ATP敏感鉀通道負向調(diào)節(jié)海馬長時程增強的維持

張曉琳，張小云，賀桂琴，孔 月，周子凱

上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬精神衛(wèi)生中心，上海200030

記憶長期存儲的分子基礎(chǔ)是腦科學(xué)的核心科學(xué)問題之一。突觸可塑性是指神經(jīng)細胞間的連接，即突觸的功能和形態(tài)，尤其是突觸傳遞強度可隨著自身活動的加強與減弱相應(yīng)發(fā)生較為持久的改變的特性或現(xiàn)象。突觸可塑性被認為是大腦高級功能例如學(xué)習(xí)和記憶的基礎(chǔ)。主要實驗?zāi)Ｐ桶ㄩL時程增強（long-term potentiation，LTP）和長時程抑制（long-term depression，LTD），并以LTP 為主［1-5］。LTP 與記憶類似，都可分為誘導(dǎo)、維持和消退3個階段。不同階段不僅在時程上區(qū)分明確，也各自對應(yīng)著截然不同的復(fù)雜的分子調(diào)控機制。長期以來，針對LTP 分子機制開展的大量研究主要集中于誘導(dǎo)階段，發(fā)現(xiàn)了許多重要信號分子和轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，包括鈣調(diào)蛋白依賴性蛋白激酶Ⅱ（calcium/calmodulin-dependent kinaseⅡ，CaMKⅡ）、蛋白激酶A（protein kinase A，PKA）、絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）、磷脂酰肌醇3 激酶（phosphoinositide 3-kinase，PI3K）等［1，6］。相較而言，關(guān)于LTP維持的關(guān)鍵分子研究較少，近年來主要發(fā)現(xiàn)有蛋白激酶Mζ（protein kinase Mζ，PKMζ） 和 蛋 白 激 酶Cι/λ （protein kinase Cι/λ，PKCι/λ）［7-10］。

ATP 敏 感 鉀 通 道（ATP-sensitive potassium channel，KATP）是一類非電壓依賴性的配體門控離子通道。KATP是由2種不同的亞基以1∶1的比例組成的異源八聚體，即4個內(nèi)向整流鉀通道（inwardly rectified potassium channel，Kir6.x）亞基與4 個磺脲類受體（sulfonylurea receptor，SUR）亞基形成的一個功能通道。KATP在體內(nèi)分布廣泛，尤其在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中高表達，主要分布于皮層、海馬體、紋狀體、黑質(zhì)和小腦等［11］。在正常生理情況下，細胞內(nèi)ATP 充足，與KATP位于Kir 亞基上的結(jié)合位點相結(jié)合，抑制KATP通道的開放，KATP處于關(guān)閉狀態(tài)；而當細胞代謝異常時，ATP/ADP 比值下降，KATP通道開放，引起K+外流，使得細胞膜超極化，降低神經(jīng)元興奮性，減少電活動［12］。因此KATP起到關(guān)聯(lián)神經(jīng)元細胞代謝狀態(tài)與電活動的作用。迄今，KATP在多種神經(jīng)系統(tǒng)疾病中的作用都有研究報道，包括癲癇［13］、帕金森?。?4］、阿爾茨海默?。?5］、病理學(xué)疼痛［16］等。一般認為KATP通道的激活開放可以降低神經(jīng)元興奮性，在上述病理條件下減輕能量代謝需求，從而起到神經(jīng)保護作用。

既往研究已對KATP在多種腦疾病中的作用和機制進行探討，但其在突觸可塑性中的作用不明。此外，多種代謝異常時的大腦病理狀態(tài)，例如腦缺血、腦缺氧時，都可造成記憶受損，但具體機制不清。本研究采用急性海馬切片的電生理記錄為主要研究手段，檢測KATP在LTP不同階段中的調(diào)節(jié)作用；并采用瞬時氧糖剝奪（oxygen glucose deprivation，OGD）模型探討KATP在代謝異常條件下引起LTP功能障礙過程中的作用。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗動物 5～6 周齡健康雄性C57BL/6 小鼠，由南京大學(xué)-南京生物醫(yī)藥研究院（原南京大學(xué)模式動物中心）提供。實驗動物生產(chǎn)許可證號為SCXK（蘇）2018-0008。實驗動物使用許可證號為SYXK（滬）2018-0028。飼養(yǎng)條件為12 h 光照/12 h 黑暗、20～25 ℃、相對濕度40%～70%。研究符合上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬精神衛(wèi)生中心實驗動物倫理操作規(guī)范。

