarachnoid hemorrhage

2.4 七葉皂苷鈉對小鼠蛛網(wǎng)膜下腔出血后腦組織Keap1/Nrf2/HO-1信號通路的影響圖5結(jié)果顯示，與假手術(shù)組比較，模型組小鼠腦組織Keap1蛋白表達(dá)水平降低，而Nrf2、HO-1蛋白表達(dá)水平升高（均P＜0.05）。與模型組比較，七葉皂苷鈉小鼠腦組織Keap1蛋白表達(dá)水平升高，而Nrf2、HO-1表達(dá)水平降低（均P＜0.05）。表明七葉皂苷鈉可能通過調(diào)節(jié)小鼠腦組織Keap1/Nrf2/HO-1信號通路蛋白減輕蛛網(wǎng)膜下腔出血。

圖5 七葉皂苷鈉對小鼠蛛網(wǎng)膜下腔出血后腦組織Keap1/Nrf2/HO-1信號通路的影響Figure 5 Effects of sodium aescinate on Keap1/Nrf2/HO-1 signaling pathway in mice with subarachnoid hemorrhage

3 討論

早期腦損傷通常發(fā)生在蛛網(wǎng)膜下腔出血后72 h內(nèi)，在決定蛛網(wǎng)膜下腔出血患者預(yù)后中發(fā)揮關(guān)鍵作用[11-12]。與血管痙攣損傷機制不同，早期腦損傷可在蛛網(wǎng)膜下腔出血后立即對腦組織造成損傷[13]。早期腦損傷的可能機制包括顱內(nèi)壓（intracranial pressure，ICP）升高，腦血流量（cerebral blood flow，CBF）降低，腦灌注壓（cerebral perfusion pressure，CPP）降低，腦氧合下降，血腦屏障（blood-brain barrier，BBB）破壞，腦水腫和神經(jīng)細(xì)胞死亡等[14]。本研究結(jié)果表明，七葉皂苷鈉給藥能夠顯著改善蛛網(wǎng)膜下腔出血小鼠血腦屏障損傷及神經(jīng)功能缺損，減輕蛛網(wǎng)膜下腔出血后早期腦損傷。

NeuN蛋白能夠特異性結(jié)合神經(jīng)核[15]，且廣泛存在于脊椎動物神經(jīng)系統(tǒng)各個部位的成熟神經(jīng)細(xì)胞核內(nèi)，更重要的是它在這些物種體內(nèi)高度保守且在神經(jīng)細(xì)胞生長的特殊階段穩(wěn)定表達(dá)[16]，故常直接被用作神經(jīng)細(xì)胞的特異性標(biāo)記物，同時也是直接評價神經(jīng)細(xì)胞丟失、死亡以及量化治療效應(yīng)的可信標(biāo)記物[17]。NeuN蛋白表達(dá)的高低可明確反映神經(jīng)細(xì)胞數(shù)量的變化。本研究結(jié)果表明七葉皂苷鈉能夠減輕小鼠蛛網(wǎng)膜下腔出血早期腦損傷神經(jīng)元細(xì)胞的凋亡，提示七葉皂苷鈉對小鼠蛛網(wǎng)膜下腔出血后早期腦損傷可能具有修復(fù)作用。

Keap1-Nrf2/ARE通路是近年新發(fā)現(xiàn)的機體抵抗外界氧化和化學(xué)等刺激的防御性轉(zhuǎn)導(dǎo)通路[18]。越來越多的證據(jù)表明，Nrf2調(diào)控的基因產(chǎn)物在中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病中具有保護(hù)作用。在非應(yīng)激條件下，Nrf2失活，并被Keap1（Nrf2的抑制蛋白）隔離在細(xì)胞質(zhì)中[19]；然而，當(dāng)暴露于各種刺激時，復(fù)合物被分離，游離的Nrf2隨后移位到細(xì)胞核并與抗氧化相關(guān)元件（ARE）結(jié)合，導(dǎo)致各種抗氧化和解毒基因的表達(dá)，如HO-1[17-18]。HO-1被認(rèn)為是細(xì)胞氧化應(yīng)激過程中一個非常敏感的指標(biāo)[20]。HO-1與其催化血紅素降解生成的產(chǎn)物膽紅素和CO一道，組成了機體重要的內(nèi)源性保護(hù)系統(tǒng)，廣泛參與抗炎與多種急慢性氧化應(yīng)激損傷。多種生長因子、氧化刺激因素、抗氧化藥物等能上調(diào)HO-1的表達(dá)[21]。而HO-1催化血紅素的降解產(chǎn)物CO、膽紅素和鐵蛋白可發(fā)揮細(xì)胞保護(hù)作用[22]。本研究結(jié)果表明，七葉皂苷鈉可明顯上調(diào)蛛網(wǎng)膜下腔出血小鼠腦組織Keap1蛋白表達(dá)，下調(diào)Nrf2、HO-1的表達(dá)，提示七葉皂苷鈉可能通過調(diào)節(jié)小鼠腦組織Keap1/Nrf2/HO-1信號通路減輕蛛網(wǎng)膜下腔出血。

綜上所述，七葉皂苷鈉可以有效改善蛛網(wǎng)膜下腔出血后的早期腦損傷，其機制可能與調(diào)節(jié)Keap1/Nrf2/HO-1信號通路從而抑制神經(jīng)元細(xì)胞凋亡有關(guān)。提示七葉皂苷鈉可能是一種治療蛛網(wǎng)膜下腔出血早期腦損傷的潛在藥物。