高效液相色譜法同時測定黨參中3 種指標(biāo)性成分含量*

陳 娟，陳瑞明，孟 雪，楊智峰，王 娣，魯文靜，蒙麥俠，張 紅

（陜西省中醫(yī)藥研究院，陜西 西安 710061）

黨參為桔?？浦参稂h參Codonopsispilosula（Franch.）Nannf.、素花黨參Codonopsis pilosula Nannf.var. modesta（Nannf.）L.T.Shen 或川黨參Codonopsis tangshen Oliv.的干燥根，具有補中益氣、健脾益肺功效［1］。現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，黨參可調(diào)節(jié)血糖及胃腸功能，提高造血機能，抗?jié)儯寡?，抗疲勞，抗腫瘤，延緩衰老，增強機體免疫功能［2-5］。其主要化學(xué)成分為甾醇類、多糖類、苷類、萜類、生物堿類等［6-7］。2015年版《中國藥典（一部）》僅收載了黨參的顯微和薄層鑒定方法，未收載指標(biāo)性成分含量測定項。黨參炔苷為黨參的指標(biāo)性成分，對乙醇所致胃黏膜損傷有很好保護作用，與黨參補中益氣功效相符，是黨參保護胃黏膜的活性成分［8］。楊靜等［9］比較了不同產(chǎn)地黨參中蒼術(shù)內(nèi)酯Ⅲ和黨參炔苷的成分，發(fā)現(xiàn)蒼術(shù)內(nèi)酯Ⅲ可代表潞黨參的道地性，具有抗炎、調(diào)節(jié)胃腸道、促進營養(yǎng)物質(zhì)吸收的作用［10］，與黨參的藥理作用有相關(guān)性，可作為指標(biāo)性成分。胡春陽等［11］以黨參炔苷和紫丁香苷為指標(biāo)性成分評價和鑒定紋黨與白條黨，發(fā)現(xiàn)紫丁香苷具有抗疲勞、抗腦缺血、增強適應(yīng)性等功效［12］，也可作為指標(biāo)性成分。為了進一步提升黨參臨床用藥的有效性和安全性，本研究中擬采用高效液相色譜（HPLC）法同時測定黨參中紫丁香苷、黨參炔苷和蒼術(shù)內(nèi)酯Ⅲ3 種成分的含量，為其質(zhì)量評價提供參考?，F(xiàn)報道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Agilent 1260 型高效液相色譜儀（美國安捷倫公司）；KH -300D 型數(shù)控超聲波清洗機（昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司，功率為300 W，頻率為40 kHz）；BT25S 型電子天平（精度為十萬分之一），BS210S 型電子天平（精度為萬分之一），均購自賽多利斯科學(xué)儀器＜北京＞有限公司。

1.2 試藥

紫丁香苷對照品（批號為CHB180530，純度≥98%），黨參炔苷對照品（批號為CHB180122，純度≥98%），蒼術(shù)內(nèi)酯Ⅲ對照品（批號為CHB180224，純度≥98%），均購自成都克洛瑪生物科技有限公司；乙腈為色譜純，水為超純水，其他試劑均為分析純。黨參藥材（批號分別為202000301，202000302，202000303）采收自陜西省宜君縣，經(jīng)陜西省中醫(yī)藥研究院楊智峰研究員鑒定均為黨參Codonopsis pilosula Franch. 的干燥根。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱:Kromasil C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相:乙腈（A）-0.1% 磷酸水溶液（B），梯度洗脫（0 ～20 min 時10%A，20 ～30 min 時10%A→30%A，30 ～50 min 時30%A→70%A）；檢測波長:220 nm；柱溫:30 ℃；流速:0.8 mL/min；進樣量:10 μL。紫丁香苷、黨參炔苷、蒼術(shù)內(nèi)酯Ⅲ的分離度均不低于1.5，理論板數(shù)按紫丁香苷峰計均不低于5 000。

2.2 溶液制備

混合對照品溶液:精密稱取各對照品適量，加甲醇制成含紫丁香苷0.670 mg/mL、黨參炔苷0.231 mg/mL、蒼術(shù)內(nèi)酯Ⅲ0.108 mg/mL 的對照品貯備溶液。精密吸取上述對照品貯備溶液各1 mL，置10 mL 容量瓶中，加入75%甲醇溶解，定容，搖勻，即得。

供試品溶液:取黨參樣品粉末（過40 目篩）1.0 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入75%甲醇25 mL，密塞，稱定質(zhì)量，超聲處理45 min，放冷，再稱定質(zhì)量，用75%甲醇補足減失的質(zhì)量，搖勻，用0.45 μm 微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.3 方法學(xué)考察

專屬性試驗:分別吸取2.2 項下混合對照品溶液和供試品溶液各10 μL，按2.1 項下色譜條件進樣測定。結(jié)果供試品溶液色譜中，在與混合對照品溶液色譜紫丁香苷、黨參炔苷、蒼術(shù)內(nèi)酯Ⅲ相應(yīng)位置上有相應(yīng)色譜峰，且與其他雜質(zhì)峰分離良好。色譜圖見圖1。

