哺乳動物核心巖藻糖基化研究進(jìn)展

田銀平，易文

（浙江大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院生物化學(xué)研究所，杭州310058）

糖基化是細(xì)胞內(nèi)普遍存在的一種翻譯后修飾，它能夠參與多種生理病理過程的調(diào)控[1]。糖基化修飾以單糖（如O-乙酰葡糖胺）[2]或者糖聚合物的形式連接到脂類或蛋白質(zhì)上而形成。哺乳動物細(xì)胞內(nèi)參與糖基化修飾的單糖一般有10種。其中，巖藻糖是一種特殊的單糖，細(xì)胞內(nèi)天然的巖藻糖是一種6位脫氧、L構(gòu)型的6碳糖，其他天然單糖是D構(gòu)型。糖基化可以根據(jù)糖配基（aglycone）的不同進(jìn)行分類，例如N-聚糖（N-glycans）和O-聚糖（O-glycans）（圖1）。核心巖藻糖基化是巖藻糖以α1，6鍵的形式與N-聚糖最里面的N-乙酰葡萄糖胺（N-acetylglucosamine,GlcNAc）連接的一種修飾（如圖1虛線框所示）。本文主要介紹哺乳動物細(xì)胞內(nèi)的核心巖藻糖基化及其相關(guān)的生物學(xué)功能。

圖1 哺乳動物細(xì)胞中的糖基化修飾Fig.1 Glycosylation in mammalian cells

1 巖藻糖基化供體與核心巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶

所有的巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶均利用核苷酸活化的糖供體鳥苷二磷酸（guanosine diphosphate, GDP）巖藻糖進(jìn)行巖藻糖基化。目前研究發(fā)現(xiàn)，哺乳動物細(xì)胞中的GDP 巖藻糖有2 條合成途徑：從頭合成（de novo）途徑和補(bǔ)救（salvage）途徑。如圖2 所示：從頭合成途徑是以D-葡萄糖為原料經(jīng)過多步酶催化反應(yīng)得到GDP 甘露糖；然后，GDP 甘露糖經(jīng)過3步反應(yīng)轉(zhuǎn)化為GDP巖藻糖，這一過程在2個酶催化下完成，即GDP 甘露糖4，6 脫氫酶（GDP-mannose 4,6-dehydrogenase, GMD）和異構(gòu)化還原酶（GDPketo-6-deoxymannose-3, 5-epimerase-4-reductase, FX蛋白）[3]。補(bǔ)救途徑以細(xì)胞外或溶酶體代謝的巖藻糖為原料合成GDP巖藻糖，巖藻糖激酶催化巖藻糖轉(zhuǎn)化為1-磷酸巖藻糖[4]；然后，GDP巖藻糖焦磷酸酶（GDP-fucose pyrophosphatase, GFPP）將1-磷酸巖藻糖轉(zhuǎn)化為GDP 巖藻糖[5]；GDP 巖藻糖在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)合成，然后通過轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白進(jìn)入高爾基體并作為巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶的底物對目標(biāo)分子進(jìn)行糖基化修飾[6]。已有的研究認(rèn)為，正常情況下細(xì)胞內(nèi)GDP巖藻糖的合成主要來源于從頭合成途徑[7]，而補(bǔ)救途徑會在一些病理?xiàng)l件下發(fā)揮作用[8]。

圖2 哺乳動物細(xì)胞內(nèi)GDP巖藻糖的生物合成途徑Fig.2 Biosynthesis pathway of GDP-fucose in mammalian cells

