TP患者治療前后胸腔積液中巨噬細胞及炎性細胞因子的改變

孫 峰 王海月 燕存子

結(jié)核性胸膜炎(tuberculous pleurisy, TP)是免疫相關(guān)的感染性疾病，是胸腔積液主要病因之一，近年來發(fā)生率呈逐年增加趨勢，嚴重危害社會健康[1]。多數(shù)研究者認為,發(fā)病初期胸腔積液的產(chǎn)生與結(jié)核分枝桿菌(mycobacterium tuberculosis, MTB)直接感染胸膜有關(guān)，而后期與Ⅳ型變態(tài)反應有關(guān)[2]。巨噬細胞是結(jié)核性胸腔積液中主要的細胞成分之一，成熟的巨噬細胞在不同刺激誘導下可極化為促炎型M1巨噬細胞與抑炎型M2巨噬細胞。介導病原體免疫逃逸，在某種程度上被認為導致了MTB的播散。持續(xù)感染MTB后可導致M1/M2的混合表達[3]。體外試驗發(fā)現(xiàn)，結(jié)核特異性多肽可刺激從結(jié)核性胸腔積液中分離的巨噬細胞向M1極化，產(chǎn)生高水平的促炎性細胞因子，這可能促進結(jié)核性胸腔積液的產(chǎn)生[4]?？菇Y(jié)核治療是TP的主要治療措施，殺傷MTB同時可以抑制結(jié)核性胸腔積液的產(chǎn)生，但潛在機制尚不明確。本研究通過比較抗結(jié)核治療前后TP患者胸腔積液中M1型、M2型巨噬細胞比例及相關(guān)炎性細胞因子的變化，期望從免疫學角度闡明抗結(jié)核治療在抑制胸腔積液產(chǎn)生中的作用。

對象與方法

1.研究對象：前瞻性收集2018年10月～2019年9月在筆者醫(yī)院呼吸與呼吸危重癥中心住院治療的TP患者。診斷標準[5]：①胸腔積液中蛋白定量>30g/L；②胸腔積液中白細胞計數(shù)>500×106/L；③胸腔積液中腺苷脫氨酶(adenosine deaminase, ADA)≥40U/L；④外周血γ干擾素釋放試驗(IGRA)陽性；⑤胸腔積液中MTB培養(yǎng)陽性或抗酸桿菌染色陽性；⑥胸膜活檢見干酪性肉芽腫；⑦除外結(jié)締組織病、肺炎、腫瘤等其他疾病。同時符合①、②、③、④、⑦條或者符合⑤和⑥任意1條標準可入組。排除標準：①合并其他感染者；②入院后未取得胸腔積液者；③不能耐受抗結(jié)核治療者；④拒絕參加本研究的患者。本研究通過新疆醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院醫(yī)學倫理學委員會批準(審批號：20180913-08)，全部受試者均簽署知情同意書。

2.研究方法：所有受試者均在抗結(jié)核治療前行胸膜腔穿刺留取胸腔積液20ml置于枸櫞酸鈉抗凝管中。予以標準抗結(jié)核治療方案：利福平0.45g/d，異煙肼0.3g/d，吡嗪酰胺1.5g/d，乙胺丁醇0.75g/d，以上藥物均由沈陽紅球制藥有限公司生產(chǎn)。利福平、異煙肼及乙胺丁醇清晨空腹頓服，吡嗪酰胺分3次于三餐后30min服用。若治療過程中出現(xiàn)不可耐受不良反應，需要調(diào)整抗結(jié)核治療方案者，剔除本研究。抗結(jié)核治療5 天后再次行胸膜腔穿刺留取胸腔積液20ml。

3.標本處理：所有受試者胸腔積液20ml離心(1500r/min，4℃，5min)，取上清液置于-80℃冰箱凍存用于ADA、IL-10與IL-12檢測。下層沉淀中再加入15ml 0.9%NaCl溶液混勻，加入裝有15ml Ficoll-Paque淋巴細胞分離液(美國GE healthcare公司)的離心管中離心(2500r/min，25min)。小心抽取中間層的單核細胞，用0.9%NaCl溶液混勻并洗滌兩遍，即得到胸腔積液單核細胞(plural effusion mononuclear cell，PEMC)，用于檢測M1、M2型巨噬細胞比例。

4.胸腔積液中M1與M2型比例的測定：將分離的PEMC用抗人CD14-FITC、CD86-PE/cy7、CD163-PE(美國Biolegend公司)標記，用FC500流式細胞儀(美國Beckman Coulter公司)檢測這些分子的表達，CD14+CD86+為M1型巨噬細胞，CD14+CD163+為M2型巨噬細胞，表達水平用陽性細胞比例表示。

