鈉鉀泵Scr復合體對幼年哮喘大鼠氣道炎癥和氣道重塑的影響及其機制研究

黃河清，白燕

哮喘是一種常見疾病，可嚴重降低人們的生活質量并影響人類健康［1］，其發(fā)生、發(fā)展機制目前尚未完全闡明。研究表明，除炎癥和氣道高反應外，哮喘患者支氣管氣道結構也會發(fā)生改變，即氣道重塑［2］。轉化生長因子β1（transforming growth factor beta 1，TGF-β1）作為調節(jié)氣道重塑的主要因子之一，可促進成纖維細胞前體分化為成肌纖維細胞并促使其增殖［3］。血管內皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）是一種多功能血管生成調節(jié)劑，在哮喘患者中呈過表達，且其表達水平與疾病活動度呈正相關，與支氣管直徑和氣道高反應性呈負相關［4］。VEGF和TGF-β1均是氣道重塑的經典標志物。氣道結構細胞中氣道上皮細胞、平滑肌細胞及成纖維細胞均是白介素13（interleukin 13，IL-13）的靶細胞，故IL-13在氣道重塑中起關鍵作用［5］。內皮素1（endothelin1，ET-1）作為一種具有促進生長特性的有效支氣管收縮劑和內源性血管收縮劑肽，可參與香煙煙霧引起的血管和氣道高反應［6］。有動物實驗表明，ET-1會影響鼠哮喘模型的氣道重塑［7］。三磷腺苷（adenosine triphosphate，ATP）水解后鈉泵會將3個胞內鈉離子交換兩個胞外鉀離子［8］。研究表明，許多與Na+-K+-ATP酶相互作用的化合物可緩解急性或慢性哮喘患者的臨床癥狀［9］。層粘連蛋白α4（LAMα4）普遍存在于內皮基底膜中。T淋巴細胞、嗜中性粒細胞和單核細胞的外滲主要發(fā)生在高表達LAMα4的部位，表明LAMα4可能會促進外滲。鈉鉀泵Scr復合體亦稱琥珀酸-細胞色素c氧化還原酶，其是由復合體Ⅱ和復合體Ⅲ組成。本研究旨在探究鈉鉀泵Scr復合體對幼年哮喘大鼠氣道炎癥和氣道重塑的影響及其機制，現報道如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 本實驗時間為2019年7月—2020年8月。從軍事醫(yī)學科學院實驗動物中心購買120只8周齡SD雄性大鼠，體質量為110～130 g，放置在沒有特定病原體、溫度和濕度可控的環(huán)境中，大鼠可隨意進水和食物。

1.2 實驗分組及干預方法 將120只SD雄性大鼠隨機分為對照組、哮喘組和治療組，每組40只。對照組大鼠于實驗第1天腹腔注射5%磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer saline，PBS）1 μl+氯化鈉溶液 100 μl。哮喘組大鼠先制備哮喘模型［10］，具體如下：實驗第1天和第14天，腹膜注射乳化的卵清蛋白（OVA，Ⅴ級）100 μg致敏；實驗第25～27天，通過大鼠鼻內遞送OVA 100 μg+PBS 50 μl。造模成功后，腹腔注射二甲亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）1 μl+氯化鈉溶液100 μl。治療組大鼠先制備哮喘模型，方法同哮喘組，造模成功后給予鈉鉀泵Scr復合體藥物（Sigma公司生產），具體用法：鈉鉀泵Scr復合體藥物0.3 mg/kg溶解在20 mg/ml的DMSO中，并采用PBS稀釋至1 ml，腹腔注射。實驗結束后（即實驗第28天）檢測三組大鼠相關指標。本實驗已通過武漢市東西湖區(qū)人民醫(yī)院動物倫理委員會審核批準。

1.3 檢測方法

1.3.1 實時熒光定量聚合酶鏈式反應（qPCR） 使用TRIzol試劑（上海碧云天生物技術有限公司生產，生產批號：20190258A）從肺組織中提取總RNA，并采用ReverTra Ace qPCR RT Master Mix合成cDNA。使用SYBR Premix Ex Taq?一式三份進行qPCR。熱循環(huán)條件：95 ℃變性 1 min，60 ℃退火 10 s，72 ℃延伸 10 s，共40個循環(huán)。內參基因為GAPDH，采用2-ΔΔCt方法計算Na+-K+-ATP酶、Ca2+-ATP酶相對表達量。

