芘與人血清白蛋白和牛血清白蛋白結(jié)合位點(diǎn)微環(huán)境極性的差異

李夢(mèng)碩，張 靜，劉 丹，朱亞先，張 勇

（1.近海海洋環(huán)境科學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(廈門大學(xué)),廈門大學(xué)環(huán)境與生態(tài)學(xué)院,廈門361000；2.河口生態(tài)安全與環(huán)境健康省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,廈門大學(xué)嘉庚學(xué)院,漳州363105；3.廈門大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院化學(xué)系,廈門361005）

多環(huán)芳烴（PAHs）具有基因毒性、遺傳毒性、發(fā)育毒性及“三致效應(yīng)”等，會(huì)對(duì)人體健康造成潛在危害［1～3］.PAHs進(jìn)入人體血液后，溶解態(tài)的PAHs被迅速代謝，而另一部分則結(jié)合血清白蛋白被運(yùn)輸至各個(gè)器官［4］.因此，研究PAHs與血清白蛋白的相互作用，對(duì)了解PAHs在人體內(nèi)的吸收、代謝和毒性機(jī)制具有重要意義.然而，目前相關(guān)研究仍大量采用牛血清白蛋白（BSA）替代人血清白蛋白（HSA）作為模式蛋白［5～9］.研究表明［10］，HSA和BSA具有24%氨基酸序列的差異，其中BSA有2個(gè)色氨酸（Trp）殘基Trp134和Trp213，而HSA只有1個(gè)色氨酸殘基Trp214.Clara等［11］和Wani等［12］的研究表明，華法令、來(lái)那替尼和它莫西芬分別與HSA和BSA相互作用的結(jié)合猝滅常數(shù)有數(shù)量級(jí)的差異.此外，本課題組［13～15］利用熒光各向異性、同步熒光法、激發(fā)發(fā)射矩陣結(jié)合平行因子法（Excitation-emission matrix spectralparallel factor，EEM-PARAFAC）和分子動(dòng)力學(xué)等方法研究了母環(huán)、烷基取代PAHs及其代謝產(chǎn)物與HSA或BSA的相互作用，發(fā)現(xiàn)HSA和BSA分別與不同甲基取代位置菲的作用存在差異.因此，進(jìn)一步明確HSA及BSA與有機(jī)小分子污染物之間相互作用機(jī)制的差異十分必要.

本文采用穩(wěn)態(tài)熒光光譜、熒光共振能量轉(zhuǎn)移技術(shù)結(jié)合分子對(duì)接法，選擇具有微環(huán)境極性探針性質(zhì)的芘（Pyr）作為污染物有機(jī)小分子，分析比較了其分別與HSA和BSA相互作用時(shí)結(jié)合口袋微環(huán)境的極性變化、作用位點(diǎn)、作用距離等，揭示了Pyr與HSA和BSA相互作用的過(guò)程和機(jī)理間存在的差異.

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 試劑與儀器

BSA（純度＞96%）、Pyr（A.R.級(jí)）和三羥甲基氨基甲烷（A.R.級(jí)）均購(gòu)于阿拉丁試劑（上海）有限公司；HSA（純度＞96%）購(gòu)自美國(guó)Sigma試劑公司；無(wú)水乙醇等其它藥品（A.R.級(jí)）購(gòu)自上海國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司.

QM 8000型熒光光譜儀（日本Horiba公司）；Agilent 8453型紫外-可見分光光度計(jì)（美國(guó)Agilent公司）；Five Easy Plus型臺(tái)式pH計(jì)（美國(guó)Mettler Toledo公司）.

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 熒光光譜和紫外吸收光譜測(cè)定 將0.05 mol/L Tris-HCl緩沖溶液、1×10-6mol/L HSA和BSA及不同濃度的Pyr依次分別加入2組10 mL棕色比色管中，搖勻后靜置30 min，待體系達(dá)到平衡后分別進(jìn)行UV-Vis吸收光譜和熒光光譜測(cè)定.熒光光譜儀參數(shù)設(shè)定：激發(fā)和發(fā)射狹縫分別是3 nm和2 nm，延遲時(shí)間為0.05 s，步長(zhǎng)為1 nm.分別測(cè)定激發(fā)波長(zhǎng)為280 nm和295 nm時(shí)，Pyr-HSA和Pyr-BSA體系在300～450 nm范圍內(nèi)的發(fā)射光譜.

1.2.2 分子對(duì)接模擬 利用Auto Dock 4.2.1和Auto Dock Tools軟件對(duì)Pyr與HSA和BSA分別進(jìn)行分子對(duì)接，對(duì)接過(guò)程、參數(shù)均參考文獻(xiàn)［16］方法.利用Pymol軟件進(jìn)行可視化研究，并計(jì)算最優(yōu)構(gòu)型結(jié)合口袋的Pyr周圍0.4 nm范圍內(nèi)氨基酸的極性及其與色氨酸殘基表觀距離.