1.1.2 主要試劑 人工腦脊液成分：NaCl 120 mmol/L，KCl 3 mmol/L，MgSO41.2 mmol/L，NaH2PO41 mmol/L，NaHCO326 mmol/L，CaCl22 mmol/L，D-葡萄糖11 mmol/L。KATP激活劑克羅卡林（cromakalim，CRO）、KATP阻斷劑甲苯磺丁脲（tolbutamide，TOL）及所有人工腦脊液成分試劑均購自美國Sigma-Aldrich公司。

1.1.3 主要儀器 Multiclamp 700B 膜片鉗放大器（Molecular Devices，美國），Digidata 1440A 數(shù)模轉(zhuǎn)換器（Molecular Devices，美國），Grass S88 電刺激器（A-M Systems，美國），Leica VT1200 半自動振動式切片機（Leica Biosystems Inc.，美國）。

1.2 實驗方法

1.2.1 急性海馬腦片制備 小鼠斷頸處死后，將大腦快速剝離并移至95%O2和5%CO2混合氣預(yù)飽和的4 ℃人工腦脊液中。1 min 后取出，將鼠腦從正中矢向切開，左右兩半球分別用樂泰404膠粘在振動式切片機載物槽的平臺上，以350μm厚度切片。隨后置于孵育槽內(nèi)，在28 ℃混合氣預(yù)飽和的人工腦脊液中恢復(fù)至少2 h 用于電生理記錄。

1.2.2 場電位電生理記錄 所有興奮性突觸后場電位（field excitatory postsynaptic potential，fEPSP）記錄都在急性海馬切片CA3-CA1 投射通路進行。玻璃記錄電極內(nèi)充人工腦脊液。所有電生理記錄實驗組均選擇來自6只小鼠的6張腦片（即n=6）。

基礎(chǔ)水平的輸入-輸出曲線（input-output curve，I-O曲線）記錄：以不同強度的單脈沖方波刺激激起CA1 錐體神經(jīng)元的fEPSP，線下分析得出對應(yīng)不同刺激強度的fEPSP降支10%～85%段的斜率后，規(guī)格化制得I-O曲線。

雙脈沖易化（paired-pulse facilitation，PPF）記錄：分 別 以 間 隔 為25、50、100、200、300、400、500、1 000 ms 的雙脈沖方波刺激誘發(fā)fEPSP，線下分析得出fEPSP 降支10%～85%段的斜率后，以雙脈沖后一fEPSP斜率除以前一fEPSP斜率，規(guī)格化制得PPF曲線。

LTP記錄：在記錄了穩(wěn)定的20 min fEPSP基線后，立即給予持續(xù)2次100 Hz高頻刺激，每次持續(xù)1 s，2次間隔10 s；隨后繼續(xù)記錄fEPSP 60 min。

OGD 模型：用95% N2/5% CO2混合氣處理的無糖人工腦脊液替換95%O2/5%CO2混合氣處理的含糖人工腦脊液，灌流5 min。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

所有數(shù)據(jù)都通過pCLAMP 10 電生理信號采集與分析軟件（Molecular Devices，美國）分析。采用SigmaStat軟件（Systat Software，美國）進行統(tǒng)計學(xué)分析?；A(chǔ)水平的突觸傳遞在各刺激強度和各時間點上進行組間比較。LTP 的幅度以各組記錄的最后10 min 取平均值后計算x±s并進行組間比較。組間比較采用student t 檢驗（Student's t test），P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 KATP開放不影響基礎(chǔ)水平的突觸傳遞

如圖1A 所示，在KATP開放劑CRO（100 μmol/L）持續(xù)灌流的情況下，I-O 曲線上CRO 組對應(yīng)各刺激強度的fEPSP 斜率與使用磷酸緩沖鹽溶液（phosphate buffer saline，PBS）灌流的對照組相比，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。說明當腦片處于基礎(chǔ)狀態(tài)時，突觸傳遞不受KATP開放的影響。由于研究［11］報道KATP亞細胞定位于突觸前，可能對突觸前的神經(jīng)遞質(zhì)囊泡釋放過程起調(diào)節(jié)作用，于是我們檢測了CRO 對PPF 這一經(jīng)典的突觸前功能指標的影響。

