血管內(nèi)皮生長因子、基質(zhì)金屬蛋白酶9、基質(zhì)金屬蛋白酶2與垂體瘤卒中及垂體瘤頭痛的關(guān)系研究

金濤，周躍飛，王晰，楊西愛，陳鶴鳴

近年垂體瘤發(fā)病率逐漸升高，其可引發(fā)頭痛、內(nèi)分泌失調(diào)等癥狀；垂體瘤卒中是垂體瘤梗死或出血所導(dǎo)致的一組綜合征，具有發(fā)病急、癥狀嚴(yán)重、病情進(jìn)展快的特點(diǎn)［1］。目前，垂體瘤卒中的發(fā)生發(fā)展機(jī)制仍未完全明確。血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothlial growth factor，VEGF）不僅可介導(dǎo)血管新生，還可促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞遷移、增加血管通透性并參與腫瘤細(xì)胞的侵襲及遷移［2］； 基質(zhì)金屬蛋白酶（matrix metalloprotein，MMP）-9和MMP-2對(duì)基膜具有較強(qiáng)的降解作用，與多種惡性腫瘤的浸潤和遷移有關(guān)［3］。頭痛雖是垂體瘤及垂體瘤卒中的共有癥狀，但并非發(fā)生于所有患者［4］。本研究分析VEGF、MMP-9、MMP-2與垂體瘤卒中及垂體瘤頭痛的關(guān)系，以為臨床診療提供參考。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2010年1月—2018年5月在安康市中心醫(yī)院進(jìn)行手術(shù)治療的100例垂體瘤患者的病理組織標(biāo)本?；颊呒{入標(biāo)準(zhǔn)：（1）經(jīng)影像學(xué)檢查顯示鞍區(qū)占位病變，且經(jīng)病理學(xué)檢查確診為垂體瘤；（2）首次接受手術(shù)。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）臨床資料不全者；（2）既往有神經(jīng)性頭痛、血管性頭痛等其他明確病因所致慢性頭痛者；（3）其他部位、系統(tǒng)腫瘤患者；（4）既往接受激素治療者；（5）嚴(yán)重心、肝、腎、肺等臟器功能衰竭者；（6）凝血功能障礙者。根據(jù)垂體瘤卒中發(fā)生情況將所有患者分為觀察組（發(fā)生垂體瘤卒中）和對(duì)照組（未發(fā)生垂體瘤卒中），各50例。兩組患者性別、年齡、病理類型、腺瘤分型、頭痛發(fā)生率比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見表1。本研究經(jīng)安康市中心醫(yī)院倫理委員會(huì)審核批準(zhǔn)（編號(hào)：論201806），并獲得患者或家屬知情同意。

表1 兩組患者一般資料比較Table 1 Comparison of general information between the two groups

1.2 垂體瘤卒中的診斷標(biāo)準(zhǔn)［5］出現(xiàn)新發(fā)頭痛癥狀或原有頭痛癥狀加重，或突發(fā)惡心嘔吐、視功能障礙、眼肌麻痹甚至意識(shí)不清等癥狀；CT、磁共振成像（MRI）等影像學(xué)檢查顯示鞍區(qū)占位病變且密度不均；術(shù)中在瘤內(nèi)見陳舊性出血或壞死組織。

1.3 方法

1.3.1 VEGF、MMP-9、MMP-2免疫組織化學(xué)染色方法 取石蠟包埋的垂體瘤標(biāo)本進(jìn)行連續(xù)切片，厚度為4 μm，隔5取1，每個(gè)腫瘤組織取9張切片后隨機(jī)取其中3張，分別進(jìn)行VEGF、MMP-9、MMP-2免疫組織化學(xué)染色：將腫瘤組織切片經(jīng)二甲苯常規(guī)脫蠟、乙醇溶液透明，經(jīng)3%過氧化氫去除過氧化物酶，而后分別滴加Ⅰ抗（分別為兔抗人VEGF多克隆抗體、鼠抗人MMP-9多克隆抗體、鼠抗人MMP-2多克隆抗體），反應(yīng)過夜后滴加Ⅱ抗，再進(jìn)行DAB染色、蘇木素復(fù)染，最后在光鏡下觀察染色結(jié)果。