2 結(jié)果與討論

2.1 Pyr與HSA和BSA結(jié)合位點(diǎn)疏水性的差異

研究［17～19］表明，PAHs與HSA和BSA的作用位點(diǎn)主要在ⅡA，ⅢA和IB子域，而不同結(jié)合位點(diǎn)微環(huán)境疏水性的對(duì)比研究鮮見報(bào)道.本文利用Pyr的373 nm/384 nm（I1/I3）微極性探針性質(zhì)［20，21］，考察了Pyr與HSA和BSA結(jié)合口袋微環(huán)境的極性差異.血清白蛋白因含有色氨酸（Trp）、酪氨酸（Tyr）和苯丙氨酸（Phe），在270～300 nm光激發(fā)下可發(fā)射較強(qiáng)的內(nèi)源熒光.當(dāng)激發(fā)波長(zhǎng)為295 nm時(shí)，HSA中332 nm處的最大發(fā)射波長(zhǎng)由Trp214貢獻(xiàn)；而BSA中341 nm處的最大發(fā)射波長(zhǎng)由Trp134和Trp213貢獻(xiàn).熒光光譜測(cè)定結(jié)果如圖1所示，Pyr-HSA和Pyr-BSA體系中HSA和BSA的色氨酸殘基熒光產(chǎn)生猝滅，表明Pyr與HSA和BSA的結(jié)合位點(diǎn)均靠近色氨酸殘基.在Pyr-HSA體系中，結(jié)合態(tài)Pyr的I1/I3值隨Pyr濃度的增加輕微下降（圖2），說(shuō)明其與HSA中的Trp214逐漸靠近.在Tris-HCl緩沖溶液中溶解態(tài)Pyr的I1/I3值為1.85，而與HSA和BSA相互作用后結(jié)合態(tài)Pyr的I1/I3值分別為1.36和0.92，可見結(jié)合態(tài)Pyr的I1/I3值均降低，且在BSA及HSA中結(jié)合位點(diǎn)微環(huán)境的極性具有差異.

Fig.1 Fluorescence spectra of HSA and BSA in the presence and absence of Pyr

Fig.2 Trend in the I1/I3 ratio as a function of increasing Pyr concentration(λex=295 nm)

2.2 Pyr與HSA和BSA結(jié)合平衡常數(shù)的差異

研究［22，23］表明，Pyr與HSA和BSA的結(jié)合作用力以疏水作用為主，利用熒光猝滅法測(cè)定了Pyr-HSA和Pyr-BSA的猝滅常數(shù)（Ksv）、猝滅速率常數(shù)（Kq）和結(jié)合常數(shù)（Kb）.如圖3所示，隨著Pyr濃度的增加，BSA在340 nm的熒光發(fā)射峰強(qiáng)度逐漸降低，HSA在334 nm的熒光發(fā)射峰強(qiáng)度逐漸降低，表明HSA和BSA均與Pyr發(fā)生相互作用導(dǎo)致其內(nèi)源熒光發(fā)生猝滅［24］.利用Stern-Volmer方程［25］計(jì)算了Pyr對(duì)HSA和BSA的猝滅常數(shù)（Ksv）和猝滅速率常數(shù)（Kq）（圖4），結(jié)果列于表1.可見，Pyr-HSA和Pyr-BSA體系的Kq均大于生物大分子在溶液中的最大動(dòng)態(tài)猝滅常數(shù)1010mol-1·s-1，說(shuō)明上述體系均以靜態(tài)猝滅為主.作用體系的Kb值從Pyr-HSA的1.86×107L/mol降低到Pyr-BSA的1.71×105L/mol.

Fig.3 Fluorescence quenching spectra of HSA(A)and BSA(B)by Pyr at 298 K

Fig.4 Stern-Volmer(A)and double logarithmic(B)plots for the fluorescence quenching of HSA and BSA by Pyr

Table 1 Binding constants and number of binding sites of the Pyr-HSA/BSA systems(λex=280 nm)