1.3.2 蛋白質印跡法 使用放射免疫沉淀測定法（RIPA）裂解緩沖液（上海碧云天生物技術有限公司生產，生產批號：201801102D）從肺組織中提取蛋白質。在十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）凝膠上通過電泳分離總蛋白60 μg，轉移到聚偏氟乙烯（PVDF）膜上（Millipor公司，美國），在室溫下用含TBST的5%脫脂奶粉封閉1 h。膜與一抗在4 ℃環(huán)境下孵育過夜，與辣根過氧化物酶（上海碧云天生物技術有限公司生產，生產批號：20180112D）偶聯的抗兔二抗〔1∶5 000；安諾倫（北京）生物科技有限公司生產〕在室溫下孵育1 h。使用Fusion Fx7圖像采集系統(tǒng)（Vilber Lourmat公司，法國），通過ECL化學發(fā)光試劑（Beyotime生物技術研究所）捕獲化學發(fā)光圖像，使用Image J軟件通過光密度測定法定量測定肺組織Scr及LAMα4相對表達量。

1.3.3 肺組織病理學檢查 支氣管肺泡灌洗后獲得完整的左肺，并在4%的低聚甲醛中固定24 h。將樣品脫水并包埋在石蠟中，切成4 μm的組織切片。分別采用蘇木素-伊紅（HE）（上海碧云天生物技術有限公司生產，生產批號：20180560M）、高碘酸-席夫（PAS）（上海碧云天生物技術有限公司生產，生產批號：20190956X）染色并分析切片。HE染色用于評估支氣管周圍和血管周圍炎性細胞浸潤情況，PAS染色用于評估杯狀細胞增殖情況。由兩名對實驗不知情的觀察員評估肺組織炎癥病變程度，肺組織炎癥病變程度由輕到重分為4級，分別記為0～3分［11］，其中無炎癥為0級（記為0分），偶有炎性細胞套扎為1級（記為1分），大多數支氣管或血管被薄層包圍為2級（記為2分），大多數支氣管或血管有一層較厚的炎性細胞為3級（記為3分）。如果炎癥病變程度為2～3級，則增加0.5分，支氣管周圍和血管周圍肺組織炎癥評分之和為肺組織炎癥評分。使用Image Pro Plus 6.0軟件測量PAS陽性面積占比。

1.3.4 免疫組織化學法（immunohistochemistry，IHC） 采用免疫組織化學EnVision二步法染色，每個載玻片隨機選擇3個視野（×250），使用具有Image-pro Plus醫(yī)學圖像分析系統(tǒng)的Olympus Cx31顯微鏡（Olympus公 司， 日 本） 定量測定 TGF-β1（ 抗 TGF-β1，1∶100稀釋；上海碧云天生物技術有限公司生產，生產批號：20190523B）和VEGF（抗VEGF，1∶100稀釋；上海碧云天生物技術有限公司生產，生產批號：20190630K）表達量。

1.3.5 酶聯免疫吸附試驗（ELISA） 采用ELISA試劑盒（eBioscience公司，美國）定量檢測肺組織中IL-13、ET-1含量，并嚴格按照試劑盒說明書進行操作。

1.4 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 20.0統(tǒng)計學軟件（美國IBM公司）進行數據處理。符合正態(tài)分布的計量資料以（± s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 肺組織 Na+-K+-ATP酶、Ca2+-ATP酶、Scr、LAMα4相對表達量 三組大鼠肺組織Na+-K+-ATP酶、Ca2+-ATP酶、Scr及LAMα4相對表達量比較，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；哮喘組和治療組大鼠肺組織Na+-K+-ATP酶、Ca2+-ATP酶、Scr相對表達量低于對照組，LAMα4相對表達量高于對照組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；治療組大鼠肺組織Na+-K+-ATP酶、Ca2+-ATP酶、Scr相對表達量高于哮喘組，LAMα4相對表達量低于哮喘組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），見表1。

表1 三組大鼠肺組織Na+-K+-ATP酶、Ca2+-ATP酶、Scr及LAMα4相對表達量比較（± s）Table 1 Comparison of relative expression levels of Na+-K+-ATPase，Ca2+-ATPase，Scr and LAMα4 in lung tissue among the three groups

表1 三組大鼠肺組織Na+-K+-ATP酶、Ca2+-ATP酶、Scr及LAMα4相對表達量比較（± s）Table 1 Comparison of relative expression levels of Na+-K+-ATPase，Ca2+-ATPase，Scr and LAMα4 in lung tissue among the three groups

注：ATP=三磷酸腺苷，LAMα4=層粘連蛋白α4；與對照組比較，aP＜0.05；與哮喘組比較，bP＜0.05

組別 只數 Na+-K+-ATP酶 Ca2+-ATP酶 Scr LAMα4對照組 40 1.83±0.14 2.55±0.24 4.78±0.32 1.89±0.14哮喘組 40 0.66±0.12a 0.89±0.13a1.55±0.13a 8.47±0.26a治療組 40 1.64±0.13ab 2.18±0.24ab3.47±0.28ab4.11±0.36ab F值 17.292 13.171 13.907 13.748 P值 ＜0.001 ＜0.001 ＜0.001 ＜0.001

