多巴胺基多重相互作用協(xié)同構(gòu)筑抗污-殺菌雙重功能涂層

王昱芃，趙 洋，李茉涵，史素青，宮永寬

（西北大學(xué)化學(xué)與材料科學(xué)學(xué)院,合成與天然功能分子教育部重點實驗室,西安710102）

生物材料相關(guān)的細菌感染是臨床上亟待解決的難題之一［1，2］.研究發(fā)現(xiàn)，造成這類感染的根源是致病菌在材料表面吸附、增殖并形成細菌生物被膜，導(dǎo)致致病菌對抗生素不敏感，產(chǎn)生耐藥性，給病人帶來二次手術(shù)和巨大經(jīng)濟負擔(dān)［3～5］.因此，對材料表面進行化學(xué)修飾，引入具有抗細菌黏附和/或殺菌功能的物質(zhì)（如聚乙二醇、兩性離子、季銨鹽、殼聚糖和納米銀等），已經(jīng)成為抑制細菌生物膜形成，預(yù)防生物材料相關(guān)感染的重要途徑之一.

根據(jù)引入的抗菌基團類型，生物材料可分為抗細菌黏附型［6～13］、殺菌型［6～8，14～17］及抗細菌黏附-殺菌雙重功能表面［6～8，18～25］，其中抗細菌黏附-殺菌雙重功能表面因兼具主動和被動雙重抗菌功能而在抗菌表面制備領(lǐng)域備受關(guān)注.多巴胺（DA）仿生黏附是一種便捷高效的普適性表面修飾策略，可通過構(gòu)筑聚多巴胺（PDA）介導(dǎo)層［23～25］及合成含DA基團的功能性聚合物［26～29］等方式在材料表面同時引入抗生物污染和殺菌功能的物質(zhì)，賦予材料表面抗生物污染和殺菌雙重功能，有效抑制生物被膜形成.Xin等［25］利用DA的萬能黏附特性，在聚對苯二甲酸乙二醇酯（PET）表面預(yù)沉積一層PDA涂層，然后依次通過點擊反應(yīng)和氧化還原反應(yīng)，在涂層表面引入兩性離子基團和納米銀，賦予涂層表面抗生物污染和殺菌雙重功能.Yang等［28］設(shè)計合成了一種側(cè)鏈含鄰苯二酚、季銨鹽和聚乙二醇的聚碳酸酯類共聚物，采用一步沉積法獲得兼具抗生物污染和殺菌功能的聚合物涂層.上述方法大多存在功能性聚合物制備過程復(fù)雜及涂層制備工藝工序相對繁瑣等問題，因此，開發(fā)一種簡單、高效且適于大規(guī)模生產(chǎn)的雙重抗菌涂層的制備方法逐漸成為抗菌領(lǐng)域研究的熱點之一.

受DA氧化-聚合機理［30，31］啟發(fā)，本文結(jié)合兩性離子的抗生物污染特性和羧甲基殼聚糖（CMC）的殺菌活性，以DA為多重相互作用模型分子，將側(cè)基含伯氨基的磷酰膽堿基聚合物（PMA）和CMC與DA一步共沉積，制備了抗生物污染-殺菌雙重抗菌涂層（CMC-PMA-PDA@PP），研究了CMC和PMA在調(diào)控DA氧化-聚合及抗菌涂層均一性和穩(wěn)定性方面的貢獻.

1 實驗部分

1.1 試劑與儀器

CMC購于西安優(yōu)博生物科技有限公司；DA和2-氨基乙基甲基丙烯酸酯鹽酸鹽（AEMA）購于北京百靈威科技有限公司；2-甲基丙烯酰氧乙基磷酰膽堿（MPC）購于南京樂天然科技開發(fā)研究所；1-（3-二甲氨基丙基）-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽（EDC）、N-羥基琥珀酰亞胺（NHS）和Syto 9綠色熒光核酸染料購于美國Thermo Scientific公司；聚丙烯（PP）購于浙江宏泰塑料廠，裁成20 mm×20 mm大小，依次用清潔劑、丙酮和乙醇超聲清洗30 min，氮氣吹干后備用；金黃色葡萄球菌（S.aureus）由西京醫(yī)院提供；碘化丙啶（純度≥95%）購于上海翊圣生物科技有限公司.