研究認(rèn)為，核心巖藻糖基化只發(fā)生在N-聚糖上，并且只有一種糖基轉(zhuǎn)移酶——巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶8（fucosyltransferase 8, FUT8）能催化這一過程[9]。人體內(nèi)的N-聚糖具有一個公共的核心五糖結(jié)構(gòu)（Man3GlcNAc2）。如圖3A 所示：依據(jù)修飾核心五糖分支結(jié)構(gòu)的不同，N-聚糖可以分為3 種類型，即復(fù)雜型（complex type）、高甘露糖型（high mannose type）和混合型（hybrid type）；此外，N-乙酰葡萄糖胺基轉(zhuǎn)移酶Ⅲ（N-acetylglucosamine transferase Ⅲ,GnTⅢ）可以在核心五糖的第一個甘露糖的4 位加上一個β鍵連接的N-乙酰葡萄糖胺，這種結(jié)構(gòu)被叫作平分型N-聚糖（bisecting N-glycan）。FUT8 能夠以GDP巖藻糖為底物催化巖藻糖通過α1，6鍵與N-聚糖核心五糖結(jié)構(gòu)的第一個GlcNAc 連接（圖3B）。FUT8屬于巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶家族（EC 2.4.1.68），人的FUT8 基因位于14 號染色體上，人源FUT8 蛋白有575 個氨基酸。2016 年，CALDERON 等[10]對FUT8的受體底物特異性進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)N-聚糖沒有連接多肽或者蛋白質(zhì)時，F(xiàn)UT8需要N-聚糖α1，3臂上具有的GlcNAc 修飾才能催化核心巖藻糖形成，而其對N-聚糖α1，6臂上的修飾有很高的容忍度。然而，也有報(bào)道稱，缺失GnT1（N-聚糖α1，3 臂上無GlcNAc 修飾）的哺乳動物細(xì)胞也有核心巖藻糖修飾[11]。例如，缺失GnT1 的中國倉鼠卵巢細(xì)胞（Chinese hamster ovary cell,CHO）有核心巖藻糖基化的高甘露糖型N-聚糖[12]。這些研究結(jié)果與CALDERON 等[10]報(bào)道的FUT8 體外底物活性數(shù)據(jù)有沖突；而2017年，YANG等[13]研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)N-聚糖的第一個GlcNAc 與多肽或者蛋白質(zhì)連接時，F(xiàn)UT8能識別高甘露糖型N-聚糖并催化其核心巖藻糖基化。此外，TSENG等[14]發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)UT8無法識別平分型N-聚糖。這些結(jié)果說明，N-聚糖與N-聚糖修飾的蛋白質(zhì)共同決定了FUT8的底物特異性。

2007 年，IHARA 等[15]首次解析了FUT8 的晶體結(jié)構(gòu)。他們利用桿狀病毒感染昆蟲細(xì)胞Sf21，并表達(dá)重組人源FUT8 蛋白，對其單體結(jié)構(gòu)解析發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)UT8 有3 個結(jié)構(gòu)域：N-端螺旋-螺旋結(jié)構(gòu)域、催化結(jié)構(gòu)域和C-端SH3結(jié)構(gòu)域[在蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫（protein data bank, PDB）編號為2DE0]。2020年，GARCIA-GARCIA 等[16]解析了FUT8、GDP 和復(fù)雜型N-聚糖三組分晶體的結(jié)構(gòu)（PDB 編號為6TKV），闡述了FUT8 的潛在催化機(jī)制及其底物特異性：根據(jù)結(jié)構(gòu)分析認(rèn)為，F(xiàn)UT8通過雙分子親核取代反應(yīng)（SN2）原理催化核心巖藻糖修飾；氨基酸殘基Arg365、Lys369 和Glu373 不僅參與底物的結(jié)合，還參與催化過程，其中Glu373發(fā)揮輔助催化堿基的作用；此外，N-聚糖α1，3臂上的GlcNAc可以與FUT8的氨基酸殘基（Asp494、Asp495 和His535）形成3 個氫鍵作用。這解釋了α1，3 臂上的GlcNAc 修飾對FUT8催化活性的重要性[10]。而N-聚糖核心五糖第一個甘露糖的4 位羥基與FUT8 蛋白上的氨基酸殘基距離小于5 ?，平分型N-聚糖在甘露糖的4 位羥基上有一個GlcNAc修飾，該GlcNAc修飾會破壞受體與蛋白的相互作用。這可能是FUT8無法識別平分型N-聚糖的原因[14]，但作者從目前的結(jié)構(gòu)中無法解釋FUT8 對高甘露糖型N-聚糖具有催化活性的原因。

