多囊卵巢綜合征患者子宮內(nèi)膜差異表達(dá)基因的生物信息學(xué)分析

李慕白 張 巖 王 蔚 劉 麗 吳效科

多囊卵巢綜合征(polycystic ovary syndrome,PCOS)是一種臨床常見的內(nèi)分泌紊亂性疾病，好發(fā)于育齡期女性，且對(duì)女性的生活、工作以及心理健康有重大影響。該疾病臨床表現(xiàn)以月經(jīng)失調(diào)、脂代謝異常和高雄激素血癥為主。流行病學(xué)調(diào)查發(fā)現(xiàn)，各國各地區(qū)PCOS的臨床表現(xiàn)具有高度的異質(zhì)性，發(fā)生率約為8.7%～17.8%[1]。雖然異質(zhì)性較高，但由于PCOS會(huì)引起患病女性卵巢形態(tài)改變，故其對(duì)于女性生殖功能的損害是不可避免的。對(duì)此有研究發(fā)現(xiàn)，PCOS患者子宮內(nèi)膜蛋白質(zhì)組的差異是其子宮內(nèi)膜容受性降低和生育能力下降的重要原因[2]。本研究即從基因?qū)用娌捎蒙镄畔W(xué)技術(shù)比較PCOS患者子宮內(nèi)膜與健康人子宮內(nèi)膜差異表達(dá)基因，并對(duì)關(guān)鍵基因的生物學(xué)功能以及所影響的信號(hào)通路進(jìn)行探討，以期為臨床修復(fù)PCOS子宮內(nèi)膜損傷提供靶向治療新位點(diǎn)。

對(duì)象與方法

1.研究對(duì)象：從2019年4～9月于黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院婦科一科門診就診患者中挑選符合標(biāo)準(zhǔn)的PCOS患者3例(D組)，另招募健康女性3例(T組)。本研究納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)女性年齡18～35歲。(2)育齡期女性。(3)排除其他疾病病史。(4)符合2003年國際鹿特丹診斷標(biāo)準(zhǔn)[①稀發(fā)排卵或無排卵；②高雄激素的臨床表現(xiàn)和(或)高雄激素血癥生化特征；③卵巢多囊改變：婦科盆腔超聲檢查提示一側(cè)或雙側(cè)卵巢直徑2～9mm的卵泡≥12個(gè)，和(或)卵巢體積≥10ml。上述3項(xiàng)中符合2項(xiàng)，并排除其他引起高雄激素血癥疾病者,如先天性腎上腺皮質(zhì)增生、分泌雄激素的腫瘤、庫欣綜合征等即可確定診斷]。(5)了解本研究程序并簽署本研究知情同意書者。排除標(biāo)準(zhǔn)：①患有肝腎功能異常、心血管系統(tǒng)及其他內(nèi)分泌代謝紊亂性疾?。虎?個(gè)月內(nèi)曾服用激素類藥物；③妊娠、哺乳期女性及精神疾病患者；④合并心血管、腦血管、肝臟、腎臟和造血系統(tǒng)等嚴(yán)重原發(fā)性疾??；⑤近期參加過其他藥物臨床試驗(yàn)的患者。正常對(duì)照者年齡、體重等相近,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。本研究經(jīng)過黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理學(xué)委員會(huì)批準(zhǔn)(批準(zhǔn)編號(hào)：HZYLLKY201901201)。