2.2 肺組織炎癥評分和PAS陽性面積占比 三組大鼠肺組織炎癥評分和PAS陽性面積占比比較，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；哮喘組和治療組大鼠肺組織炎癥評分高于對照組，PAS陽性面積占比大于對照組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；治療組大鼠肺組織炎癥評分低于哮喘組，PAS陽性面積占比小于哮喘組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），見表2。與對照組大鼠相比，哮喘組大鼠細支氣管周圍和血管周圍存在更多的炎性細胞浸潤及大量的杯狀細胞，治療組較哮喘組大鼠炎性細胞浸潤及杯狀細胞減少，見圖1。

圖1 三組大鼠肺組織病理學檢查結果（×200）Figure 1 Pathological examination results in lung tissue of the three groups

表2 三組大鼠肺組織炎癥評分和PAS陽性面積占比比較（±s）Table 2 Comparison of inflammation score and PAS positive area in lung tissue among the three groups

表2 三組大鼠肺組織炎癥評分和PAS陽性面積占比比較（±s）Table 2 Comparison of inflammation score and PAS positive area in lung tissue among the three groups

注：PAS=高碘酸-席夫；與對照組比較，aP＜0.05；與哮喘組比較，bP＜0.05

組別 只數 炎癥評分（分） P A S陽性面積占比（%）對照組 4 0 0.5 3±0.0 6 0.8 8±0.2 1哮喘組 4 0 2.8 7±0.1 2 a 6.7 8±0.3 4 a治療組 4 0 1.3 5±0.1 7 ab 4.2 3±0.2 6 ab F值 1 2.7 3 8 1 2.7 3 8 P值 ＜0.0 0 1 ＜0.0 0 1

2.3 肺組織TGF-β1和VEGF表達情況 三組大鼠肺組織TGF-β1和VEGF表達比較，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；哮喘組和治療組大鼠肺組織中TGF-β1和VEGF表達高于對照組，治療組大鼠肺組織TGF-β1和VEGF表達低于哮喘組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），見表3、圖2。

圖2 三組大鼠肺組織免疫組織化學染色結果（SP染色，×200）Figure 2 Immunohistochemical results in lung tissue of the three groups

表3 三組大鼠肺組織TGF-β1和VEGF表達比較（±s）Table 3 Comparison of expression level of TGF-β1 and VEGF in lung tissue among the three groups

表3 三組大鼠肺組織TGF-β1和VEGF表達比較（±s）Table 3 Comparison of expression level of TGF-β1 and VEGF in lung tissue among the three groups

注：TGF-β1=轉化生長因子β1，VEGF=血管內皮生長因子；與對照組比較，aP＜0.05；與哮喘組比較，bP＜0.05

組別 只數 T G F-β 1 V E G F對照組 4 0 3.4 7±0.3 2 2.7 8±0.1 1哮喘組 4 0 1 1.5 7±1.1 3 a 8.9 8±0.2 3 a治療組 4 0 6.3 4±0.1 8 ab 4.6 7±0.2 2 ab F值 1 4.8 2 9 1 6.2 8 9 P值 0.0 1 3 0.0 0 8

2.4 肺組織IL-13和ET-1 三組大鼠肺組織IL-13和ET-1比較，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；哮喘組和治療組肺組織大鼠IL-13和ET-1高于對照組，治療組大鼠肺組織IL-13和ET-1低于哮喘組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），見表4。

表4 三組大鼠肺組織IL-13和ET-1比較（±s，pg/mg）Table 4 Comparison of IL-13 and ET-1 in lung tissue among the three groups

表4 三組大鼠肺組織IL-13和ET-1比較（±s，pg/mg）Table 4 Comparison of IL-13 and ET-1 in lung tissue among the three groups

注：IL-13=白介素13，ET-1=內皮素1；與對照組比較，aP＜0.05；與哮喘組比較，bP＜0.05

組別 只數 IL-13 ET-1對照組 40 130.27±8.29 15.33±1.45哮喘組 40 324.66±14.82a 42.92±1.48a治療組 40 189.07±12.03ab 26.82±2.93ab F值 18.927 13.930 P值 0.016 0.007

