基于細胞色素C氧化酶亞基Ⅰ序列的DNA微條形碼技術(shù)鑒別11種生鮮肉制品摻假的研究

勵炯，吳瓊，扈明潔，金朦娜，邱紅鈺

（杭州市食品藥品檢驗研究院，杭州310017）

為預(yù)防人畜共患的傳染病，國內(nèi)許多地區(qū)已經(jīng)禁止市場交易活禽類，消費者只能購買宰殺后的生鮮肉或者生鮮肉制品來滿足日常的飲食需求[1]。一般情況下，消費者在整只或者整塊切割購買生鮮肉時，可以通過感官，從肉的肌理以及色、香、味等指標對其進行鑒別。但是很多生鮮肉制品，比如肉干、肉丸、肉糜、肉卷等經(jīng)過加工后，破壞了原來的一些性狀，導(dǎo)致消費者很難用感官來辨別，所以他們就只能通過參考外包裝上的標簽信息來購買所需的生鮮肉制品[2-3]。這就導(dǎo)致一部分不法商家在生鮮肉制品中摻假摻雜一些低經(jīng)濟價值的肉，以獲得更大的利潤[4]。一些文獻報道顯示，在墨西哥、土耳其以及南非等地區(qū)，包括肉腸、碎肉制品、肉丸以及肉干中的摻假率為20%～70%[5-7]。南非的一份研究揭露了南非地區(qū)銷售的生鮮肉制品中，高達68%的樣品中含有標簽中沒有標示的肉品種。在2013年歐洲發(fā)生的肉類摻假丑聞中，很多標識純牛肉的產(chǎn)品中摻有馬肉。英國食品標準局（Food Standards Agency,FSA）開展的一項牛肉千層面摻假的調(diào)查中，發(fā)現(xiàn)有60%的產(chǎn)品摻有馬肉。由愛爾蘭食品安全署（Food Safety Authority of Ireland,FSAI）開展的一項針對牛肉漢堡、碎牛肉制品以及牛肉腸的摻假調(diào)查中，發(fā)現(xiàn)有37%的產(chǎn)品摻有馬肉，85%的產(chǎn)品摻有豬肉[8-9]。自從出現(xiàn)大規(guī)模的摻假肉制品事件后，歐洲各國已經(jīng)采取各種積極措施，以避免各種肉類摻假事件的發(fā)生，從而保障消費者的權(quán)益。在美國，雖然各州政府部門都嚴令禁止銷售摻假肉制品，但早在1995 年前的一項研究表明，雖然未發(fā)現(xiàn)以整塊銷售的肉的摻假問題，但是有近17%的碎肉制品中的種類與標簽標示的不一致[10]。

在國內(nèi)的食品安全事件中，“摻假”問題一直是消費者投訴的焦點和社會關(guān)注的熱點。一些不法商販和企業(yè)因利益驅(qū)使將豬、鴨等低成本原料摻入牛、羊等高價肉及肉制品中，如果原料未經(jīng)檢驗檢疫，還將涉及疫病的傳播[11-12]。這些行為不僅侵害了消費者的利益，還可能因清真食品中含有非清真成分而引起糾紛，不利于維護社會安定[13]。

對經(jīng)過加工處理的畜禽類肉制品中的摻假進行鑒別，一般采用DNA或者基于蛋白質(zhì)的分子生物學(xué)方法[14-15]，包括酶聯(lián)免疫吸附測定（enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA）[16]、聚合酶鏈式反應(yīng)（polymerase chain reaction, PCR）[17-18]、限制性內(nèi)切酶片段長度多態(tài)性（restriction fragment length polymorphism,RFLP）[19]技術(shù)和DNA測序[20]等方法。ELISA和PCR法的優(yōu)點是能快速、準確地鑒定一些深加工的產(chǎn)品，包括摻混等現(xiàn)象[21]。盡管PCR 在肉類和禽肉類摻混鑒別中能同時鑒定出多種不同種類的肉，而且靈敏度高，但缺點是每一類品種都需要不同的引物，實驗操作比較煩瑣[14]。RFLR 相對PCR法的優(yōu)勢是不需要特定引物，通用型的引物就可以滿足實驗要求，但缺點是步驟煩瑣，需要比較長的DNA目標物，而且RFLR的結(jié)果分析也比較煩瑣，需要大量的酶來進行不同品種的肉類和禽肉類鑒定[14]。近年來，用質(zhì)譜手段分析蛋白質(zhì)和多肽的方法，成功解決了分子生物學(xué)的一些應(yīng)用問題，但是由于實施質(zhì)譜手段需要昂貴的設(shè)備以及復(fù)雜的操作技術(shù)，因此，并未被廣泛應(yīng)用于肉類摻假鑒別中[22-23]。