2.3 Pyr與HSA和BSA作用距離的差異

為進(jìn)一步明確Pyr與HSA和BSA結(jié)合位點(diǎn)是否存在差異，需明確結(jié)合在HSA和BSA中的Pyr與色氨酸殘基的作用距離.能量轉(zhuǎn)移效率（E）和結(jié)合距離（rDA）可用于探討Pyr與HSA和BSA作用距離的差異.如圖5所示，受體Pyr滿足同供體HSA和BSA中色氨酸殘基發(fā)生能量轉(zhuǎn)移的要求.根據(jù)F?rst’s非輻射能量轉(zhuǎn)移理論［26，27］，采用FelixGX 4.1.2軟件計(jì)算了Pyr分別與HSA和BSA之間的E和rDA.結(jié)果顯示，體系中結(jié)合態(tài)Pyr與HSA和BSA中色氨酸殘基的表觀距離（R0）分別為2.37和2.34 nm，與文獻(xiàn)［22，23］報(bào)道結(jié)果在同一數(shù)量級(jí).如表2所示，當(dāng)體系中Pyr與HSA和BSA的濃度比為1∶1時(shí)，Pyr與HSA的E值略高于BSA.與上文Pyr-HSA和Pyr-BSA體系的Kq值相比可知，結(jié)合態(tài)Pyr與HSA和BSA中色氨酸殘基的E值與其相應(yīng)的結(jié)合平衡常數(shù)呈正相關(guān).此外，HSA和BSA中色氨酸殘基的個(gè)數(shù)及所在子域均不同，表明Pyr與HSA和BSA的作用位點(diǎn)可能在不同子域.

Fig.5 Absorption spectrum of Pyr(a)and normalized emission spectra of HSA(b)and BSA(c)to demonstrate the extent of overlap between donor and acceptor

Table 2 Calculated F?rster radius(R0)between the donor and the acceptor(λex=295 nm)

2.4 Pyr與HSA和BSA結(jié)合位點(diǎn)的差異

為在分子層面獲得Pyr與HSA和BSA在結(jié)合過(guò)程中的作用位點(diǎn)及周圍氨基酸殘基極性的詳細(xì)信息，采用Auto Dock4.2.1軟件計(jì)算了Pyr在HSA和BSA中的最佳結(jié)合位點(diǎn).取Pyr與HSA和BSA對(duì)接能量最低的3種構(gòu)型，Pyr在HSA中位于ⅡA，ⅢA和IB子域結(jié)合位點(diǎn)的結(jié)合自由能分別為-7.14，-7.04和-6.75 kJ/mol，Pyr在BSA中位于ⅡA，ⅢA和IA子域結(jié)合位點(diǎn)的結(jié)合自由能分別為-7.79，-7.77和-6.26 kJ/mol，表明Pyr分別與HSA和BSA的結(jié)合過(guò)程均為自發(fā)過(guò)程.Pyr在HSA和BSA中不同的結(jié)合位點(diǎn)分別是IB子域和IA子域，且其結(jié)合位點(diǎn)周圍氨基酸殘基的極性是影響PyrI1/I3值的主要原因之一.Pyr在HSA中IB子域結(jié)合位點(diǎn)周圍0.4 nm范圍內(nèi)的非極性氨基酸有Phe149，Phe157，Gly189和Leu154，極性氨基酸有Ser193，His146和Tyr161，離子型氨基酸有Arg186和Lys190［圖6（A）］，結(jié)合2.1節(jié)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，表明IB子域因其不完全疏水而表現(xiàn)出一定極性.

與上文結(jié)果比較可知，結(jié)合態(tài)Pyr與BSA中色氨酸殘基的平均距離與IA子域結(jié)合位點(diǎn)處的平均距離相一致，BSA中IA子域結(jié)合位點(diǎn)周圍0.4 nm范圍內(nèi)的非極性氨基酸有Ala253，Ala257，Ala260，Pro151，Leu282，Leu283和Leu14，極性氨基酸有Ser286，His18和Arg256［圖6（B）］，表明結(jié)合態(tài)Pyr在BSA中作用位點(diǎn)周圍非極性氨基酸較多，比HSA中結(jié)合位點(diǎn)周圍微環(huán)境的極性更小，該結(jié)果與2.1節(jié)結(jié)合口袋疏水性的實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致.

Fig.6 Molecular docking images of HSA(A)and BSA(B)with Pyr at different binding sites

3 結(jié) 論

采用穩(wěn)態(tài)熒光光譜、熒光共振能量轉(zhuǎn)移技術(shù)結(jié)合分子對(duì)接法，證實(shí)了微極性探針Pyr分別與HSA和BSA相互作用時(shí)，結(jié)合位點(diǎn)及其微環(huán)境極性不同、與色氨酸殘基的作用距離不同.因此，采用BSA代替HSA開展有關(guān)PAHs污染物與血清白蛋白相互作用機(jī)制研究時(shí)，應(yīng)考慮上述因素.同時(shí)，今后若能進(jìn)一步結(jié)合時(shí)間分辨熒光光譜、圓二色光譜和競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合反應(yīng)等方法深入研究相互作用時(shí)HSA和BSA的構(gòu)象及生理功能變化的異同，有望更好地從分子水平全面了解PAHs分別與HSA和BSA作用機(jī)制的差異.