25OHD3和IL-21在哮喘患兒血清中的表達及臨床意義

張雪雅 陳小芳 李昌崇

支氣管哮喘是兒童最常見的慢性肺部疾病，以慢性氣道炎癥、可逆性氣流受限、氣道高反應(yīng)性為特征。據(jù)估計，全世界受哮喘影響的患者超過3億，造成每天1000人死亡。哮喘死亡主要發(fā)生在急性惡化期間。2010年第3次全國城市兒童哮喘調(diào)查發(fā)現(xiàn)，在43個城市中，14歲以下兒童哮喘的發(fā)生率從2000年的2.0%上升到3.0%。學(xué)齡前兒童哮喘發(fā)生率為3.8%，高于嬰幼兒和學(xué)齡兒童。由此可見，兒童尤其是學(xué)齡前兒童哮喘早期診斷及治療具有非常重要的意義。近年來研究表明，維生素D缺乏與哮喘之間存在關(guān)系。兒童維生素D缺乏(vitamin D deficiency，VDD)與哮喘風(fēng)險增加、癥狀惡化和肺功能下降有關(guān)[1]。維生素D不僅通過抑制 T 輔助細(xì)胞 1(T-helper cells 1，Th1)相關(guān)細(xì)胞因子合成，而且通過調(diào)節(jié) Th2 細(xì)胞，調(diào)節(jié)性 T 細(xì)胞(regulatory T cells，Tregs)和 Th17 細(xì)胞的活性來發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用[2]。白細(xì)胞介素-21(interleukin-21，IL-21)是IL-2細(xì)胞因子家族中的一員，主要由活化的CD4+T細(xì)胞(包括T濾泡輔助細(xì)胞和Th17細(xì)胞)和自然殺傷性T細(xì)胞產(chǎn)生，作用于多種免疫細(xì)胞。在過敏性氣道炎癥動物模型中發(fā)現(xiàn)，IL-21R的缺失導(dǎo)致2型CD4+T細(xì)胞反應(yīng)受損[3]。此外，大量體外研究表明IL-21對CD4+T細(xì)胞分化起關(guān)鍵作用，IL-21可促進Th17分化，同時抑制FoxP3+Treg細(xì)胞[4,5]。因此，探討哮喘急性發(fā)作患兒血清中IL-21、25OHD3水平的變化具有重要意義。

對象與方法

1.研究對象:選取筆者醫(yī)院 2019 年 9 月～2020年8月收治的住院哮喘急性發(fā)作患兒共 51例，其中男性30例，女性21例，患者年齡3～10歲，平均年齡為 5.70±2.13歲。選擇同期在筆者醫(yī)院體檢健康兒童75例納入對照組,其中男性40例，女性35例，年齡 3～10歲，平均年齡為6.30±2.07 歲。兩組兒童均無基礎(chǔ)疾病，且年齡、性別及基礎(chǔ)疾病比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

2.診斷標(biāo)準(zhǔn)：符合中華醫(yī)學(xué)會兒科學(xué)分會呼吸學(xué)組2016年《兒童支氣管哮喘診斷與防治指南》[6]。急性發(fā)作期是指突然發(fā)生喘息、咳嗽、氣促、胸悶等癥狀，或原有癥狀急劇加重。維生素D缺乏定義為血清總25OHD3水平低于20ng/ml，維生素D不足為20～30ng/ml[7]。

3.納入標(biāo)準(zhǔn)：哮喘組: ①中華醫(yī)學(xué)會兒科學(xué)分會呼吸學(xué)組2016年《兒童支氣管哮喘診斷與防治指南》，哮喘急性發(fā)作期患兒；②年齡為3～14 歲；③近 1 個月內(nèi)未使用免疫抑制劑及口服或靜脈激素。對照組：既往無喘息史、過敏性疾病病史、佝僂病病史及自身免疫病病史，且近30天內(nèi)無感染病病史[6]。所有納入者自愿簽署知情同意書，本研究已通過筆者醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理學(xué)委員會批準(zhǔn)。