K-Alpha型X射線光電子能譜儀（XPS），美國Thermo Electron公司；Multi Mode 8型原子力顯微鏡（AFM），美國Bruker公司；DSA25型靜態(tài)接觸角測試儀，德國Kruss公司；M-2000V型變角度光譜橢偏儀，美國J.A.Woollam公司；Ti-U型倒置熒光顯微鏡，日本Nikon公司.

1.2 CMC-PMA-PDA雙功能仿生涂層的構(gòu)筑

參考文獻［13］方法合成PMA（圖S1，見本文支持信息），以過硫酸鉀為引發(fā)劑、AEMA和MPC（摩爾比為2∶8）為單體、去離子水為溶劑，經(jīng)透析純化、冷凍干燥后備用，Mw為1.6×104，Mw/Mn=2.2.

以PDA-PMA共沉積涂層表面潤濕性、元素組成和表面形貌為考察指標，對DA和PMA質(zhì)量比進行優(yōu)化（圖S2，見本文支持信息）.在DA和PMA質(zhì)量比優(yōu)化的基礎(chǔ)上，將0.025 g CMC，0.05 g EDC和0.03 g NHS依次溶解在50 mL磷酸鹽（PBS，pH=5.0）緩沖溶液中，然后加入0.10 g DA和0.10 g PMA，室溫反應(yīng)9 h，反應(yīng)過程中用0.1 mol/L HCl溶液維持pH值在5.0左右；反應(yīng)結(jié)束后用0.1 mol/L NaOH調(diào)節(jié)溶液pH值至8.5；將PP片基浸入其中，在攪拌條件下于室溫反應(yīng)24 h，然后用大量超純水淋洗，經(jīng)N2氣吹干后即得仿生涂層CMA-PMA-PDA@PP（見Scheme 1）.

Scheme 1 Illustration of the fabrication of dual functional coating based on multiple interaction

采用相同方法，將CMC或PMA與DA以質(zhì)量比1∶1制備對照涂層，分別標記為CMC-PDA@PP和PDA-PMA@PP；同時，將CMC與PMA以質(zhì)量比1∶1制備對照涂層CMC-PMA@PP，考察CMC和PMA之間的相互作用.

1.3 熒光蛋白吸附

參照文獻［32］方法，將表面改性前后的PP片基于紫外燈下滅菌30 min，在PBS緩沖液中平衡浸潤2 h后，浸入25 mL 0.1 mg/mL熒光蛋白（FITC-BSA）中，于37℃，5% CO2及飽和濕度條件下分別孵育5和48 h，用PBS溶液淋洗數(shù)次后，采用倒置熒光顯微鏡測試其表面熒光強度，根據(jù)FITC-BSA濃度與熒光強度之間的標準曲線，計算FITC-BSA在片基表面的吸附量.

1.4 CMC-PMA-PDA細菌黏附和殺菌測試

采用活-死細菌標記法［26］，用S.aureus對改性前后PP表面的細菌黏附和殺菌情況進行評價.將不同PP片基置于24孔板中，在紫外燈下滅菌30 min，在滅菌過的PBS溶液中平衡浸潤2 h后，置于新配制的細菌懸液中，于37°C、5% CO2及飽和濕度條件下分別培養(yǎng)1，3和7 d，每天更換新鮮細菌懸液；培養(yǎng)結(jié)束后，用PBS淋洗去除表面黏附不牢固的細菌，轉(zhuǎn)入新的24孔板中，在每孔樣品中心滴加20μL Syto9-PI雙染色劑，避光染色20 min后，通過倒置熒光顯微鏡觀察細菌在PP表面的黏附情況，用ImageJ中閾值分析法對黏附細菌進行定量分析.