3 討論

哮喘是一種慢性氣道炎性疾病，與氣道炎癥和氣道結構改變有關，而氣道炎癥和氣道重塑均可導致氣道高反應。目前，支氣管哮喘的常見治療方法是吸入長效β2-腎上腺素激動劑和糖皮質激素，以迅速緩解急性哮喘癥狀，減輕支氣管收縮和氣道炎癥，但部分患者對聯合用藥依從性較差或存在不良反應。因此，尋找補充療法（尤其是植物療法）及有效控制氣道重塑的藥物已成為哮喘新的研究方向。

既往研究表明，Na+-K+-ATP酶活性藥物具有抑制哮喘的作用［12］，質子泵抑制劑能有效緩解咳嗽癥狀［13］。體液和軸突的鈉泵會調節(jié)膜電位，而抑制其調節(jié)作用將會抑制動作電位的產生。研究表明，鈉泵調節(jié)劑會選擇性作用于同工酶［14］。本研究結果顯示，哮喘組和治療組大鼠肺組織Na+-K+-ATP酶、Ca2+-ATP酶相對表達量低于對照組，治療組大鼠肺組織Na+-K+-ATP酶、Ca2+-ATP酶相對表達量高于哮喘組，提示Na+-K+-ATP酶和Ca2+-ATP酶表達下調可能與哮喘發(fā)生有關。

層粘連蛋白（LAM）是一組異源三聚體蛋白質，由5個α、3個β、3個γ鏈組成，其與膠原蛋白Ⅳ、尼古丁和蛋白聚糖一起構成了基底膜的主要功能成分。在健康肺組織中，LAMα2、α3、α5、β1、β2、β3、γ1及γ2存在于氣道上皮下的基底膜中，而LAMα4、β1、β2和γ1存在于氣道平滑肌基底膜中［15-16］。研究表明，氣道平滑肌質量增加可能與氣道平滑肌細胞在增生和收縮表型之間轉換有關，暴露于增生刺激會誘導增生的氣道平滑肌表型［17］。本研究結果顯示，哮喘組和治療組大鼠肺組織LAMα4相對表達量高于對照組，治療組大鼠肺組織LAMα4相對表達量低于哮喘組。本研究結果還顯示，哮喘組和治療組大鼠肺組織炎癥評分高于對照組，PAS陽性面積大于對照組；治療組大鼠肺組織炎癥評分低于哮喘組，PAS陽性面積小于哮喘組，提示鈉鉀泵Scr復合體可有效減輕幼年哮喘大鼠氣道炎癥。

目前，鈉鉀泵在分子層面如何抵抗氣道重塑及涉及哪些下游分子和信號傳導途徑仍不清楚。氣道重塑的主要改變包括氣道上皮完整性破壞、細胞外基質沉積、新血管形成、血管重塑及黏液腺增生，尤其是氣道平滑肌細胞增生和肥大。研究表明，哮喘患者氣道平滑肌細胞數量異常增多，且其數量與哮喘持續(xù)時間及嚴重程度有關［18］。VEGF和TGF-β1均是氣道重塑的經典標志物。理論上講，氣道平滑肌質量增加可通過細胞增殖、細胞肥大或兩者實現。IL-13是由活化的T細胞、嗜堿粒細胞或肥大細胞產生的Th2型細胞因子［19］，其是變應原誘導的氣道高反應的重要遞質，可直接或單獨調節(jié)氣道平滑肌細胞，而不依賴于炎性反應，其在氣道平滑肌細胞、成纖維細胞、內皮和上皮細胞誘導的氣道重塑中起關鍵作用。ET-1是氣道平滑肌細胞的促分裂原和收縮激動劑，支氣管肺泡液中ET-1水平升高與氣道高反應和哮喘嚴重程度有關。機械壓縮支氣管上皮細胞有助于氣道平滑肌細胞的增殖和基礎收縮，而增強的增殖和收縮取決于上皮細胞衍生的ET-1。本研究結果顯示，哮喘組和治療組大鼠肺組織TGF-β1和VEGF表達高于對照組，治療組大鼠肺組織TGF-β1和VEGF表達低于哮喘組；哮喘組和治療組大鼠肺組織IL-13和ET-1高于對照組，治療組大鼠肺組織IL-13和ET-1低于哮喘組，提示鈉鉀泵Scr復合體可抑制TGF-β1、VEGF、IL-13、ET-1釋放，進而抑制氣道重塑。

綜上所述，鈉鉀泵Scr復合體可抑制幼年哮喘大鼠氣道炎癥及氣道重塑，其機制可能與調控LAMα4表達及抑制TGF-β1、VEGF、IL-13和ET-1的釋放有關。

作者貢獻：黃河清進行文章的構思與設計，研究的實施與可行性分析，撰寫并修訂論文，負責文章的質量控制及審校，并對文章整體負責、監(jiān)督管理；白燕進行數據收集、整理、分析，結果分析與解釋。

本文無利益沖突。