2.子宮內(nèi)膜的提取及差異表達(dá)基因的篩選：所有入選女性均于月經(jīng)周期第7～10天內(nèi)行宮腔鏡檢查術(shù)及部分子宮內(nèi)膜診刮術(shù)。子宮內(nèi)膜樣本經(jīng)NanoDrop ND-2000(美國Thermo Scientific公司)定量并經(jīng)Agilent Bioanalyzer 2100(美國Agilent Technologies公司)檢測RNA完整性。質(zhì)檢合格后，將總RNA反轉(zhuǎn)錄成雙鏈cDNA，并合成用cyanine-3-CTP(Cy3)標(biāo)記的cRNA。標(biāo)記好的cRNA和芯片雜交洗脫后利用Agilent Scanner G2505C(美國Agilent Technologies公司)掃描得到原始圖像。采用Feature Extraction軟件(version10.7.1.1, 美國Agilent Technologies公司)處理原圖像提取原始數(shù)據(jù)。利用GeneSpring GX軟件(wersion14.9, 美國Agilent Technologies公司)對(duì)原始數(shù)據(jù)進(jìn)行質(zhì)檢標(biāo)準(zhǔn)化。根據(jù)t檢驗(yàn)的P值和倍數(shù)變化值進(jìn)行差異基因篩選，篩選標(biāo)準(zhǔn)為上調(diào)或者下調(diào)倍數(shù)變化值≥2.0且P<0.05。

3.基因功能及信號(hào)通路分析：采用Gene Ontology(GO)數(shù)據(jù)庫對(duì)篩選出來的差異基因進(jìn)行GO富集分析和 KEGG(Kyoto Encyclopedia of Gene and Genome)信號(hào)通路分析，同時(shí)繪制基因本體論氣泡圖。利用KEGG數(shù)據(jù)對(duì)差異基因進(jìn)行通路分析，并利用超幾何算法計(jì)算每個(gè)通路中差異基因富集的顯著性，顯著性富集的篩選標(biāo)準(zhǔn)為P<0.01。

4.蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建及基因編碼蛋白的亞細(xì)胞定位分析：將篩選出的差異基因輸入STRING數(shù)據(jù)庫，得到一個(gè)蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)(protein-protein interaction, PPI)圖。從中挑選出關(guān)鍵基因并利用PMLPR方法進(jìn)行蛋白質(zhì)亞細(xì)胞定位。

結(jié) 果

1.數(shù)據(jù)預(yù)處理：由于原始數(shù)據(jù)可能存在缺失值,基因?qū)?yīng)多個(gè)探針等情況，故對(duì)各個(gè)樣本的芯片進(jìn)行預(yù)處理，繪制預(yù)處理前后芯片對(duì)比圖(圖1)。

圖1 預(yù)處理前后樣本質(zhì)量箱式對(duì)比圖

2.差異基因分布情況：按照差異篩選標(biāo)準(zhǔn)，共篩選出230個(gè)差異表達(dá)基因。對(duì)差異篩選結(jié)果進(jìn)行火山圖繪制以確定差異基因分布情況(圖2)。

圖2 篩選差異基因分布情況

3.GO富集及KEGG信號(hào)通路分析：利用GO數(shù)據(jù)庫對(duì)差異表達(dá)基因進(jìn)行GO功能富集分析。主要包含3大類，即生物學(xué)工程(biological process, BP)、細(xì)胞組分(cellular component, CC)和分子功能(molecular function, MF)。GO富集分析結(jié)果顯示，其中BP中P<0.05的條目共計(jì)148條；CC中P<0.05的條目共計(jì)30條；MF中P<0.05的條目共計(jì)46條，主要包括參與蛋白輕、中鏈的結(jié)合，影響微管運(yùn)動(dòng)活性。對(duì)GO富集分析結(jié)果中各類P值最小的前10個(gè)條目繪制條形圖(圖3)。KEGG分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)P<0.05的通路共計(jì)13條(圖4)。