2 結(jié)果與討論

2.1 CMC和PMA對DA沉積過程的影響

2.1.1 表面化學(xué)組成 利用XPS研究CMC和PMA對沉積涂層表面化學(xué)組成的影響，結(jié)果見表1、表2和圖1.由表1可以看出，與空白PP相比，PDA@PP表面新增N元素，該N1s主要以398.6 eV處C=N—、399.9 eV處—NH2/—NH—和401.6 eV處—NH3+氮結(jié)構(gòu)形式存在（表2和圖1），而且C1s譜中新增C=O（288.2 eV）和C—O/C—N（286.4 eV）碳結(jié)構(gòu)形式，表明在pH=8.5和氧氣存在條件下，DA分子之間通過氧化、偶聯(lián)、邁克爾加成和/或席夫堿反應(yīng)及氫鍵等多重相互作用發(fā)生了自聚合反應(yīng)，在PP表面形成PDA涂層［30］.當(dāng)在DA沉積液中引入CMC時，表面C1s含量略有增加，N1s略有下降（表1），這與共沉積涂層中引入CMC聚合物鏈有關(guān)；此外，398.6 eV處C=N—和401.6 eV處—NH3+氮結(jié)構(gòu)含量均增加，說明CMC中—NH2可通過氫鍵和席夫堿或邁克爾加成反應(yīng)等方式調(diào)控DA的沉積過程.PMA-PDA共沉積涂層表面N元素與CMC-PDA涂層相近（原子分數(shù)4.9%），不同之處在于表面新增P元素，原子分數(shù)高達1.8%，402.4 eV處N元素［—N（CH3）3+］與P元素的峰面積之比（N402.4/P）為1.02，表明共沉積過程中成功向涂層表面引入磷酰膽堿基團；與此同時，398.6 eV處C=N—峰面積增加，401.6 eV處—NH3+含量明顯降低，這可能是由于PMA聚合物鏈上的—NH2可有效驅(qū)動醌類結(jié)構(gòu)發(fā)生席夫堿或邁克爾加成反應(yīng)，減少分子間氫鍵作用的緣故［30，31］.當(dāng)PMA-DA共沉積中引入CMC時，CMC-PMA，CMCDA和PMA-DA之間的相互作用會形成競爭態(tài)勢，協(xié)同調(diào)控DA的沉積過程，使涂層表面兼具磷酰膽堿兩性離子基團和CMC抗菌聚合物鏈.

