基于細胞融合開發(fā)雙基因共敲除技術(shù)

于魯孟， 劉思思， 高曉冬， 藤田盛久

（江南大學 生物工程學院，江蘇 無錫 214122）

近年來，針對哺乳動物細胞基因編輯的手段越來越多，包括設(shè)計鋅指結(jié)構(gòu)（ZFs）[1]、轉(zhuǎn)錄激活因子樣效應(yīng)物（TALEs）[2]、CRISPR/Cas9 技術(shù)[3-4]，這些技術(shù)都可以特異性的敲除基因。 尤其是CRISPR/Cas9技術(shù)通過目標導向RNA 介導Cas9 蛋白造成DNA雙鏈斷裂[5]，可以更精準的進行基因編輯，有效地縮短了基因編輯的周期和成本， 獲得了廣泛的運用。然而這些編輯手段都只能特異性編輯一個基因，目前有效編輯幾個基因還有一定局限性。 已有相關(guān)文獻報道[6-8]，可以借助CRISPR/Cas9 技術(shù)和含多個目標導向RNA 的單個慢病毒質(zhì)粒實現(xiàn)易轉(zhuǎn)染細胞的多基因共敲除， 但是基因敲除效率取決于細胞類型。 因此仍需探索一種高效穩(wěn)定的動物細胞多基因共敲除方法。

眾所周知， 在釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）的生命周期中，單倍體酵母細胞通過配對產(chǎn)生二倍體酵母細胞。 當營養(yǎng)缺乏時，二倍體酵母細胞形成孢子，從而再次產(chǎn)生酵母單倍體細胞[9]。在有絲分裂過程中，酵母細胞染色體發(fā)生重組并平均分配到兩個子細胞中[10]。 若已敲除兩個不同基因的兩個單倍體酵母細胞經(jīng)過配對和孢子形成，可以產(chǎn)生基因雙敲除的酵母細胞[11]。 在哺乳動物細胞中相同或不同類型細胞可以融合并導致同核或異核形成，且親本核保持離散并包含在由共享細胞質(zhì)支持的單個細胞體中[12-14]。 不同種細胞間可以通過融合產(chǎn)生雜種細胞，獲得多種目標表現(xiàn)型。 比如，將胚胎干細胞分別與神經(jīng)干細胞、成纖維細胞或胸腺細胞融合的實驗表明，通過細胞融合可以促進細胞向多能干細胞轉(zhuǎn)化[15-16]。 通過細胞融合也可利用現(xiàn)有細胞直接獲得新型細胞，而不必進行復雜漫長的基因編輯工作。 人類胚胎腎細胞 （Human Embryonic Kidney 293 cells，HEK 293），是一種特定的細胞系，最初來源于在組織培養(yǎng)中生長的人類胚胎腎細胞[17]。 HEK 293 細胞易于生長且表現(xiàn)出較高的轉(zhuǎn)染效率。 HEK 293 細胞的基因組學、轉(zhuǎn)錄組學及蛋白質(zhì)組學數(shù)據(jù)現(xiàn)已基本完整[18]，因此以HEK 293 細胞為模型進行科學探索更具優(yōu)勢。

結(jié)合哺乳動物細胞基因編輯技術(shù)和細胞融合技術(shù)，以HEK 293 細胞株為模型建立了一種雙基因共敲除技術(shù)。 為了便于鑒定細胞基因型，分別構(gòu)建了 PIGA 敲除細胞株、PIGK 敲除細胞株、FUT8 敲除細胞株以及ST6GAL1 敲除細胞株。 PIGA 和PIGK均為糖基磷脂酰肌醇（glycosylphosphatidylinositol，GPI）生物合成的必須基因[19-20]，可根據(jù)細胞表面GPI錨定蛋白表達情況鑒定基因敲除與否。 巖藻糖轉(zhuǎn)移酶 8 是糖鏈結(jié)合核心巖藻糖的主要酶[21]；α-2，6-唾液酸轉(zhuǎn)移酶1 是糖鏈結(jié)合α-2，6 連接的唾液酸的必須酶[22-23]，可根據(jù)細胞表面糖鏈結(jié)構(gòu)判定基因敲除與否。由于現(xiàn)階段沒有以HEK 293 細胞為模型研究細胞融合條件的可供參考的數(shù)據(jù)， 故以PIGA 敲除細胞株和PIGK 敲除細胞株為模型優(yōu)化細胞融合的條件。 依據(jù)優(yōu)化后的細胞融合條件并結(jié)合CRISPR/Cas9 技術(shù)構(gòu)建了 FUT8 和 ST6GAL1 雙敲除細胞株。 本研究構(gòu)建的動物細胞基因敲除技術(shù)可有效縮短構(gòu)建雙基因敲除細胞的時間。