如圖1B 所示，當雙脈沖方波刺激之間時間間隔較短時，例如200 ms 以下時，第二個突觸后反應(yīng)的fEPSP 斜率與第一個反應(yīng)的fEPSP 斜率的比值大于100%，表明存在PPF。隨著時間間隔的增加，這一比值趨近于100%。CRO 組與PBS 對照組差異并無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。上述實驗說明KATP的異常開放不影響基礎(chǔ)水平的突觸傳遞。

圖1 KATP開放劑CRO不改變基礎(chǔ)水平的突觸傳遞Fig 1 KATP opener CRO did not modify synaptic properties at basal level.

2.2 KATP負向調(diào)節(jié)LTP的維持

為了檢測KATP在LTP的誘導(dǎo)和維持階段中的作用，分別在LTP 的誘導(dǎo)和維持階段灌流含有KATP開放劑CRO（100μmol/L）的人工腦脊液，并觀察其作用。如圖2A 所示，高頻刺激可以誘導(dǎo)出至少持續(xù)60 min的突觸傳遞增強，即LTP。根據(jù)高頻刺激后50～60 min 的fEPSP 斜率，發(fā)現(xiàn)CRO造成的KATP通道開放并未影響LTP的幅度。然而，當LTP產(chǎn)生并穩(wěn)定后，在圖2B所示的維持階段，即40 min時間點起開始灌流CRO，可顯著降低LTP 的幅度［PBS 組fEPSP 斜率=（141.4±6.9）%，CRO 組fEPSP 斜率=（118.2±6.4）%，P=0.010 6］，而KATP阻斷劑TOL 對LTP 的幅度無影響。這一結(jié)果說明KATP的開放狀態(tài)對LTP的誘導(dǎo)過程無影響，但是KATP保持關(guān)閉對LTP正常幅度的維持十分關(guān)鍵，因此KATP對LTP維持的調(diào)節(jié)作用屬于負向調(diào)節(jié)。

圖2 KATP開放劑CRO選擇性降低LTP維持階段的fEPSP幅度Fig 2 KATP opener CRO selectively reduced LTP magnitude at the maintenance stage

2.3 OGD通過異常開放KATP破壞LTP的維持

上述實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)LTP的維持需要KATP保持關(guān)閉，而腦缺血缺氧狀態(tài)又公認可造成顯著記憶損傷。因此，我們猜想腦缺血狀態(tài)有可能是通過異常激活KATP破壞LTP的維持，最終損傷記憶。為了驗證這一猜想，我們對腦片進行OGD 來模擬在體腦缺血缺氧狀態(tài)。如圖3A 所示，當給予高頻刺激誘導(dǎo)LTP 穩(wěn)定40 min 后，OGD 可造成fEPSP 反應(yīng)的幅度快速、顯著減弱（圖3A）。當撤去OGD 后，fEPSP 可在數(shù)分鐘內(nèi)快速恢復(fù)至正常水平。可見OGD 可以破壞LTP 的維持。圖3B 顯示在OGD 前10 min 開始進行TOL 預(yù)處理，阻斷KATP可以顯著緩解OGD 對LTP 的 維 持 造 成 的 影 響［OGD 組fEPSP 斜 率=（139.4±6.5）% ， TOL+OGD 組fEPSP 斜 率= （127.1±6.3）%，P<0.05］。

圖3 OGD損傷LTP的維持過程且可通過阻斷KATP預(yù)防Fig 3 OGD impaired LTP maintenance that can be largely prevented by pre-treatment of KATP blocker

3 討論

學(xué)習(xí)和記憶是大腦最基本的高級功能之一。在細胞和分子水平介導(dǎo)記憶存儲的神經(jīng)生物學(xué)機制長期以來一直是腦科學(xué)的研究熱點。在記憶的實驗?zāi)Ｐ蚅TP 的維持階段，一般認為快反應(yīng)α-氨基-3-羥基-5-甲基-4-異唑（α-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isox-azolepropionic acid，AMPA）型谷氨酸受體持續(xù)向細胞膜轉(zhuǎn)運和cAMP 反應(yīng)原件 結(jié) 合 蛋 白 （cyclic-AMP response element-binding protein，CREB）介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄調(diào)控及蛋白合成過程是突觸增強得以長時程維持的關(guān)鍵。研究［7］表明PKMζ 在海馬腦片LTP 及長時程聯(lián)合記憶的維持中起到了決定性的作用，被稱為“記憶分子”。隨后大量研究［9-10］發(fā)現(xiàn)PKMζ和PKCι/λ 這2 種非典型PKC 可相互代償，影響LTP 和海馬相關(guān)學(xué)習(xí)記憶的不同階段。