Table 1 XPS results of different PP surfaces

Table 2 Composition of different N1s species

Fig.1 High resolution spectra of C1s(A),N1s(B)and P2p(C)on different PP surfaces

Fig.2 Effect of deposition process on the surface morphology of modified PP

2.1.2 表面形貌 通過AFM研究CMC和PMA對沉積涂層表面形貌的影響（圖2）.由圖2可以看出，空白PP表面較為平整［圖2（A）］，表面粗糙度（Rq，nm）為1.12 nm；當(dāng)在其表面沉積PDA涂層后，有大量聚集體出現(xiàn)［圖2（B）］，聚集體在Z維方向上尺寸為16～60 nm，Rq增加至3.16 nm，涂層厚度高達41.5 nm，這可能是由于在弱堿性條件下，DA分子通過共價鍵和非共價鍵協(xié)同作用形成PDA納米顆粒的緣故.當(dāng)CMC（或PMA）與DA以質(zhì)量比1∶1在PP表面共沉積后，涂層表面基本上保持顆粒狀形貌，均一性較PDA@PP明顯改善，大尺寸PDA聚集體數(shù)量顯著降低［圖2（C）和（D）］，該結(jié)果表明CMC或PMA聚合物鏈上的—NH2通過與醌類結(jié)構(gòu)發(fā)生邁克爾加成和/或席夫堿反應(yīng)，抑制了DA分子間的自聚集和/或自聚合行為［30］，降低較大PDA顆粒形成的幾率，在一定程度上改善了共沉積涂層的均一性.然而，該過程會影響共沉積涂層與溶液中分子或粒子的界面相互作用（如PDA間的偶聯(lián)或氫鍵等），進而影響涂層厚度，使共沉積涂層厚度與PDA涂層相比大幅下降，為8.2～8.5 nm.當(dāng)CMC和PMA同時引入DA沉積液時，所得涂層表面均一、致密，幾乎觀測不到較大聚集體［圖2（E）］，且涂層厚度增加至17.9 nm.這可能與DA，CMC和PMA之間的共價鍵-非共價鍵多重相互作用有關(guān).為了更好地闡明三者之間的協(xié)同作用，用XPS和AFM對CMC-PMA共沉積涂層進行了表征（圖3）.從圖3可以看出，共沉積涂層形貌不均一且表面N和P元素含量較低，原子分數(shù)分別為2.0%和0.2%，說明CMC和PMA可通過鏈間微弱的相互作用（如氫鍵和靜電）在基材表面形成疏松的、不均一的聚合物網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，該網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)可為DA及其衍生物的進一步沉積提供相互作用位點，有利于增加涂層厚度；而DA及其衍生物則趨向于通過共價鍵和非共價鍵等途徑與基材界面、溶液中PMA和CMC鏈發(fā)生相互作用，驅(qū)動PMA和CMC在PP表面發(fā)生共沉積，增強共沉積涂層與基材界面及涂層各組分之間的結(jié)合力.

Fig.3 Core-level XPS spectra(A,B)and AFM images(C,D)of CMC-PMA coating

2.1.3 涂層表面潤濕穩(wěn)定性 水接觸角是表征材料表面潤濕性的重要手段，涂層表面潤濕性變化可為表面化學(xué)組成和形貌變化提供佐證.圖4為不同PP片基在體積分數(shù)為75%的乙醇水溶液中超聲（2 h）前后表面水接觸角的變化情況.從圖4可以看出，空白PP表面呈現(xiàn)固有疏水性，水接觸角為108°.與空白PP相比，PDA@PP表面水接觸角值下降至60°，說明DA分子通過氧化-聚合和邁克爾加成/席夫堿反應(yīng)在PP表面形成了PDA涂層，大量極性基團的存在有利于改善PP表面的親水性，這與文獻［25］報道的結(jié)果一致.在體積分數(shù)為75%的乙醇水溶液中超聲2 h后，PDA@PP表面接觸角與空白PP接近，這可能與機械作用力下PDA涂層發(fā)生大面積脫落有關(guān)（圖S3，見本文支持信息），表明僅通過DA氧化-自聚所得涂層各組分間及其與基材之間的結(jié)合力較弱.對于共沉積涂層，CMC-PDA@PP的接觸角數(shù)值較PMA-PDA@PP和CMC-PMA-PDA@PP略高，這可能與后者涂層表面含有與水結(jié)合能力很強的磷酰膽堿兩性離子基團有關(guān).將所有共沉積涂層在體積分數(shù)為75%的乙醇水溶液中超聲2 h后，接觸角幾乎不發(fā)生變化，耐介質(zhì)性和耐機械力作用明顯提升，說明共沉積過程中CMC和/或PMA與DA之間發(fā)生了氫鍵、席夫堿和/或邁克爾加成等多重相互作用，有助于提高涂層的穩(wěn)定性.