1.3.2 免疫反應(yīng)評(píng)分（immunorective score，IRS）［6］分別對(duì)VEGF、MMP-9、MMP-2免疫組織化學(xué)染色強(qiáng)度進(jìn)行評(píng)分：無著色為0分，淡黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分。其中陽性染色范圍評(píng)分：每張切片中隨機(jī)選擇5個(gè)視野（×400），計(jì)數(shù)100個(gè)腫瘤細(xì)胞并統(tǒng)計(jì)陽性細(xì)胞數(shù)，5個(gè)視野平均陽性細(xì)胞數(shù)即該片陽性細(xì)胞百分比，隨后進(jìn)行記分（＜5%記0分，5%～25%記1分，26%～50%記2分，51%～75%記3分，＞75%記4分）。IRS=染色強(qiáng)度評(píng)分×染色范圍評(píng)分。

1.4 觀察指標(biāo) （1）觀察兩組 VEGF、MMP-9、MMP-2免疫組織化學(xué)染色情況，并比較兩組VEGF、MMP-9、MMP-2的IRS。（2）根據(jù)患者垂體瘤頭痛發(fā)生情況分為頭痛67例和非頭痛33例，比較頭痛和非頭痛的垂體瘤患者VEGF、MMP-9、MMP-2的IRS。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 21.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。計(jì)數(shù)資料以相對(duì)數(shù)表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)；符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以（± s）表示，組間比較采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)；不符合正態(tài)分布的計(jì)量資料采用M（Q1，Q3）表示，組間比較采用Mann-Whitney U檢驗(yàn)；垂體瘤卒中及垂體瘤頭痛患者VEGF、MMP-9、MMP-2的IRS之間的關(guān)系采用Spearman秩相關(guān)分析；繪制受試者工作特征（receiver operating characteristic，ROC）曲線以分析VEGF、MMP-9、MMP-2的IRS對(duì)垂體瘤卒中的預(yù)測價(jià)值，各曲線下面積（AUC）的比較采用Hanley-McNeil檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 觀察組和對(duì)照組垂體瘤標(biāo)本的VEGF、MMP-9、MMP-2免疫組織化學(xué)染色情況 垂體瘤標(biāo)本HE染色見圖1A。與免疫組織化學(xué)染色陰性對(duì)照（見圖1B）比較，VEGF、MMP-9、MMP-2免疫組織化學(xué)陽性染色均呈棕黃色，主要表達(dá)于腫瘤細(xì)胞胞質(zhì)，且觀察組VEGF、MMP-9、MMP-2的染色強(qiáng)度高于對(duì)照組，見圖1C～H。

圖1 觀察組和對(duì)照組患者垂體瘤標(biāo)本的VEGF、MMP-9、MMP-2免疫組織化學(xué)染色情況（×400）Figure 1 The immunohistochemical staining condition of VEGF，MMP-9 and MMP-2 in pituitary tumor specimens of observation group and control group

2.2 觀察組和對(duì)照組VEGF、MMP-9、MMP-2的IRS比較 觀察組VEGF、MMP-9、MMP-2的IRS均高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見表2。

表2 兩組VEGF、MMP-9、MMP-2的IRS比較〔M（Q1，Q3），分〕Table 2 Comparison of IRS of VEGF，MMP-9，MMP-2 between the two groups

2.3 垂體瘤卒中患者VEGF、MMP-9、MMP-2的IRS相關(guān)性分析 Spearman秩相關(guān)分析結(jié)果顯示，垂體瘤卒中患者VEGF的IRS與MMP-9、MMP-2的IRS均呈正相關(guān)（rs值分別為0.433、0.319，P值均＜0.05），MMP-9的IRS與MMP-2的IRS呈正相關(guān)（rs=0.471，P＜0.05），見圖2。

圖2 垂體瘤卒中患者VEGF、MMP-9、MMP-2的IRS間關(guān)系的散點(diǎn)圖Figure 2 Scatter plot of correlation between IRS of VEGF，MMP-9 and MMP-2 in patients with pituitary apoplexy