圖3 GO富集分析結(jié)果條形圖

4.蛋白相互作用分析及關(guān)鍵基因篩選：對(duì)所有篩選出的差異表達(dá)基因進(jìn)行PPI構(gòu)建并聚類(圖5)。綜合上述分析結(jié)果，從中篩選出6個(gè)與PCOS臨床研究相關(guān)且差異表達(dá)較為顯著的6個(gè)基因分別為CACNA1C、LAMB3、CCND2、PLCB4、IL7、NTF3。上述關(guān)鍵基因分子功能主要為影響蛋白結(jié)合、細(xì)胞分裂、層黏連蛋白復(fù)合體等。生物學(xué)過程主要參與組織器官生長發(fā)育、鈣離子通道調(diào)節(jié)、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等。主要信號(hào)通路富集于胰島素分泌、促性腺激素信號(hào)通路、PI3K/AKT信號(hào)通路等。其中CACNA1C、LAMB3、CCND2表達(dá)上調(diào)，剩余3個(gè)在D組表達(dá)均下調(diào)(表1)。

表1 關(guān)鍵基因相關(guān)數(shù)值

圖5 差異基因蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)

5.差異表達(dá)基因編碼蛋白的亞細(xì)胞定位分析：利用PMLPR，檢索條件為“Human”物種，分別輸入6個(gè)關(guān)鍵基因，結(jié)果顯示上述基因中除CCND2基因編碼蛋白亞細(xì)胞大概率定位于細(xì)胞核外，余下基因編碼蛋白位置處于細(xì)胞膜的可能性較大。

討 論

PCOS作為一種激素內(nèi)環(huán)境紊亂性疾病，主要引起生殖功能障礙和糖代謝異常。近年來，PCOS發(fā)生率逐年增加，但其發(fā)病機(jī)制仍不清楚。而遺傳因素是導(dǎo)致PCOS發(fā)病的主要因素之一，這一觀點(diǎn)受到了研究者的廣泛認(rèn)可。因此，從基因角度挖掘PCOS病情變化以及臨床治療已成為一條全新的臨床思路。有研究者采用全基因組關(guān)聯(lián)研究(GWAS)方法來確定常見疾病的遺傳因素，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，中國女性進(jìn)行的兩次GWAS中發(fā)現(xiàn)11個(gè)位點(diǎn)與PCOS發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)密切相關(guān)[3]。另外，有研究結(jié)果表明，與脂質(zhì)和類固醇合成相關(guān)的低甲基化基因能促進(jìn)類固醇激素(包括雄激素)的合成，從而解釋PCOS高雄激素血癥的機(jī)制[4]。也有研究者研究早期胰島素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)與異常轉(zhuǎn)化生長因子β(TGF-β)調(diào)節(jié)的組織纖維化的關(guān)系中發(fā)現(xiàn)，基因表達(dá)暗示了TGF小分子配體調(diào)節(jié)纖維化在PCOS-肥胖協(xié)同胰島素抵抗和運(yùn)動(dòng)反應(yīng)的改變[5]。

由于PCOS是一種婦科內(nèi)分泌疾病，故對(duì)其代謝紊亂的基因探索一直是研究重點(diǎn)，而對(duì)于女性生殖系統(tǒng)的基因探索則相對(duì)較少。有研究者觀察PCOS大鼠模型發(fā)現(xiàn)卵巢出現(xiàn)大量閉鎖卵泡和囊性擴(kuò)張，顆粒細(xì)胞層減少，卵泡細(xì)胞層增厚，濾泡膜細(xì)胞增生[6]。卵巢的形態(tài)學(xué)改變影響其正常生理功能，導(dǎo)致無成熟卵泡形成甚至無排卵，而子宮內(nèi)膜長期受雌激素影響，正常的內(nèi)膜周期發(fā)生紊亂，子宮內(nèi)膜呈不同程度的增殖性改變甚至發(fā)展成為子宮內(nèi)膜癌[7]。本研究為了明確PCOS患者子宮內(nèi)膜基因表達(dá)變化情況，采集PCOS患者及健康人部分增殖期子宮內(nèi)膜各3例，利用當(dāng)前先進(jìn)分子生物學(xué)技術(shù)，篩選出有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的230個(gè)差異表達(dá)基因，并對(duì)其進(jìn)行了功能富集和信號(hào)通路分析。后利用蛋白相互作用表達(dá)網(wǎng)絡(luò)挑選出6個(gè)與PCOS臨床研究密切相關(guān)且差異較為顯著的基因，其中在D組中CACNA1C、LAMB3、CCND2表達(dá)上調(diào)，PLCB4、IL7、NTF3表達(dá)下調(diào)。這些差異表達(dá)的基因蛋白產(chǎn)物主要位于細(xì)胞核和細(xì)胞膜上。上述基因分子功能主要為蛋白結(jié)合、細(xì)胞分裂、層粘連蛋白復(fù)合體等。生物學(xué)過程主要富集于組織器官生長發(fā)育、鈣離子通道調(diào)節(jié)、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等，這些基因的發(fā)現(xiàn)可能為PCOS患者子宮內(nèi)膜的修復(fù)提供新的臨床靶點(diǎn)。