Fig.4 Wetting stability of the deposited PP surfaces

2.2 仿生涂層抗蛋白質(zhì)吸附性能

用熒光蛋白BSA-FITC的吸附量評價不同PP表面的抗生物污染性能（圖5），由圖5可以看出，空白PP、PDA@PP和CMC-PDA@PP表面均出現(xiàn)嚴重的蛋白質(zhì)吸附現(xiàn)象，說明親/疏水性和靜電作用均對蛋白質(zhì)吸附過程有較大影響，當(dāng)涂層表面帶電荷時，涂層表面與蛋白質(zhì)之間的靜電相互作用占主導(dǎo)地位.雖然PDA@PP和CMC-PDA@PP表面親水性有所改善（接觸角值為54°～60°），但其表面均富含—NH3+正電荷，極易與帶負電的BSAFITC蛋白發(fā)生靜電相互作用，因此，PDA@PP和CMC-PDA@PP表面的BSA-FITC吸附量均較為嚴重.在共沉積涂層中引入富含磷酰膽堿兩性離子的PMA后，所得涂層（PMA-PDA@PP和CMC-PMA-PDA@PP）表面蛋白質(zhì)吸附量減少了87%～90%，抗生物污染性能良好，這可能與磷酰膽堿兩性離子結(jié)構(gòu)（呈電中性）極易在表面形成水合層，能夠維持與其接觸的生物分子構(gòu)象有關(guān).

Fig.5 Adsorption of BSA-FITC on different PP surfaces for 5 h and 48 h(**p＜0.05)

2.3 仿生涂層抗細菌黏附-殺菌性能

Fig.6 Fluorescence microscopic images of live and dead S.aureus adhered on bare PP(A1—A3),CMC-PDA(B1—B3),PMA-PDA(C1—C3)and CMC-PDA-PMA(D1—D3)surfaces after 1 d(A1—D1),3 d(A2—D2)and 7 d(A3—D3)of contact

通過Syto 9-PI熒光核酸染料對不同PP表面黏附的細菌進行染色，用倒置熒光顯微鏡可將細胞膜完整的活細菌（綠色熒光）和細胞膜受損的死細菌（紅色熒光）快速區(qū)分開來［26］，并根據(jù)片基表面熒光顏色和強度評價其抗細菌黏附及殺菌性能.圖6和圖7分別為不同PP表面經(jīng)S.Aureus黏附1，3和7 d后倒置熒光顯微鏡照片和用ImageJ軟件對細菌黏附量定量分析的結(jié)果.從圖6（A1）～（A3）可以看出，空白PP表面呈綠色熒光，而且在S.Aureus懸液中黏附7 d后，綠色熒光覆蓋整個PP表面，說明空白PP表面極易發(fā)生細菌黏附且以活菌形式存在.與空白PP不同，紅色熒光覆蓋整個CMC-PDA@PP表面［圖6（B1）～（B3）］，說明CMC能夠直接殺滅與其接觸的細菌，賦予表面殺菌功能，殺菌率＞99%（圖7）；PMA-PDA@PP表面僅有零星綠色熒光出現(xiàn)［圖6（C1）～（C3）］，細菌黏附量比空白PP降低了96%～98%，這與磷酰膽堿兩性離子材料優(yōu)異的抗生物污染性能有關(guān).當(dāng)涂層中同時引入CMC和PMA以后，表面細菌黏附量比空白PP降低了66%～75%，而且黏附的細菌均以死細菌形式存在，殺菌率＞99%［圖6（D1）～（D3），圖7］，表明CMC-PMA-PDA@PP表面兼具抗細菌黏附-殺菌雙重功能，能夠較好地抑制細菌生物被膜形成.

Fig.7 Quantitative results of S.aureus attachment(**p≤0.05)

3 結(jié) 論

本文報道了一種一步共沉積制備抗生物污染-殺菌雙重抗菌涂層的方法，此方法利用CMC和PMA聚合物鏈中的—NH2與多巴胺衍生物發(fā)生氫鍵、邁克爾加成和/或席夫堿反應(yīng)等多重相互作用，調(diào)控DA的沉積過程，獲得均一、穩(wěn)定、兼具抗污-殺菌雙重抗菌功能的聚合物涂層，有望用于抗菌涂層的大規(guī)模制備領(lǐng)域.

支持信息：http：//www.cjcu.jlu.edu.cn/CN/10.7503/cjcu20200567.