2.4 VEGF、MMP-9、MMP-2的IRS對(duì)垂體瘤卒中的預(yù)測價(jià)值 ROC曲線分析結(jié)果顯示，VEGF、MMP-9、MMP-2的IRS預(yù)測垂體瘤卒中的AUC分別為0.839〔95%CI（0.754，0.924）〕、0.954〔95%CI（0.914，0.993）〕、0.918〔95%CI（0.862，0.973）〕。MMP-9的IRS預(yù)測垂體瘤卒中的AUC大于VEGF的IRS，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Z=2.672，P=0.008）；而VEGF的IRS與MMP-2的IRS及MMP-9的IRS與MMP-2的IRS預(yù)測垂體瘤卒中的AUC比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Z=1.630，P=0.103；Z=1.172，P=0.241），見表3、圖3。

表3 VEGF、MMP-9、MMP-2的IRS對(duì)垂體瘤卒中的預(yù)測價(jià)值Table 3 Predictive value of IRS of VEGF，MMP-9 and MMP-2 in pituitary apoplexy

圖3 VEGF、MMP-9、MMP-2的IRS預(yù)測垂體瘤卒中的ROC曲線Figure 3 ROC curve of IRS of VEGF，MMP-9 and MMP-2 in predicting pituitary apoplexy

2.5 頭痛與非頭痛的垂體瘤患者VEGF、MMP-9、MMP-2的IRS比較 頭痛的垂體瘤患者VEGF、MMP-9的IRS均高于非頭痛的垂體瘤患者，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；但頭痛與非頭痛的垂體瘤患者M(jìn)MP-2的IRS比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見表4。

表4 頭痛與非頭痛的垂體瘤患者VEGF、MMP-9、MMP-2的IRS比較〔M（Q1，Q3），分〕Table 4 Comparison of IRS of VEGF，MMP-9 and MMP-2 between headache and non-headache patients with pituitary tumor

2.6 垂體瘤頭痛患者VEGF、MMP-9、MMP-2的IRS間的相關(guān)性分析 Spearman秩相關(guān)分析結(jié)果顯示，垂體瘤頭痛患者VEGF的IRS與MMP-9、MMP-2的IRS均呈正相關(guān)（rs值分別為0.528、0.393，P值均＜0.05），MMP-9的IRS與MMP-2的IRS呈正相關(guān)（rs=0.603，P＜0.05），見圖4。

圖4 垂體瘤頭痛患者VEGF、MMP-9、MMP-2的IRS間關(guān)系的散點(diǎn)圖Figure 4 Scatter plot of correlation between IRS of VEGF，MMP-9 and MMP-2 in patients with pituitary tumor headache

3 討論

垂體瘤為常見顱內(nèi)腫瘤，發(fā)病率為10%～15%，且近年呈升高趨勢［7］。垂體瘤梗死或出血可導(dǎo)致垂體瘤卒中，患者表現(xiàn)為突發(fā)頭痛或原有頭痛癥狀加重、視覺障礙等，甚至昏迷或死亡［8］。目前，關(guān)于垂體瘤卒中的研究多圍繞誘發(fā)因素、治療方法等，針對(duì)其發(fā)生發(fā)展機(jī)制的研究尚處于起步階段，其分子機(jī)制尚未明確［9］。

VEGF不僅能夠通過促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖而促進(jìn)血管生成，還具有促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞遷移、增加血管通透性的生物學(xué)效應(yīng)，因此其是腫瘤細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移的促進(jìn)因素，并且也參與了垂體瘤的侵襲過程［10-12］。MMP是調(diào)節(jié)細(xì)胞外基質(zhì)降解的重要酶系，其中MMP-9對(duì)基膜的降解能力較強(qiáng)，其高表達(dá)不僅與多種惡性腫瘤的浸潤和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)［13］，也與垂體瘤免疫逃逸有關(guān)［14］，而且VEGF可能協(xié)同參與了垂體瘤卒中的發(fā)生過程［10］；MMP-2對(duì)Ⅳ型膠原蛋白具有特異性降解作用，而Ⅳ型膠原蛋白為細(xì)胞外基質(zhì)的主要組成成分［15］。有研究表明，MMP-9和MMP-2在垂體瘤蝶竇侵襲、海綿竇侵襲中均發(fā)揮了重要作用［6，16-18］，且二者可能是垂體瘤卒中的危險(xiǎn)因素［19-20］。由于VEGF、MMP-9和MMP-2均與腫瘤血管的通透性及不穩(wěn)定性有關(guān)，且可能均參與了垂體瘤卒中的發(fā)生，因此推測VEGF與MMP-9和MMP-2可能協(xié)同參與了垂體瘤卒中的發(fā)生發(fā)展。