圖3 人細(xì)胞內(nèi)代表性N-聚糖Fig.3 Representative N-glycans in human cells

2 核心巖藻糖基化的生物學(xué)功能

2.1 腫瘤與腫瘤生物標(biāo)志物

據(jù)報(bào)道，與正常組織相比，腫瘤組織的核心巖藻糖水平升高[17-18]。而且，許多核心巖藻糖修飾的糖蛋白可以作為腫瘤的重要生物標(biāo)志物[19]。例如，甲胎蛋白（alpha fetoprotein, AFP）是肝細(xì)胞癌（hepatocellular carcinoma, HCC）的重要生物標(biāo)志物，而其在一些良性肝病中表達(dá)量也會升高，但是，AFP的核心巖藻糖修飾只在肝細(xì)胞癌中升高[20]。因此，核心巖藻糖修飾的AFP是更可靠的肝細(xì)胞癌生物標(biāo)志物[21]。2005年，甲胎蛋白異質(zhì)體（AFP-L3）被美國食品與藥品監(jiān)督管理局（Food and Drug Administration, FDA）批準(zhǔn)為肝細(xì)胞癌的腫瘤標(biāo)志物[22]。然而，肝細(xì)胞癌巖藻糖修飾上調(diào)的機(jī)制并不清楚。NORTON等[23]對371個肝癌病人樣本與核心巖藻糖修飾相關(guān)的基因進(jìn)行了研究，并推測，調(diào)控GDP巖藻糖從頭合成的基因（GMDS和TSTA3）表達(dá)上調(diào)可能是肝癌中核心巖藻糖升高的原因之一。

前列腺特異性抗原（prostate specific antigen,PSA）是一種公認(rèn)的前列腺疾病生物標(biāo)志物[24]。與良性前列腺增生（benign prostatic hyperplasia,BPH）患者相比，前列腺癌患者的核心巖藻糖基化PSA的比例明顯升高，這表明核心巖藻糖修飾在前列腺癌診斷中具有應(yīng)用價值。而且，血清蛋白核心巖藻糖修飾的增加也與前列腺癌轉(zhuǎn)移風(fēng)險(xiǎn)的增加有關(guān)[25]。核心巖藻糖基化觸珠蛋白（haptoglobin）是胰腺癌檢測的潛在生物標(biāo)志物。MIYOSHI 等[26]利用橙黃網(wǎng)孢盤菌凝集素（Aleuria aurantia lectin,AAL）檢測胰腺癌病人血清時發(fā)現(xiàn)，血清中觸珠蛋白β 鏈發(fā)生了巖藻糖修飾，且?guī)r藻糖修飾程度與癌癥進(jìn)程有關(guān)。AGRAWAL等[27]對黑色素瘤臨床樣本進(jìn)行糖組學(xué)系統(tǒng)分析發(fā)現(xiàn)，核心巖藻糖基化與促病灶轉(zhuǎn)移相關(guān)，轉(zhuǎn)移性黑色素瘤FUT8 的表達(dá)水平比原發(fā)性腫瘤高。這種現(xiàn)象可能與核心巖藻糖基化的L1 細(xì)胞黏附分子（L1 cell adhesion molecule, L1CAM）有關(guān)。L1CAM的核心巖藻糖修飾能夠抑制纖溶酶引起的裂解作用，促進(jìn)L1CAM與遠(yuǎn)端器官、血管系統(tǒng)的相互作用，進(jìn)而促使病灶轉(zhuǎn)移。