1. 紫丁香苷 2. 黨參炔苷 3. 蒼術(shù)內(nèi)酯ⅢA. 混合對照品溶液 B. 供試品溶液圖1 高效液相色譜圖1.syringin 2.lobetyolin 3. atractylenolide ⅢA.Mixed reference solution B. Test solutionFig.1 HPLC chromatograms

線性關(guān)系考察:分別精密吸取對照品貯備溶液0.2，0.4，0.8，1.2，1.6，2.0 mL，置10 mL 容量瓶中，加75%甲醇稀釋至刻度，搖勻，按2.1 項下色譜條件進樣10 μL，以溶液質(zhì)量濃度（X，μg）為橫坐標(biāo)、峰面積（Y）為縱坐標(biāo)進行線性回歸。結(jié)果見表1。

表1 各成分線性關(guān)系考察結(jié)果（n ＝6）Tab.1 The linear relationship of each component（n ＝6）

精密度試驗:精密吸取2.2 項下同一混合對照品溶液10 μL，按2.1 項下色譜條件重復(fù)進樣6 次。結(jié)果紫丁香苷、黨參炔苷、蒼術(shù)內(nèi)酯Ⅲ峰面積的RSD 分別為0.40%，0.54%，0.08%（n ＝6），表明儀器精密度良好。

重復(fù)性試驗:取同一批（批號為202000301）樣品6 份，精密稱定，依法制備供試品溶液，按2.1 項下色譜條件進樣分析。結(jié)果紫丁香苷、黨參炔苷、蒼術(shù)內(nèi)酯Ⅲ含量的RSD 分別為0.24%，0.16%，0.15%（n ＝6），表明方法重復(fù)性良好。

穩(wěn)定性試驗:取同一供試品溶液，室溫放置，分別于0，2，4，6，8，10，12 h 時按2.1 項色譜條件下進樣10 μL。結(jié)果紫丁香苷、黨參炔苷、蒼術(shù)內(nèi)酯Ⅲ峰面積的RSD 分別為0.42%，0.45%，1.44%（n ＝7），表明供試品溶液在12 h 內(nèi)穩(wěn)定。

加樣回收試驗:取各已知成分的黨參樣品（批號為202000301）0.5 g，精密稱定，共6 份，依法制備供試品溶液，分別精密加入各對照品適量，按2.1 項下色譜條件進樣測定，并計算紫丁香苷、黨參炔苷、蒼術(shù)內(nèi)酯Ⅲ的加樣回收率。結(jié)果見表2。

表2 各成分加樣回收試驗結(jié)果（n ＝6）Tab.2 Results of recovery tests of each component（n ＝6）

2.4 樣品含量測定

取不同批次（批號分別為202000301，202000302，202000303）黨參樣品各1.0 g，精密稱定，依法制備供試品溶液，按2.1 項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積，并計算含量。結(jié)果見表3。

表3 樣品含量測定結(jié)果（mg/g，n ＝3）Tab.3 Results of content determination of samples（mg/g，n ＝3）

3 討論

3.1 檢測波長選擇

采用紫外檢測器在200 ～400 nm 波長范圍內(nèi)對黨參3 種指標(biāo)性成分進行掃描，結(jié)果紫丁香苷在220，265 nm 波長處有最大吸收，黨參炔苷在220，232，267，283 nm 波長處有最大吸收，蒼術(shù)內(nèi)酯Ⅲ在220 nm 波長處有最大吸收。胡濤［13］在不同生長年限與采收期川黨參中主要成分含量的比較研究中發(fā)現(xiàn)，紫丁香苷、黨參苷Ⅰ和黨參炔苷的最大吸收峰為267 nm；楊靜等［9］研究不同產(chǎn)地黨參蒼術(shù)內(nèi)酯Ⅲ和黨參炔苷含量時發(fā)現(xiàn)，蒼術(shù)內(nèi)酯Ⅲ在220 nm 波長處有最大吸收，均與本研究結(jié)果一致。本研究中，紫丁香苷和黨參炔苷在267 nm 波長處也有最大吸收峰，但蒼術(shù)內(nèi)酯Ⅲ在267 nm 波長處的吸收峰遠小于220 nm 波長處，故選擇220 nm 為檢測波長。

3.2 流動相選擇

考察了甲醇-水、乙腈-水、甲醇-0.1%磷酸水溶液、乙腈-0.1%磷酸水溶液等流動相系統(tǒng)，以黨參3 個指標(biāo)性成分的分離度、峰形、基線的平穩(wěn)情況進行綜合考察，結(jié)果以乙腈-0.1%磷酸水溶液為流動相進行梯度洗脫時色譜峰的基線平穩(wěn)、峰形好和分離度均好，能滿足檢測要求。

3.3 提取溶劑和提取方法選擇

考察了超聲提取和回流提取2 種方法，提取效果差異不明顯，故選擇便于操作的超聲提取法。考察了甲醇和乙醇及不同體積分?jǐn)?shù)的甲醇和乙醇的提取效果，結(jié)果75%甲醇提取效果最佳。考察了30，45，60 min 時的提取效果，結(jié)果超聲提取45 min 的效果最佳。

3.4 方法評價

本研究中建立的同時測定黨參中3 種指標(biāo)性成分的HPLC 法，分離效果和重復(fù)性均良好，回收率高，能全面評價黨參藥材的質(zhì)量，可為黨參的質(zhì)量控制提供參考。