本研究結(jié)果顯示，觀察組VEGF、MMP-9、MMP-2的IRS均高于對(duì)照組，表明VEGF、MMP-9、MMP-2可能參與了垂體瘤卒中的發(fā)生過程。Spearman秩相關(guān)分析結(jié)果顯示，垂體瘤卒中患者VEGF的IRS與MMP-9、MMP-2的IRS均呈正相關(guān)，MMP-9的IRS與MMP-2的IRS呈正相關(guān)，提示MMP-9、MMP-2可能與VEGF協(xié)同發(fā)揮了促進(jìn)腫瘤血管新生及破壞新生血管基底膜的作用，進(jìn)而導(dǎo)致垂體瘤卒中的發(fā)生［6］。于明圣等［6］研究表明，垂體瘤卒中患者VEGF、MMP-9的陽性表達(dá)水平高于非垂體瘤卒中患者，且二者呈正相關(guān)，本研究結(jié)果與之一致；VEGF可能通過與Endocan的正反饋機(jī)制協(xié)同促進(jìn)了垂體瘤的發(fā)展［21］，并通過誘導(dǎo)MMP-9表達(dá)共同參與了垂體瘤卒中的發(fā)生過程［6］。本研究結(jié)果還顯示，MMP-9的IRS預(yù)測垂體瘤卒中的AUC大于VEGF的IRS，提示MMP-9對(duì)垂體瘤卒中患者具有較高的預(yù)測價(jià)值。

垂體瘤卒中患者因出血、梗死、水腫導(dǎo)致垂體瘤快速擴(kuò)張，進(jìn)而引發(fā)頭痛、惡心、視力異常等癥狀，其發(fā)生率可分別達(dá)87%、80%、34%～56%，高于非垂體瘤卒中患者［4］；然而，仍有部分垂體瘤患者，無論是否發(fā)生垂體瘤卒中均無明顯頭痛等癥狀，且其分子機(jī)制尚不明確［4］。本研究結(jié)果顯示，頭痛的垂體瘤患者VEGF、MMP-9的IRS高于非頭痛的垂體瘤患者，分析原因?yàn)椋篤EGF、MMP-9不僅參與了垂體瘤的形成、遷移及浸潤［5，22-23］，且VEGF可進(jìn)一步誘導(dǎo)MMP-9表達(dá)而導(dǎo)致血管通透性增加、卒中后血腫增大或水腫加劇等［24-26］，因此可能進(jìn)一步誘發(fā)或加重頭痛。本研究結(jié)果還顯示，垂體瘤頭痛患者VEGF的IRS與MMP-9、MMP-2的IRS均呈正相關(guān)，MMP-9的IRS與MMP-2的IRS呈正相關(guān)，提示垂體瘤頭痛可能與VEGF、MMP-9、MMP-2的相互作用有關(guān)。

綜上所述，VEGF與MMP-9、MMP-2可能協(xié)同參與了垂體瘤卒中的發(fā)生過程，抗VEGF治療、抑制MMP-9與MMP-2或許可成為預(yù)防垂體瘤卒中的潛在方法；垂體瘤頭痛可能與VEGF、MMP-9、MMP-2的相互作用有關(guān)。但本研究樣本量較少，且對(duì)于VEGF、MMP-9、MMP-2的表達(dá)情況僅限于病理學(xué)層面，未來將采用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）及Western blotting等方法進(jìn)一步驗(yàn)證上述因子在垂體瘤病理組織中的轉(zhuǎn)錄及表達(dá)情況，且還需進(jìn)行動(dòng)物實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證結(jié)論。

作者貢獻(xiàn)：金濤、陳鶴鳴進(jìn)行文章的構(gòu)思與設(shè)計(jì)，并對(duì)文章整體負(fù)責(zé)、監(jiān)督管理；陳鶴鳴進(jìn)行研究的實(shí)施與可行性分析；金濤、王晰、陳鶴鳴進(jìn)行數(shù)據(jù)收集、整理、分析；周躍飛進(jìn)行結(jié)果分析與解釋；金濤撰寫論文，并進(jìn)行論文的修訂；楊西愛負(fù)責(zé)文章的質(zhì)量控制及審校。

本文無利益沖突。