此外，研究表明，鈣黏蛋白（E-cadherin）[28]和整合素[29]的核心巖藻糖修飾增加會減少細(xì)胞黏附作用，促進(jìn)癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移。CHEN等[30]發(fā)現(xiàn)：FUT8在非小細(xì)胞肺癌（nonsmall cell lung cancer,NSCLC）中的表達(dá)量增加；而且，F(xiàn)UT8 表達(dá)上調(diào)與腫瘤轉(zhuǎn)移、疾病復(fù)發(fā)和預(yù)后差等情況相關(guān)。OSUMI 等[31]發(fā)現(xiàn)：FUT8和鈣黏蛋白在結(jié)腸癌病人樣本中表達(dá)水平增加；在高密度培養(yǎng)條件下，過表達(dá)FUT8的人結(jié)腸癌細(xì)胞WiDr 可上調(diào)低分子質(zhì)量鈣黏蛋白的表達(dá)，進(jìn)而增強(qiáng)細(xì)胞間的黏附作用。因此，上述研究認(rèn)為，核心巖藻糖基化對腫瘤細(xì)胞間黏附有調(diào)控作用。

2.2 免疫系統(tǒng)

核心巖藻糖基化對免疫系統(tǒng)調(diào)節(jié)也有重要作用[32]。免疫球蛋白G（immunoglobulin G, IgG）與自然殺傷細(xì)胞和巨噬細(xì)胞表面的受體FcγRIIIa 和CD16結(jié)合從而誘導(dǎo)免疫反應(yīng)，抗體Fc區(qū)N-聚糖發(fā)生核心巖藻糖基化后，抗體與受體的親和力降低了98%～99%。因此，去除抗體的核心巖藻糖能夠明顯提高依賴抗體的細(xì)胞毒性（antibody-dependent cellular cytotoxicity, ADCC）[33]。FERRARA 等[34]對糖基化Fcγ受體與抗體Fc區(qū)的結(jié)晶結(jié)構(gòu)進(jìn)行解析發(fā)現(xiàn)，受體上的聚糖修飾與抗體Fc區(qū)無巖藻糖修飾的聚糖發(fā)生了特異性的碳水化合物-碳水化合物相互作用，而抗體巖藻糖修飾會破壞這種相互作用。這一發(fā)現(xiàn)對研究臨床治療性抗體非常重要[35]。目前，2種無巖藻糖修飾的單克隆抗體已被FDA 批準(zhǔn)用于癌 癥 治 療——mogamulizumab 和obinutuzumab。mogamulizumab[36]靶向趨化因子受體4，這是一種重要的信號轉(zhuǎn)換器，它在T 細(xì)胞白血病和淋巴瘤中表達(dá)上調(diào)；obinutuzumab 靶向B 細(xì)胞發(fā)育過程中的一個抗原CD20，它對治療慢性淋巴細(xì)胞白血?。╟hronic lymphocytic leukemia, CLL）很有效[37]。然而，巖藻糖缺失可增加抗原-抗體相互作用的特性，在某些情況下可能會對人體有害。例如，新生兒同種免疫性血小板減少癥（neonatal alloimmune thrombocytopenia,NAIT）是引起新生兒死亡的重要疾病之一[38]。它是由母體針對父系遺傳給胎兒的人血小板特異性抗原1a（human platelet antigen 1a,HPA1a）而產(chǎn)生的抗體引起的。研究者對出生后患有NAIT胎兒的48名產(chǎn)婦的血樣進(jìn)行IgG相關(guān)聚糖修飾分析發(fā)現(xiàn)，其血樣中核心巖藻糖基化水平顯著下降，在某些情況下，巖藻糖基化抗體僅為抗體總量的10%[39]。還有研究表明，無巖藻糖基化抗體比例高的登革熱感染者更容易患上嚴(yán)重的溶血性疾病[40]。