DNA條形碼（DNA barcoding）技術(shù)是基于DNA序列測定的技術(shù)，該技術(shù)被廣泛應(yīng)用于物種鑒別上[24]。該技術(shù)已經(jīng)被美國食品藥品管理局（Food and Drug Administration, FDA）應(yīng)用于水產(chǎn)品的鑒定上，并被一些研究用于肉類和禽肉類產(chǎn)品中的摻混鑒別[25]。DNA條形碼技術(shù)基于標準的基因片段，是利用標準的、有足夠變異的、易擴增且相對較短的DNA片段而創(chuàng)建的一種新的身份識別系統(tǒng)，且該DNA 片段在物種內(nèi)具有足夠的特異性和種間多樣性，可以快速、有效地鑒別動物、植物和真菌類物種。一般采用全片段DNA 條形碼（full-length DNA barcoding）技術(shù)來對保存完好的新鮮樣本進行鑒別，比如肉類鑒別中采用的大約650 bp大小的細胞色素C 氧化酶亞基Ⅰ（cytochrome C oxidase subunitⅠ,COⅠ）序列基因片段[26]。但是，在實際研究中發(fā)現(xiàn)，受環(huán)境等外來因素影響，部分DNA 可能會被破壞分解，運用全片段DNA條形碼技術(shù)進行物種鑒別非常困難，所以MEUSNIER等[27]設(shè)計了專門針對全片段DNA 條形碼中部分小片段DNA 的通用型引物，也就是DNA 微條形碼（mini-DNA barcoding）技術(shù)。他們發(fā)現(xiàn)，利用該通用型“微條形碼引物”，測試的92%物種的DNA 小片段能夠進行擴增，包括哺乳動物、魚類、禽鳥類以及昆蟲類。因此，本文采用基于COⅠ序列的DNA微條形碼技術(shù)對生鮮肉制品中11種肉類進行了摻假鑒別研究。

1 材料與方法

1.1 主要儀器與試劑

高速離心機（德國Sigma公司），干式恒溫器（杭州奧盛儀器有限公司），Veriti 96 孔梯度PCR 儀（美國ABI 公司），EYELA FDU-1100 真空冷凍干燥器（日本東京理化公司），PowerPac Basic電泳儀（美國Bio-Rad 公司），Gel Doc XR+凝膠成像系統(tǒng)（美國Bio-Rad 公司），NanoDrop 1000 微量核酸蛋白測定儀（美國Thermo公司）。

血液與組織DNA 提取試劑盒（德國Qiagen 公司），PCR 產(chǎn)物及DNA 片段回收試劑盒、T4 連接試劑盒、DH5α感受態(tài)細胞[天根生化科技（北京）有限公司]，即用PCR擴增試劑盒[生工生物工程（上海）股份有限公司]。

1.2 方法

1.2.1 樣品采集與預(yù)處理

所用的11種肉類（包括豬肉、牛肉、羊肉、雞肉、鴨肉、鴿子肉、馬肉、驢肉、鵝肉、兔肉、鼠肉等）為未加工過的完整生鮮肉，作為本研究用的純?nèi)?。所用的樣品部分來自?019 年杭州市場監(jiān)督管理部門抽樣，部分采購于超市，包括牛肉、羊肉、鴿子肉、鵝肉、兔肉等共5種生鮮肉制品，共計25批次，包括肉糜、肉條、鮮肉丸、風干肉、肉排、肉卷等。將11種純?nèi)庖约?5批次生鮮肉制品分別用料理機打勻，肉末放于-40 ℃冰箱中預(yù)冷4 h，將預(yù)冷后的樣品放在真空冷凍干燥箱中，在氣壓低于1×10-4Pa、-50 ℃條件下干燥24 h，隨后將樣品經(jīng)中藥粉碎機粉碎，置于-20 ℃條件下保存，備用。

1.2.2 DNA 提取

取真空冷凍干燥后的樣品粉末0.5 g，置于10 mL聚氟乙烯離心管中，加入2 mL ATL組織裂解緩沖溶液和200 μL 蛋白酶K，漩渦振蕩30 s 后，經(jīng)56 ℃裂解3 h（每隔半小時進行漩渦振蕩一次）。取裂解液250 μL，采用柱膜法提取試劑盒（DNeasy 血液與組織提取試劑盒）進行提取和凈化DNA。用37 ℃預(yù)熱的三羥甲基氨基甲烷-乙酸-乙二胺四乙酸（TAE）緩沖液洗脫DNA，并將其儲存在-20 ℃條件下。同時，設(shè)置空白對照。