本研究發(fā)現(xiàn)，作為聯(lián)接細胞代謝狀態(tài)和神經(jīng)元活性的關(guān)鍵分子，KATP保持關(guān)閉狀態(tài)也是LTP得以維持的重要條件。與其他已知的LTP維持機制不同的是，KATP主要分布于突觸前膜，因此其造成的fEPSP 突觸反應(yīng)快速減弱主要可以歸因于突觸前神經(jīng)遞質(zhì)的釋放受到抑制。這與發(fā)生在突觸后的AMPA 型谷氨酸受體轉(zhuǎn)運以及細胞核內(nèi)CREB介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄過程并行存在，在不同的亞細胞組分上以不同的機制共同調(diào)節(jié)LTP的維持。本研究發(fā)現(xiàn)，KATP可能也是一個關(guān)鍵的“記憶分子”，起負向調(diào)節(jié)作用。進一步通過動物行為學(xué)研究檢測KATP的開放狀態(tài)是否與PKMζ和PKCι/λ 的失活類似，以及是否會“擦除”空間記憶、恐懼記憶等，是非常必要的。

此外，本研究發(fā)現(xiàn)KATP的開放狀態(tài)不影響基礎(chǔ)狀態(tài)的突觸傳遞，也不影響LTP 的誘導(dǎo)過程，說明LTP 的誘導(dǎo)過程可能不涉及KATP介導(dǎo)的神經(jīng)元興奮性改變。而在LTP的鞏固階段則可能發(fā)生了改變神經(jīng)元膜興奮性的細胞生物學(xué)過程，因此LTP的維持階段選擇性地受到KATP開放狀態(tài)的影響。由于離體腦片記錄需持續(xù)灌流糖、氧飽和的人工腦脊液，無法完全模擬在體代謝狀態(tài)，因此在體記錄活體動物在體電生理記錄，如多通道方式記錄在體LTP，可能提供更多的實驗證據(jù)支持這一結(jié)論。

在異常細胞能量代謝狀態(tài)下，如腦缺血缺氧時，ATP的快速耗竭可有效激活KATP通道，引起K+外流，使得細胞膜電位超極化，降低谷氨酸的過度釋放以及隨之而來的興奮毒性效應(yīng)，產(chǎn)生神經(jīng)保護效應(yīng)。該效應(yīng)已在癲癇［13］、帕金森病［14］、阿爾茨海默病［15］、病理學(xué)疼痛［16］等病理狀態(tài)有研究報道。阿爾茨海默病是一種以認知障礙和記憶減退為特征的神經(jīng)退行性疾病。Moriguchi等［15］研究發(fā)現(xiàn)阿爾茨海默病治療的一線藥物美金剛（memantine）可直接調(diào)節(jié)神經(jīng)元KATP通道中Kir6.2亞基的活性，并提出美金剛的起效機制是通過抑制Kir6.2通道開放來恢復(fù)LTP，并改善阿爾茨海默病患者記憶障礙。這與本研究中OGD 的實驗結(jié)果及推論一致，即KATP的病理性開放有損神經(jīng)可塑性，而抑制KATP可能緩解記憶障礙。值得注意的是，若長期過度抑制KATP的開放，理論上可能又會加重神經(jīng)元的損傷，甚至引起其他并發(fā)癥，如癲癇。但是，阿爾茨海默病患者大腦的興奮性與抑制性突觸傳遞平衡狀態(tài)顯著異于正常大腦。美金剛在實際應(yīng)用中是如何通過阻斷N-甲基-D-天冬氨酸（N-methyl-Daspartate，NMDA）型谷氨酸受體和KATP通道起效的具體機制，以及造成癲癇的可能性還有待進一步研究證實。

綜上，本研究表明在生理或病理條件下，KATP的激活均可負向調(diào)節(jié)LTP 的維持過程。該結(jié)果為記憶存儲的分子機制提供了新的認識，也為代謝異常型腦損傷造成的記憶障礙提供了新的認識。