在小鼠中，敲除Fut8 會導(dǎo)致嚴(yán)重的生長遲緩、發(fā)育中過早死亡以及肺氣腫樣的肺部病變等表型。研究表明：小鼠生長遲緩可能與Fut8缺失導(dǎo)致的表皮生長因子（epidermal growth factor,EGF）[41]或血小板衍生生長因子（platelet derived growth factor,PDGF）受體介導(dǎo)的信號通路下調(diào)有關(guān)[42]；轉(zhuǎn)化生長因子β1（transforming growth factor-β1,TGF-β1）的核心巖藻糖基化水平降低與肺部病變有關(guān)[43]。此外，抑制TGF-β1 的核心巖藻糖基化可減輕葡萄糖誘導(dǎo)的大鼠腹膜纖維化[44]。這些研究表明，核心巖藻糖基化對生長因子受體信號轉(zhuǎn)導(dǎo)至關(guān)重要。

雖然核心巖藻糖基化調(diào)控許多生物過程，但哺乳動物核心巖藻糖的識別分子卻鮮有報(bào)道。Dectin-1 是一種C 型凝集素型受體[45]，它能識別β-葡聚糖進(jìn)而防止真菌感染。MANABE 等[46]研究發(fā)現(xiàn)，IgG 抗體上的核心巖藻糖是Dectin-1 的一種內(nèi)源性配體，Dectin-1 可以識別IgG 的核心巖藻糖以及N-聚糖修飾天冬酰胺的相鄰芳香氨基酸。因此，Dectin-1 可能是第一個參與抗體與N-聚糖多價特異性識別的類凝集素分子。

2.3 干細(xì)胞

核心巖藻糖基化與干細(xì)胞的研究也有報(bào)道[47]。人胚胎干細(xì)胞（human embryonic stem cells,hESCs）在未分化狀態(tài)下可不斷增殖（自我更新），并具有最終分化為所有細(xì)胞類型的能力（多能性）。人誘導(dǎo)多能干細(xì)胞是具有多能性的重編程體細(xì)胞。與干細(xì)胞多能性相關(guān)的N-聚糖修飾已有一些報(bào)道。例如，人胚胎干細(xì)胞表達(dá)高比例的高甘露糖型[48]和雙線復(fù)雜型N-聚糖核心結(jié)構(gòu)。其中，雙線復(fù)雜型N-聚糖分支主要為Ⅱ型N-乙酰乳糖胺（LacNAc、Galβ1 和4GlcNAc）修飾，末端為α2，6 和α2，3 連接的唾液酸[49]。此外，人胚胎干細(xì)胞N-聚糖修飾的另一個特點(diǎn)是具有非常復(fù)雜的巖藻糖基化修飾。SATOMAA等[50]利用核磁共振技術(shù)對人胚胎干細(xì)胞的巖藻糖修飾進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)，人胚胎干細(xì)胞巖藻糖基化信號豐度最高的是α1，6 連接的核心巖藻糖基化。TATENO等[51]利用凝集素探針研究轉(zhuǎn)錄因子誘導(dǎo)體細(xì)胞重編程過程中細(xì)胞糖基化修飾的變化時發(fā)現(xiàn)，在誘導(dǎo)體細(xì)胞多功能化過程中，末端α1，2巖藻糖基化信號升高，而核心巖藻糖基化信號下降。由于干細(xì)胞N-聚糖修飾具有異質(zhì)性和復(fù)雜性，因此，核心巖藻糖基化與干細(xì)胞多能性的關(guān)系還有待進(jìn)一步研究。