1.2.3 引物的選擇

DNA微條形碼技術(shù)一般是選用100～300 bp大小的片段進行擴增，理想的微條形碼片段需要具備以下特征：1）標準的DNA 片段，其目標片段便于提取和擴增；2）包括足夠的系統(tǒng)進化信息，具有足夠的遺傳變異性和一定的分化性；3）便于設(shè)計通用引物。以往的研究發(fā)現(xiàn)，細胞色素C氧化酶Ⅰ（COⅠ）是動物界中最合適的DNA條形碼標準基因。所以，本文最終選用了MEUSNIER 等[27]公開發(fā)表的一對引物（COⅠ-A），且為了方便DNA測序，在每對引物上連接M13，由杭州擎科梓熙生物技術(shù)有限公司合成。

1.2.4 PCR 擴增

對每批樣品中提取的DNA 模板進行微型片段的PCR 擴增。每個PCR 擴增體系（25 μL）如下：PCR 擴增試劑12.5 μL，ddH2O 9.5 μL，10 μmol/L 正向引物0.5 μL，10 μmol/L 反向引物0.5 μL，DNA 模板2 μL。DNA 微條形碼片段擴增程序：95 ℃預(yù)變性2 min；95 ℃變性1 min，46 ℃退火1 min，72 ℃延伸30 s，循環(huán)5次；95 ℃變性1 min，53 ℃退火1 min，72 ℃延伸30 s，循環(huán)35 次；最后，72 ℃延伸10 min。擴增產(chǎn)物于-20 ℃條件下保存。

1.2.5 PCR 擴增片段的檢驗及DNA 測序

采用2.0%瓊脂糖凝膠電泳對PCR 擴增片段進行檢驗。每一個凝膠孔內(nèi)加入3 μL上樣緩沖液（日本TaKaRa公司）和6 μL PCR擴增產(chǎn)物，電泳20 min，同時設(shè)置DNA 標志物和陰性空白對照。PCR 擴增產(chǎn)物經(jīng)分離后，在上述凝膠成像系統(tǒng)中進行確認分析。然后，將PCR擴增產(chǎn)物送至杭州擎科梓熙生物技術(shù)有限公司進行測序，所得的測序結(jié)果經(jīng)刪除兩端引物序列，獲得最終的擴增序列。

1.2.6 PCR 產(chǎn)物克隆測序

PCR 產(chǎn)物經(jīng)純化后直接測序，若出現(xiàn)雜峰，則說明該擴增DNA 條帶不止一個物種。針對多種肉制品摻混的情況，采用克隆測序，從PCR 產(chǎn)物中挑選不同陽性克隆進行測序分析。純化后的PCR 產(chǎn)物與pGEM-T 載體連接后，導(dǎo)入DH5α 感受態(tài)細胞上，于36 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h，經(jīng)過藍-白篩選后，挑取10 個不同的白色菌落接種到LB（Luria-Bertani）液體培養(yǎng)基上，并于36 ℃條件下，在搖床上以150 r/min 培養(yǎng)過夜；取菌液1 mL，提取質(zhì)粒DNA，并送至杭州擎科梓熙生物技術(shù)有限公司進行測序。測序結(jié)果提交到GenBank數(shù)據(jù)庫（http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）中進行Blast比對。

2 結(jié)果與分析

2.1 DNA 提取方式優(yōu)化

DNA 的一般提取方法是用一次性鑷子直接取適量的組織，然后進行裂解提取，但是本實驗需要考察肉的摻假情況，所以樣品的均一性對于實驗結(jié)果的影響非常大，如果直接取或者簡單用料理機攪拌處理后取適量，會導(dǎo)致漏檢。針對上述情況，本研究采用真空冷凍干燥法對樣品進行預(yù)處理。取一定量代表性的樣品組織，冷凍干燥后，將樣品用粉碎機粉碎均勻。為驗證不同預(yù)處理的可靠性，采用牛肉摻豬肉模型[摻假（豬肉）比例為10%]，分別為經(jīng)料理機攪拌處理的摻假樣品A 和經(jīng)冷凍干燥處理后的摻假樣品B，取A和B樣品各10份，前處理和分析參照1.2節(jié)。試驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在樣品A中，檢出豬肉成分的比例為20%，而B 中的豬肉檢出比例為100%。所以，本研究最終選擇冷凍干燥法對樣品進行預(yù)處理。