1 材料與方法

1.1 細胞培養(yǎng)

大腸桿菌培養(yǎng)基：Amp 培養(yǎng)基： 胰蛋白胨，1.6 g/dL 酵母提取物質(zhì)量分數(shù)1.5%，NaCl 質(zhì)量分數(shù)0.5%。 滅菌后添加氨芐青霉素（Amp）使其終質(zhì)量濃度為100 mg/mL。

SOB 培養(yǎng)基：胰蛋白胨2 g/dL，質(zhì)量分數(shù)0.5%，酵母提取物質(zhì)量分數(shù)0.5%，NaCl 質(zhì)量分數(shù)0.5%，KCl 2 g/dL，MgCl210 mmol/L。

SOC 培養(yǎng)基：1 L SOB 中添加 10 mL 2 mol/L 葡萄糖溶液。

細胞培養(yǎng)基：

FBS 培 養(yǎng) 基 ：500 mL DMEM 溶 液 （Gibco，Life technologies）中加入55 mL 胎牛血清。

Hyg 培養(yǎng)基： 向 550 mL 質(zhì)量分數(shù) 10% FBS 培養(yǎng)基中加入2.2 mL 100 mg/mL 的潮霉素溶液。

BSD 培養(yǎng)基：向 550 mL 質(zhì)量分數(shù) 10% FBS 培養(yǎng)基中加入0.55 mL 100 mg/mL 的殺稻瘟菌素溶液。

Puro 培養(yǎng)基：向 550 mL 質(zhì)量分數(shù) 10% FBS 培養(yǎng)基中加入55 μL 100 mg/mL 的嘌呤霉素溶液。

人體胚胎腎細胞HEK 293 和HEK 293 T 細胞株培養(yǎng)條件均為37 ℃，CO2體積分數(shù)5%。

1.2 質(zhì)粒構(gòu)建

構(gòu)建 pME-Hyg-EGFP 質(zhì)粒。 以 pME18s-EGFP為模板，PCR 擴增綠色熒光蛋白基因片段（EGFP）。以限制性內(nèi)切酶處理并純化PCR 擴增片段，用連接酶（Ligation Mix，Takara）連接入 pME-Hyg 的 EcoRI和NotI 位點。

構(gòu) 建 pX330 -EGFP -FUT8 -cr1 和 pX330 -EGFP- FUT8-cr2 質(zhì)粒。 通過 E-CRISP 網(wǎng)站（http：//www.e-crisp.org/E-CRISP/） 設(shè)計敲除 FUT8 的兩對目標序列 FUT8-cr1 和 FUT8-cr2，qPCR 分別擴增這兩對目標序列， 以限制性內(nèi)切酶處理并純化qPCR 擴增片段， 用連接酶連入 pX330-EGFP 的BbsI 位點。

構(gòu)建 pX330-EGFP-ST6GAL1-cr1 和 pX330-EGFP- ST6GAL1-cr2 質(zhì)粒。 同上。

構(gòu) 建 Lenti-Cas9-Blast-FUT8-cr1 質(zhì) 粒 。 以pX330-EGFP-FUT8-cr1 為模板，PCR 擴增 FUT8 目標序列 （FUT8-cr1）。 以限制性內(nèi)切酶處理并純化PCR 擴增片段， 用連接酶連接入Lenti-Cas9-Blast的NheI 位點。