4.哮喘組和對照組排除標(biāo)準(zhǔn): ①存在肺結(jié)核或其他慢性肺部疾??；②過去3個月內(nèi)有眼、腹或胸外科手術(shù)；③過去3個月因心血管疾病住院；④過去3個月內(nèi)服用維生素D劑和鈣劑；⑤不能配合完成血液標(biāo)本采集視為脫落標(biāo)準(zhǔn)；⑥存在肝臟、腎臟、心臟功能損害視為剔除標(biāo)準(zhǔn)。

5.主要試劑及儀器:IL-21ELISA試劑盒(上海西唐生物科技有限公司)，全自動電化學(xué)發(fā)光免疫分析儀(瑞士羅氏公司)，酶標(biāo)儀(美國Thermo公司)，數(shù)字顯示隔水式電熱恒溫培養(yǎng)箱(上海躍進醫(yī)療器械廠)，離心機(上海安亭科學(xué)儀器廠)，移液槍(美國Thermo公司)等。

6.血清25OHD3檢測：采用電化學(xué)發(fā)光免疫分析法，按照標(biāo)準(zhǔn)流程操作檢測25OHD3水平。

7.血清IL-21檢測:取已分離-80℃保存血清，4℃解凍，采用酶聯(lián)免疫吸附法，嚴(yán)格按照試劑盒說明書配置試劑及檢測IL-21水平。

8.統(tǒng)計學(xué)方法：采用GraphPad Prism 8.3統(tǒng)計學(xué)軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析。計量資料比較采用t檢驗；計數(shù)資料采用χ2檢驗。血清指標(biāo)對急性發(fā)作期哮喘的診斷價值分析采用受試者工作特征(receiver operating characteristic，ROC)曲線。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1.兩組間血清25OHD3水平的比較：哮喘組急性發(fā)作患兒血清25OHD3水平明顯低于對照組(29.00±9.16ng/ml vs 32.89±10.15ng/ml，P<0.05)。同時，對照組<6歲兒童25OHD3血清水平明顯高于哮喘組<6歲兒童(39.85±10.14ng/ml vs 33.91±7.92ng/ml)，對照組≥6歲兒童25OHD3血清水平明顯高于哮喘組≥6歲兒童(27.98±6.79ng/ml vs 22.54±6.26ng/ml)，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。此外，組內(nèi)25OHD3血清水平比較發(fā)現(xiàn)對照組<6歲兒童顯著高于對照組≥6歲兒童(39.85±10.14ng/ml vs 27.98±6.79ng/ml)，哮喘組<6歲兒童顯著高于哮喘組≥6歲兒童(33.91±7.92ng/ml vs 22.54±6.26ng/ml)，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

2.兩組間血清IL-21水平比較：哮喘組與對照組中血清IL-21水平經(jīng)t檢驗，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，哮喘組急性發(fā)作患兒血清 IL-21 水平(422.1±201.0ng/ml)明顯高于對照組(233.8±169.8ng/ml)。

3.ROC曲線分析：血清IL-21、25OHD3對哮喘急性發(fā)作診斷ROC曲線下面積(area under curve，AUC)分別為0.76和0.61，其中IL-21的ROC曲線AUC大于25OHD3。進一步分析發(fā)現(xiàn)，25OHD3分別對<6歲患兒哮喘急性發(fā)作和≥6歲患兒哮喘急性發(fā)作診斷AUC分別為0.67和0.72(圖1，表1)。