樣品的取樣量也會決定樣品取樣的代表性，按照DNeasy 血液與組織提取試劑盒的要求，一般純的組織樣品只需要取10～25 mg 即可滿足試驗要求，但是如果摻假樣品的取樣量太少，則會影響取樣的代表性，造成漏檢。且在肉類加工中，如果沒有對加工設(shè)備進行完全清潔，則可能在加工下一批次其他種類的肉的時候帶入上一批次的肉（一般量非常少，我們可以認為這種行為不屬于摻假），這時如果取樣少、沒有代表性，則可能會造成對試驗結(jié)果的誤判。所以，本研究采用牛肉摻豬肉模型驗證樣品取樣量的可靠性。樣品經(jīng)料理機攪拌處理后，對25 mg 和0.5 g 取樣量進行考察，分別取10 份樣，前處理和分析參照1.2節(jié)。試驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)：當取樣量為25 mg時，樣品中檢出豬肉成分的比例為30%，而當取樣量為0.5 g 時，樣品中檢出豬肉成分的比例為100%。所以，本研究最終采用0.5 g 的取樣量進行DNA提取。

對樣品的預(yù)處理方式和取樣量進行優(yōu)化后，本研究繼續(xù)對DNA 提取方式進行選擇和優(yōu)化。動物組織DNA一般采用快速提取法和柱膜法進行提取?？焖偬崛》ǖ膬?yōu)點是簡單、快捷、高效，缺點是沒有進行純化，DNA樣品中帶入的雜質(zhì)會影響后續(xù)PCR的效率；柱膜法的優(yōu)點是提取的DNA純度高、干凈，基本去除了樣品中帶入的雜質(zhì)，缺點是步驟煩瑣，成本高。本研究分別采用快速提取盒和柱膜法提取試劑盒（DNeasy 血液與組織提取試劑盒）提取11種肉的DNA，提取后的DNA 經(jīng)PCR 擴增和凝膠電泳確認。試驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)：經(jīng)柱膜法提取凈化的DNA條帶比較清晰；而經(jīng)快速提取法提取的DNA 中，牛肉、羊肉、馬肉沒有相應(yīng)的清晰條帶，同時柱膜法的條帶亮度明顯高于快速提取法。所以，本研究最終采用柱膜法對肉類的DNA進行提取凈化。

2.2 DNA 微條形碼序列片段擴增條件的優(yōu)化

11 種肉樣品DNA 經(jīng)優(yōu)化的預(yù)處理和提取后，分別以通用引物COⅠ-A、COⅠ-B和COⅠ-C（具體引物序列見表1）進行PCR 擴增，擴增產(chǎn)物用2%瓊脂糖凝膠電泳進行檢測。結(jié)果表明：引物COⅠ-B擴增的目標片段大小為250 bp左右，不能擴增出鼠的PCR 產(chǎn)物，而在250 bp 左右有顏色較淺的條帶；引物COⅠ-C 擴增的目標片段大小為200 bp 左右，不能擴增出羊、馬和驢的PCR產(chǎn)物；引物COⅠ-A擴增的目標片段大小為130 bp左右，能全部擴增出11種肉的PCR 產(chǎn)物。所以，本研究采用COⅠ-A 作為生鮮肉制品中11種肉摻混研究的引物。

表1 引物序列Table 1 Primer sequence

同時，本研究對PCR 擴增條件進行優(yōu)化，包括PCR擴增體系和擴增程序的優(yōu)化。采用25 μL擴增體系對DNA 模板濃度進行考察，當DNA 模板濃度過低或者過高時都會抑制擴增效率。本研究分別采用1、2、3 μL 的DNA 模板量，當DNA 模板量為1和3 μL 時，11 種肉類的DNA 擴增條帶顏色較DNA模板量為2 μL 的時候淡，所以本研究采用的DNA模板量為2 μL。同時，我們對擴增程序進行了優(yōu)化。在PCR擴增程序中，退火溫度對擴增效率影響較大。本研究采用50、53和57 ℃這3個退火溫度分別對11 種肉的DNA 擴增效率進行考察。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：當退火溫度為53 ℃時，11種肉的DNA擴增效率最高，電泳條帶最清楚，而且在該擴增條件下，低經(jīng)濟價值的肉類（豬肉、雞肉、鴨肉、馬肉、驢肉、鼠肉）的DNA擴增效率較高，能滿足本研究摻假模型的建立以及目標摻假肉類的檢測。

11 種肉的PCR 擴增產(chǎn)物電泳結(jié)果如圖1 所示。11種肉在100～200 bp之間均有一條較明顯的擴增條帶。

圖1 11種純?nèi)獾腄NA微條形碼PCR電泳圖Fig.1 Electrophoresis images of DNA mini-barcoding fragments from 11 species of meats amplified by PCR