CACNA1C基因位于人12號(hào)染色體上，即L-型鈣離子通道α1C亞基，其生物學(xué)功能是對(duì)人體內(nèi)鈣離子通道的調(diào)節(jié)，并參與了胰島素分泌信號(hào)通路。該基因是一種編碼電壓門控鈣通道的精神疾病風(fēng)險(xiǎn)基因，其轉(zhuǎn)錄譜非常復(fù)雜，最新被鑒定發(fā)現(xiàn)的就有38個(gè)外顯子和241個(gè)轉(zhuǎn)錄本[8]。該基因在PCOS方面暫無相關(guān)報(bào)道。但在子宮內(nèi)膜方面，Qiao等[9]對(duì)子宮內(nèi)膜癌突變基因進(jìn)行了篩選，發(fā)現(xiàn)KIAA1109、CACNA1C、BSN、AKAP13、CELSR2、HELZ2等基因的突變較為突出。這表明CACNA1C基因的表達(dá)對(duì)于人體子宮內(nèi)膜的病變有一定影響,這可能是引發(fā)少數(shù)PCOS患者隨著病情的發(fā)展逐漸出現(xiàn)子宮內(nèi)膜息肉甚至不典型增生的重要原因。

LAMB3、CCND2、IL7、NTF3都參與了PI3K/AKT信號(hào)通路，PI3K/AKT信號(hào)通路是目前研究PCOS的重點(diǎn)通路，在最新研究中，有研究者造模PCOS胰島素抵抗大鼠，后予以黃連素喂養(yǎng)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)黃連素能有效降低大鼠模型系統(tǒng)中的PCOS胰島素抵抗值，這一結(jié)果的產(chǎn)生則與400mg/kg的黃連素治療能對(duì)PI3K/AKT信號(hào)通路起激活作用密切相關(guān)[10]。而對(duì)于該通路和子宮內(nèi)膜之間的聯(lián)系，也有研究者利用PI3K/AKT活性通路的特異性抑制劑作用于Ishikawa細(xì)胞，來研究其對(duì)細(xì)胞中AKT和SGK1激酶活性的影響，Ishikawa細(xì)胞是一種特征清晰的子宮內(nèi)膜細(xì)胞系，代表接受性子宮內(nèi)膜，結(jié)果發(fā)現(xiàn)PI3K/AKT活性通路的特異性抑制劑能夠針對(duì)性治療子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞病變[11]。LAMB3名為層粘連蛋白β3亞單位，是編碼LM-332的3個(gè)亞單位之一，當(dāng)前對(duì)于該基因的研究是發(fā)現(xiàn)該基因的表達(dá)與某些類型的癌癥的擴(kuò)散和轉(zhuǎn)移能力有關(guān)，例如胰腺癌，有研究者發(fā)現(xiàn)LAMB3在胰腺癌患者體內(nèi)過表達(dá)，而通過抑制LAMB3可以消除PI3K/AKT信號(hào)通路激活的致瘤結(jié)果，包括細(xì)胞體外增殖、侵襲和遷移以及體內(nèi)腫瘤生長等[12]。