表1 血清IL-21、25OHD3 AUC比較

圖1 哮喘急性發(fā)作期血清IL-21、25OHD3 ROC曲線分析

討 論

支氣管哮喘是目前威脅兒童生命健康最常見的慢性肺部疾病。早期診斷和治療是改善兒童生活質(zhì)量和挽救生命的有效手段。但是由于其發(fā)病機制復(fù)雜，目前尚未完全闡明。近年來研究表明，維生素D缺乏在支氣管哮喘發(fā)病機制中起重要角色，可能與氣道高反應(yīng)性、肺功能下降、哮喘惡化以及對激素治療反應(yīng)性降低有關(guān)[7,8]。Jolliffe等[9]研究發(fā)現(xiàn)，與安慰劑比較，補充維生素D可降低哮喘急性發(fā)作需要使用全身性皮質(zhì)類固醇治療或者住院治療的比例。進一步研究發(fā)現(xiàn)，這種作用與血清25OHD3濃度相關(guān)。對于血清25OHD3濃度<25nmol/L的受試者，補充維生素D顯著降低哮喘嚴(yán)重急性發(fā)作，但對于血清25OHD3≥25nmol/L的人群，補充維生素D對減少哮喘嚴(yán)重急性發(fā)作無統(tǒng)計學(xué)意義。本研究發(fā)現(xiàn)，與對照組比較，哮喘組兒童血清25OHD3降低，兩組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義。進一步研究發(fā)現(xiàn)，血清25OHD3濃度與年齡密切相關(guān)?！?歲正常兒童血清25OHD3濃度為27.98±6.79ng/ml，存在維生素D不足，且明顯低于<6歲正常兒童(39.85±10.14ng/ml)。而<6歲哮喘兒童血清25OHD3濃度為33.91±7.92ng/ml雖低于<6歲正常兒童，但明顯高于≥6歲哮喘兒童(22.54±6.26ng/ml)。由此筆者推測，補充維生素D對于≥6歲哮喘兒童尤為重要。

近年來，隨著對哮喘發(fā)病機制的深入研究，CD4+T細(xì)胞被認(rèn)為是哮喘發(fā)病機制的有效調(diào)節(jié)因子，尤其是Th2在哮喘發(fā)病中的作用逐漸得到認(rèn)可[10]。IL-4、IL-5和IL-13是Th2細(xì)胞產(chǎn)生的典型2型細(xì)胞因子，可介導(dǎo)哮喘和氣道炎癥的發(fā)展，表現(xiàn)為IgE介導(dǎo)的過敏反應(yīng)、氣道高反應(yīng)性以及嗜酸性粒細(xì)胞浸潤。然而，新的證據(jù)表明，T濾泡輔助細(xì)胞，而不是Th2細(xì)胞，主要在B細(xì)胞濾泡中產(chǎn)生IL-4和IL-21，并在小鼠和人類的嚴(yán)重哮喘發(fā)展過程中發(fā)揮作用[11～15]。

本研究發(fā)現(xiàn)，與對照組比較，哮喘組兒童血清IL-21顯著升高。類似地，Al-Ayed等[16]在沙特兒童研究中發(fā)現(xiàn)，與非哮喘兒童比較，哮喘兒童血清IL-21水平顯著增加。此外，與哮喘控制組比較，IL-21水平在哮喘未控制組中顯著升高。哮喘小鼠模型研究發(fā)現(xiàn)不僅在血清及肺泡灌洗液中IL-21水平升高，而且在肺和肺淋巴結(jié)中IL-21轉(zhuǎn)錄也發(fā)生上調(diào)[17]。另外，卵清蛋白誘導(dǎo)的哮喘小鼠模型研究表明，IL-21與氣道高反應(yīng)、嗜酸性粒細(xì)胞的浸潤和IgE生成相關(guān)[18]。進一步研究發(fā)現(xiàn)，與健康對照組比較，哮喘患者體內(nèi)表達IL-21的CD4+T細(xì)胞的比例增加。這種增加的比例與血液中總IgE水平呈正相關(guān)。而體外實驗表明，在B細(xì)胞與CXCR5+CD4+T細(xì)胞共培養(yǎng)實驗中,阻斷IL-21可導(dǎo)致B細(xì)胞產(chǎn)生IgE抗體的減少[19]。這些發(fā)現(xiàn)提示，IL-21在哮喘的發(fā)生、發(fā)展中起重要作用。此外，本研究ROC曲線顯示IL-21是輔助診斷哮喘急性發(fā)作的有效指標(biāo)。外周血IL-21水平似乎是有前途的診斷哮喘的生物學(xué)標(biāo)志物，尤其對于不能配合完成肺功能檢查的學(xué)齡前兒童。

綜上所述，IL-21、25OHD3在兒童哮喘急性發(fā)作中發(fā)揮作用，可作為診斷哮喘急性發(fā)作的輔助手段。隨著IL-21、25OHD3與哮喘的研究不斷深入，有可能發(fā)現(xiàn)治療哮喘的新型免疫療法。