將11 種肉的PCR 擴增產(chǎn)物送至杭州擎科梓熙生物技術(shù)有限公司進行克隆測序，測序鑒定結(jié)果如表2所示。

表2 11種純?nèi)獾腄NA微條形碼檢測結(jié)果Table 2 DNA mini-barcoding testing results for 11 species of meats

2.3 生鮮肉摻假模型的建立

本研究主要設(shè)置18種肉的摻假模型，采用高經(jīng)濟價值的肉類（牛肉、羊肉、鴿子肉、鵝肉、兔肉）與低經(jīng)濟價值的肉類（豬肉、雞肉、鴨肉、馬肉、驢肉、鼠肉）的摻混模式，具體見表3。

表3 肉類摻假模型Table 3 Meat adulteration model

在生鮮肉制品加工過程中，除了破壞其正常的感官性狀之外，還可能加入一些香精、香料、色素等添加劑，以掩飾摻入的其他低經(jīng)濟價值的肉類?；诖?，本研究考察了5 種高經(jīng)濟價值肉類摻假的可能性，一共建立18 個摻假模型，然后在每個摻假模型中分別加入5%、10%、15%和20%的摻假比例來考察本方法的最低檢出比例（檢測靈敏度）。試驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)：本方法對牛肉和羊肉生鮮肉制品中摻假的檢出靈敏度較高，6 種摻假肉類（豬肉、馬肉、驢肉、鴨肉、雞肉、鼠肉）的最低檢出比例為5%，而在鴿子肉、鵝肉、兔肉的摻假模型中，各種肉類的最低檢出（摻假）比例均為10%，表明本方法能滿足日常的檢測要求。

2.4 實際樣品檢測

為了進一步驗證建立的檢測方法的適用范圍，在實際樣品檢測中，盡量選擇不同性狀的生鮮肉制品，包括肉糜、肉條、鮮肉丸、風干肉、肉排、肉卷等。

利用建立的檢測方法，25 批次生鮮肉制品經(jīng)提取DNA 模板和擴增之后，均能得到較清晰的條帶。陰性對照組無擴增條帶，證明整個體系均未被污染。將擴增的PCR 產(chǎn)物送至杭州擎科梓熙生物技術(shù)有限公司進行克隆測序，結(jié)果如表4 所示。從中可以看出：11 批次的生鮮牛肉制品中有4 批次檢出摻假其他肉類，其中3 批次檢出豬肉成分，1 批次檢出鴨肉成分，摻假比例為36%，主要集中在牛肉卷、牛肉丸、牛肉糜以及牛肉條中；9 批次的生鮮羊肉制品中有2 批次檢出摻假其他肉類，其中1 批次生羊肉串檢出鴨肉成分，1 批次羊肉丸檢出豬肉成分，摻假比例為22%；2 批次的生鮮鵝肉制品、2 批次的生鮮兔肉制品和1 批次的鴿子肉均未發(fā)現(xiàn)有摻假現(xiàn)象。25 批次的生鮮肉制品中一共有6 批次出現(xiàn)摻假問題，摻假率高達24%。其中，有4 批次的生鮮肉制品中檢出豬肉成分，2 批次的生鮮肉制品中檢出鴨肉成分。同時，為了驗證本檢測方法的可靠性，我們對上述6 批次的摻假樣品采用農(nóng)業(yè)行業(yè)標準《肉類源性成分鑒定 實時熒光定性PCR法》（NY/T 3309—2018）進行檢測，本方法與此結(jié)果一致。從上述結(jié)果可以看出，2 類高經(jīng)濟價值生鮮肉類制品的摻假率比較高，會被摻入豬肉和鴨肉成分。雖然從理論上說這些摻假肉在感官、性狀等方面與被摻假的肉不一樣，但是在實際生產(chǎn)過程中一些不法商家會加入一些添加劑（色素、香精、香料等）來改變生鮮肉制品原有的性狀，使得消費者很難用肉眼來辨別真假，也導(dǎo)致市售生鮮肉制品的摻假率居高不下。

表4 實際樣品檢測結(jié)果Table 4 Detecting results of practical samples

3 小結(jié)

本文建立了基于COⅠ的DNA 微條形碼技術(shù)，以對生鮮肉制品中的11種肉摻假情況進行鑒定；同時，優(yōu)化了樣品前處理、DNA提取和PCR擴增條件。與其他檢測技術(shù)相比，該DNA微條形碼技術(shù)檢出靈敏度較高，簡便、經(jīng)濟、高效，適合正常的生鮮肉制品摻假鑒別，又不易出現(xiàn)誤判，能夠滿足日常大批量生鮮肉制品質(zhì)量監(jiān)督檢測的需求。