3 巖藻糖類似物

化學(xué)修飾的巖藻糖類似物是研究巖藻糖基化和巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶的有效工具分子（圖4）。早在1992年就有文獻(xiàn)報(bào)道巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶能夠識別6位大體積修飾的GDP 巖藻糖類似物[52]。利用酶的底物多樣性，6-疊氮巖藻糖可以進(jìn)入細(xì)胞代謝途徑，進(jìn)而標(biāo)記巖藻糖基化的生物分子。然后，研究者們利用生物正交的點(diǎn)擊反應(yīng)[53]富集或檢測這些巖藻糖基化生物分子。巖藻糖類似物代謝策略可以實(shí)現(xiàn)模式生物中巖藻糖基化的體內(nèi)成像，例如線蟲[54]和斑馬魚[55]，這一策略也可以實(shí)現(xiàn)巖藻糖基化蛋白的體外富集或細(xì)胞熒光檢測[56-57]。此外，YI 等[58]研究發(fā)現(xiàn)，工程化大腸埃希菌細(xì)胞可以通過補(bǔ)救途徑利用巖藻糖類似物合成多糖。前文介紹到IgG有核心巖藻糖基化。OKELEY等[59]對200個巖藻糖類似物的代謝效率進(jìn)行篩選發(fā)現(xiàn)，6-巰基巖藻糖在CHO細(xì)胞內(nèi)能夠高效標(biāo)記到抗體上，這種非天然硫代抗體與馬來酰亞胺修飾藥物偶聯(lián)得到的抗體偶聯(lián)藥物具有明顯的細(xì)胞毒活性，且比單抗具有更好的同質(zhì)性。

2016 年，KIZUKA 等[60]發(fā)現(xiàn)，7-炔烴巖藻糖能更高效地標(biāo)記巖藻糖基化，且主要標(biāo)記的是核心巖藻糖基化。2017 年，他們又報(bào)道了6-炔烴巖藻糖，一個已知的巖藻糖代謝標(biāo)志物，會抑制細(xì)胞巖藻糖基化[61]；其中，6-炔烴巖藻糖細(xì)胞代謝物——鳥苷二磷酸-6-炔烴巖藻糖能夠抑制巖藻糖從頭合成途徑中FX 蛋白的酶活性，進(jìn)而抑制肝癌細(xì)胞的遷移和侵襲。所以，除了能標(biāo)記巖藻糖基化外，巖藻糖類似物還有可能是巖藻糖代謝途徑或巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶的潛在抑制劑。研究發(fā)現(xiàn)，氟代核苷酸化巖藻糖對巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶有抑制活性[62]。用2-氟代巖藻糖喂食小鼠發(fā)現(xiàn)，小鼠體內(nèi)抗體、移植腫瘤和中性粒細(xì)胞的巖藻糖基化水平下降，腫瘤細(xì)胞生長受到抑制；用高濃度2-氟代巖藻糖培養(yǎng)CHO 細(xì)胞發(fā)現(xiàn)，核心巖藻糖基化明顯減少[63]。6-氟代巖藻糖對細(xì)胞巖藻糖基化也有抑制作用[64]。6-三氟代甲基巖藻糖能抑制細(xì)胞重組表達(dá)抗體的巖藻糖基化水平，且能抑制巖藻糖從頭合成途徑中GMD 的酶活性；晶體結(jié)構(gòu)顯示，6-三氟代甲基巖藻糖能夠與GMD的變構(gòu)位點(diǎn)結(jié)合[65]。

圖4 巖藻糖類似物Fig.4 Fucose analogue

4 小結(jié)與展望

綜上所述，F(xiàn)UT8 是目前研究發(fā)現(xiàn)的唯一核心巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶。FUT8的受體及配體底物特異性已被報(bào)道，三元晶體結(jié)構(gòu)解析了FUT8 的潛在催化機(jī)制及底物偏好性。哺乳動物細(xì)胞內(nèi)α1，6 核心巖藻糖基化的生物學(xué)功能也已被廣泛研究。核心巖藻糖基化在免疫應(yīng)答中起重要作用，如抗體細(xì)胞毒活性和器官病變。此外，核心巖藻糖基化也在癌細(xì)胞的發(fā)生、發(fā)展、復(fù)發(fā)、侵襲和轉(zhuǎn)移中發(fā)揮作用。而核心巖藻糖基化蛋白可以作為重要的腫瘤標(biāo)志物用于癌癥的早期檢測及分型。巖藻糖類似物除了能標(biāo)記巖藻糖基化以外，還能抑制細(xì)胞巖藻糖基化水平。而且，巖藻糖類似物抑制劑對癌細(xì)胞和小鼠移植腫瘤的生長有抑制作用。