CCND2屬于CCNDs家族，該家族由MOTOKURA等在對(duì)于甲狀腺癌的研究中被首次分離出來，共存在CCND1、CCND2和CCND3 3個(gè)亞型。目前，對(duì)于該基因的婦科研究重點(diǎn)在于卵巢癌方面，Chang等[13]通過實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)長鏈非編碼RNA HOTAIR在卵巢癌組織和細(xì)胞系中的表達(dá)顯著高于對(duì)照組，同時(shí)負(fù)向調(diào)節(jié)miR-206表達(dá)，而CCND1和CCND2作為miR-206的下游目標(biāo)，與HOTAIR形成了正向調(diào)控關(guān)系，并通過功能分析，表明在卵巢癌中同時(shí)過度表達(dá)CCND1或CCND2，可以挽救miR-206的抗癌作用，從而有效卵巢癌細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移。CCND2作為促卵泡生成素(follicle-stimulating hormone,FSH)的下游因子之一，主要在卵巢顆粒細(xì)胞中進(jìn)行表達(dá)，并且在卵泡的發(fā)育過程中促進(jìn)顆粒細(xì)胞增殖[14]。作為卵巢重要組成部分之一的顆粒細(xì)胞，在卵泡發(fā)育成熟及排卵的一系列過稱中起著極其重要的作用，并且顆粒細(xì)胞功能的異常也是引起PCOS的主要病理生理基礎(chǔ)[15]。另有研究發(fā)現(xiàn)，CCND2作為LAMB3通路下游基因之一，在肝細(xì)胞癌上的治療上，對(duì)于獼猴桃根提取物(ERAC)的響應(yīng)相同[16]。由此推測在修復(fù)PCOS子宮內(nèi)膜損傷方面，可以通過抑制LAMB3基因在PI3K/AKT信號(hào)通路發(fā)揮作用防止癌變的同時(shí)，也會(huì)抑制下游基因CCND2的過表達(dá)，使其可以有效治療PCOS患者卵巢形態(tài)變化，恢復(fù)正常排卵功能，從而改善雌激素分泌情況，修復(fù)子宮內(nèi)膜損傷。

PLCB4作為一種磷脂酶位于人20號(hào)染色體p12區(qū)域，磷脂酶C(phospholipase C, PLC)是一種膜相關(guān)酶，調(diào)節(jié)細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)、生長、轉(zhuǎn)化和分化等多種行為。PLC參與腫瘤的遷移、侵襲和耐藥[17]。Li等[18]為了探討脂質(zhì)分解代謝相關(guān)基因在胃腸道間質(zhì)瘤中的意義，鑒定了與腫瘤進(jìn)展相關(guān)的復(fù)制和差異上調(diào)的PLCB4基因，結(jié)果證明與正常組織比較，不同風(fēng)險(xiǎn)水平的腫瘤中PLCB4 mRNA豐度均顯著增加，且與免疫表達(dá)水平密切相關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn)PLCB4除了參與癌癥細(xì)胞通路外，還參與調(diào)控促性腺激素信號(hào)通路以及炎性反應(yīng)的信號(hào)通路，推斷該基因表達(dá)的下調(diào)，可能與PCOS患者子宮內(nèi)膜存在慢性炎癥病理反應(yīng)相關(guān)。

綜上所述，本研究通過生物學(xué)信息技術(shù)，從基因?qū)用鎸?duì)PCOS子宮內(nèi)膜差異基因進(jìn)行了深入分析，獲得了可信的基因數(shù)據(jù)。挑選出來的6個(gè)關(guān)鍵基因CACNA1C、LAMB3、CCND2、PLCB4、IL7、NTF3由于參與多條PCOS生殖內(nèi)分泌相關(guān)信號(hào)通路，且具有重要的代謝調(diào)節(jié)作用，可以為臨床上延緩PCOS子宮內(nèi)膜損傷甚至病變發(fā)展進(jìn)程提供新的基因靶向治療參考。