5.胸腔積液中炎性細胞因子檢測：將凍存標本解凍后，采用酶聯(lián)免疫吸附法(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)測定ADA、IL-10、IL-12的含量。試劑盒購自武漢華美生物工程有限公司，按照操作說明書進行檢測。

結(jié) 果

1.一般資料：共納入TP患者132例，抗結(jié)核治療5天后7例患者胸腔積液減少，不能留取胸腔積液，剔除本研究。最終入組TP的患者125例，其中男性67例，女性58例，患者中位年齡為47.0±29.5歲。

2.FCM檢測胸腔積液PFMC中M1、M2型巨噬細胞的表達情況：TP患者治療前PFMC中M1型(CD14+CD86+)巨噬細胞較M2型(CD14+CD163+)巨噬細胞表達更高(P<0.05)?？菇Y(jié)核治療5天后，PFMC中M1、M2型巨噬細胞均較前增多，M1型巨噬細胞略有上升(P<0.05)，而M2型巨噬細胞顯著上升(P=0.000)，M2與M1型巨噬細胞比值M2/M1在抗結(jié)核治療后明顯上升(P=0.000)，詳見表1、圖1。

圖1 流式細胞術(shù)檢測抗結(jié)核治療前后TP患者胸腔積液中M1型(CD14+CD86+)、M2型(CD14+CD163+)巨噬細胞的比例

表1 TP患者胸腔積液中M1、M2型巨噬細胞表達在抗結(jié)核治療前后的比較

3.抗結(jié)核治療前后TP患者胸腔積液中炎性細胞因子的比較：ELISA檢測TP患者胸腔積液中IL-10、IL-12、ADA的水平與TP患者治療前比較，胸腔積液中IL-10、IL-12濃度均較前下降(P<0.05)，但ADA較治療前無明顯變化(P>0.05)，詳見表2。

表2 胸腔積液中炎性細胞因子在抗結(jié)核治療前后的比較

4.M1、M2型巨噬細胞與炎性細胞因子相關(guān)性分析：治療前，胸腔積液中M1型巨噬細胞與IL-12呈正相關(guān)(r=0.463，P=0.000)；治療后M1型巨噬細胞與IL-12無明顯相關(guān)(P>0.05)。治療前后，M2型巨噬細胞與IL-10均無明顯相關(guān)(P>0.05)，詳見表3。

表3 胸腔積液中M1、M2型巨噬細胞與各項檢測指標的相關(guān)性

討 論

胸腔積液是TP最主要的臨床表現(xiàn)，中量以上胸腔積液可引起呼吸困難、胸痛等臨床癥狀，若病情遷延惡化，還可引起膿胸、支氣管胸膜瘺、敗血癥等嚴重并發(fā)癥，威脅患者生命安全，嚴重影響患者的生活質(zhì)量及預后[6]。因此在抗結(jié)核治療中，抑制胸腔積液的產(chǎn)生至關(guān)重要。目前認為結(jié)核性胸腔積液并非單純由于胸膜感染結(jié)核桿菌引起，結(jié)核桿菌特異性蛋白誘導的Ⅳ型變態(tài)反應對胸腔積液的產(chǎn)生起了重要作用?？菇Y(jié)核治療除了殺滅結(jié)核桿菌外，是否能影響TP患者的機體免疫功能，目前尚不明確。

巨噬細胞是機體重要的免疫細胞，具有抗原遞呈、吞噬及分泌多種細胞因子等功能，巨噬細胞有兩種極化方式，即經(jīng)典活化的M1型和選擇活動的M2型[7]。巨噬細胞作為結(jié)核感染的第一道防線，結(jié)核分支桿菌可促進巨噬細胞本身抗原遞呈功能的上調(diào)和T細胞的激活，而激活的T細胞能夠分泌IFN-γ、TNF-α等促炎性細胞因子進一步誘導巨噬細胞的活化[8，9]。成熟活化的巨噬細胞可極化為M1、M2型兩種形式，前者主要促進炎性反應，分泌多種促炎性細胞因子，如IL-1、IL-12、TNF-α等，CD86高表達；而M2型巨噬細胞主要抑制炎性反應，合成及分泌抗炎性細胞因子IL-10、TNF-β等以促進組織修復與重塑，CD163、CD206高表達[10]。本研究比較抗結(jié)核治療前后TP患者胸腔積液中M1型(CD14+CD86+)、M2型(CD14+CD163+)巨噬細胞比例，探討抗結(jié)核治療對TP患者胸腔積液中巨噬細胞極化方向的影響，闡述抗結(jié)核治療在抑制胸腔積液產(chǎn)生中的免疫調(diào)節(jié)作用。