近年來，液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)已成為糖蛋白鑒定的有力手段[66]。串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)與機(jī)器學(xué)習(xí)相結(jié)合可以自動預(yù)測N-糖基化位點(diǎn)及其連接的糖基組成[67]。對某種糖蛋白特異性富集純化后進(jìn)行質(zhì)譜分析，可以顯著提高檢測靈敏度，簡化數(shù)據(jù)分析工作。糖基化修飾免疫原性低，很難用抗體識別和純化。凝集素可以用于巖藻糖基化蛋白的識別和純化，其中橙黃網(wǎng)孢盤菌凝集素（AAL）和扁豆凝集素（Lens culinaris agglutinin,LCA）主要識別核心巖藻糖基化[17]，但凝集素識別效率不高且信號易丟失，不利于糖蛋白的富集純化。而巖藻糖類似物代謝標(biāo)記具有廣譜性，對糖鏈結(jié)構(gòu)沒有選擇性。化學(xué)-酶標(biāo)記法具有高特異性和高靈敏性等特點(diǎn)。目前，特異性標(biāo)記核心巖藻糖的化學(xué)-酶標(biāo)記法還沒有報(bào)道，化學(xué)-酶標(biāo)記法使用的酶需要對糖鏈結(jié)構(gòu)的識別具有嚴(yán)謹(jǐn)性，保證糖結(jié)構(gòu)標(biāo)記的特異性。同時，酶還需要能夠識別非天然糖供體，例如疊氮或炔烴等基團(tuán)修飾的糖供體，然后通過化學(xué)反應(yīng)與標(biāo)簽連接，在進(jìn)行結(jié)合/下拉（binding/pulldown）實(shí)驗(yàn)時富集糖蛋白。目前，本實(shí)驗(yàn)室正在進(jìn)行此方向的探索和研究。

核心巖藻糖發(fā)生在N-聚糖上，N-聚糖具有復(fù)雜的糖鏈結(jié)構(gòu)，酶底物選擇性的篩選需要使用糖芯片技術(shù)，而單一結(jié)構(gòu)的N-聚糖庫是建立糖芯片的基礎(chǔ)。近幾十年來，關(guān)于N-聚糖的各種合成方法已被報(bào)道[68]。其中，化學(xué)合成多糖是最可靠的方法之一，但是這種方法特別耗時，尤其不利于N-聚糖這類復(fù)雜糖鏈結(jié)構(gòu)的合成。而化學(xué)-酶合成法的發(fā)展為合成多樣化的N- 聚糖庫提供了新的途徑。CALDERON等[69]利用一系列糖苷酶和糖基轉(zhuǎn)移酶，以天然來源的N-聚糖為原料合成一系列不對稱分支的N-聚糖。自動合成N-聚糖又是化學(xué)-酶合成法的新發(fā)展，也被稱為固相合成。2015 年，首個商業(yè)化的聚糖合成儀問世，即Glyconeer 2.1，它以聚苯乙烯為固相[70]。ZHANG 等[71]報(bào)道了一種全自動的水溶液酶法合成低聚糖系統(tǒng)，該系統(tǒng)利用熱敏材料作為固相。LI 等[72]報(bào)道，人工高爾基細(xì)胞器可以用來自動合成N-聚糖。未來，多糖自動合成會進(jìn)一步發(fā)展，就像多肽自動合成和DNA聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)一樣。此外，內(nèi)源核心巖藻糖基化N-聚糖具有高度異質(zhì)性。這妨礙了我們對其結(jié)構(gòu)和功能關(guān)系的深入理解，并阻礙了其在治療和診斷中的應(yīng)用。化學(xué)-酶合成法可以得到均質(zhì)的糖蛋白[73]，為深入研究其功能提供了可能。此外，多糖芯片還可以實(shí)現(xiàn)潛在致病抗原疫苗的快速篩選，為其相關(guān)疾病防治提供新的策略。