本研究結(jié)果顯示抗結(jié)核治療前，胸腔積液中巨噬細胞M1型(CD14+CD86+)表達更高，且與IL-12呈正相關(guān)。說明結(jié)核性胸腔積液中巨噬細胞向M1型極化，分泌更多的IL-12。這與申東梅等[4]研究結(jié)果相似，結(jié)核特異性蛋白在體外可刺激巨噬細胞表達更多的CD86,更傾向于向M1型極化。M1型巨噬細胞的殺菌系統(tǒng)被激活，可增強殺滅胞內(nèi)寄生的MTB的能力，分泌IL-12、TNF-α等促炎性細胞因子及趨化因子，從而導致胸腔積液中IL-12濃度增高。IL-12可以促進NK細胞、LAK細胞的殺傷作用，可促進CD4+T淋巴細胞向Th1分化，分泌大量IFN-γ，招募大量T細胞和單核-吞噬細胞，形成肉芽腫，局限病灶范圍[11]。IL-12還可以協(xié)同TGF-β1促進Treg細胞的分化，通過Treg細胞對T細胞進行雙向調(diào)節(jié)[12]。另一方面，M1型巨噬細胞具有更強的抗原遞呈功能，可誘發(fā)胸膜的變態(tài)反應，促進胸腔積液的形成[13]。

抗結(jié)核治療后，M1、M2型巨噬細胞比例均增高，且M2型增高更明顯，M2/M1比例較治療前明顯增高。說明抗結(jié)核治療雖然可降低體內(nèi)MTB菌量負荷，但不會因此而降低機體免疫反應。動物研究證實異煙肼可抑制巨噬細胞釋放TNF-α,這可能是由于抗結(jié)核治療藥物促使巨噬細胞從M1型向M2型轉(zhuǎn)化，M2型巨噬細胞可分泌大量抑炎性細胞因子，使炎性反應趨于平衡，有助于組織修復、重塑[14]。TP后期結(jié)核桿菌特異性蛋白導致胸膜發(fā)生遲發(fā)型超敏反應，加速胸腔積液形成，M2型巨噬細胞的增高可抑制胸膜的免疫反應，從而減少胸腔積液的形成。抗結(jié)核治療前后巨噬細胞極化方向的變化，揭示了抗結(jié)核治療有可能通過影響巨噬細胞的免疫功能抑制胸腔積液的產(chǎn)生。

在MTB感染從急性向慢性轉(zhuǎn)變的過程中，促炎性細胞因子和抗炎性細胞因子之間被認為存在一個轉(zhuǎn)換的“開關(guān)”。二者之間的平衡作為一種保護機制可以起到阻止過度炎性反應的作用[15]。本研究發(fā)現(xiàn)，胸腔積液M2細胞與IL-10無明顯相關(guān)性，提示胸腔積液中的IL-10可能并非來源于M2型巨噬細胞。據(jù)相關(guān)文獻報道，Treg細胞也是IL-10的主要來源之一。Treg細胞是CD4+T淋巴細胞分化而來，對機體的免疫系統(tǒng)穩(wěn)態(tài)發(fā)揮重要作用，可與CD86+的巨噬細胞相互作用，通過分泌IL-10等抑制性細胞因子來抑制免疫反應[16]。結(jié)核性胸腔積液中的IL-10可能與Trag細胞活性增高有關(guān)，抗結(jié)核治療藥物對Treg細胞有調(diào)節(jié)作用[17，18]。

腺苷脫氫酶(ADA)是一種腺苷分解酶，在淋巴細胞中活性最高，T淋巴細胞中活性是B淋巴細胞中的10～20倍。胸腔積液中ADA含量增高可用來診斷TP，反映T淋巴細胞的活性[19]。本研究結(jié)果顯示治療前后ADA無明顯變化，推測抗結(jié)核治療主要影響巨噬細胞的功能，而對淋巴細胞沒有明顯的影響。

綜上所述，在TP中巨噬細胞向M1型極化，分泌大量IL-12，參與胸腔積液產(chǎn)生，抗結(jié)核治療可使向M2型轉(zhuǎn)化。因此抗結(jié)核治療在清除MTB以外，還發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用，有可能通過影響巨噬細胞的免疫功能抑制胸腔積液的產(chǎn)生。巨噬細胞極化對直接抑制胸腔積液產(chǎn)生的作用機制還需進一步探討。