構(gòu)建 Lenti-Cas9-Puro 中間質(zhì)粒。 以 Lenti-CRISPR v2-Puro 為模板，PCR 擴增嘌呤霉素基因片段（Puro）。 以限制性內(nèi)切酶處理并純化PCR 擴增片段，用連接酶（Quick cloning Mix）連接入Lenti-Cas9的 BamHI 和 EcoRI 位點。

構(gòu)建 Lenti-Cas9-Puro-ST6GAL1-cr1 質(zhì)粒。 以pX330-EGFP-ST6GAL1-cr1 為 模 板 ，PCR 擴 增ST6GAL1 目標序列（ST6GAL1-cr1）。 以限制性內(nèi)切酶處理并純化PCR 擴增片段， 用連接酶連接入Lenti-Cas9-Puro 的 NheI 位點。

表1 本文中所用引物Table 1 Primers of this stduy

1.3 細胞株構(gòu)建方法

1.3.1 Lipofectamine 2000 介導HEK 293 細胞株穩(wěn)定轉(zhuǎn)染在6 孔板上接種HEK 293 野生型細胞，培養(yǎng)至細胞長到平板底面積的80%。 先將質(zhì)粒酶切，然后按照Invitrogen 的說明書， 將線型質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到HEK 293 野生型細胞。 待細胞長到滿板，用含抗生素的培養(yǎng)基篩選，即可獲得新型穩(wěn)定細胞株。

1.3.2 Lipofectamine 2000 介導 HEK 293 細胞株瞬時轉(zhuǎn)染在6 孔板上接種HEK 293 野生型細胞，培養(yǎng)至細胞長到平板底面積的80%。 按照Invitrogen的說明書， 將環(huán)型質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到HEK 293 野生型細胞。 待細胞長到滿板，用含抗生素的培養(yǎng)基篩選，即可獲得新型穩(wěn)定細胞株。

1.3.3 慢病毒介導HEK 293 細胞株穩(wěn)定轉(zhuǎn)染在6 孔板上接種HEK 293 T 細胞，培養(yǎng)至細胞長到平板底面積的80%。 將PMD-G，psPAX2 與重組質(zhì)粒按照質(zhì)量比 1∶1∶2 轉(zhuǎn)染到 HEK 293 T 細胞， 將在HEK 293 T 細胞中產(chǎn)生慢病毒。 24 h 后，將含有病毒的培養(yǎng)基與質(zhì)量分數(shù)10% FBS 培養(yǎng)基以體積比1∶1 混合，然后接入 HEK 293 野生型細胞。病毒轉(zhuǎn)染24 h 后用含抗生素的培養(yǎng)基篩選1 周。 對細胞染色并用流式細胞分選儀S3e 分選未染色細胞，由此獲得新型穩(wěn)定細胞株。

1.4 細胞融合的實驗操作

聚乙二醇是一種常用的細胞融合試劑。 日本血凝病毒外殼是日本凝血病毒去除遺傳物質(zhì)后獲得的，也可以介導細胞融合。

以PEG 為誘導劑介導細胞融合。 收集細胞，按照楊建等[24]修改的PEG 的使用方法將 PIGA-KOHyg-GFP 細胞株和 PIGK-KO-BSD-BFP 細胞株（各5×106個細胞）融合，并用質(zhì)量分數(shù) 10% FBS 培養(yǎng)基培養(yǎng)3 d， 通過流式細胞分析儀分析并確定細胞表型。

以HVJ-E 為誘導劑介導細胞融合。 收集細胞，按照GenomONE-CF EX 說明書中 HVJ-E 的使用方法將PIGA-KO-Hyg-GFP 細胞株和PIGK-KOBSD-BFP 細胞株（各 2×105個細胞）融合，并用質(zhì)量分數(shù) 10% FBS 培養(yǎng)基培養(yǎng)3 d，通過流式細胞分析儀分析并確定細胞表型。

1.5 流式細胞分析

收集細胞，用磷酸鹽緩沖液洗滌并重懸（細胞終濃度為 5×105個/mL）。CD59 抗體可識別 GPI 錨定蛋白CD59[25]，因此PIGA 和PIGK 基因敲除的細胞用CD59 抗體及結(jié)合紅色熒光蛋白的二抗染色。FUT8 敲除的細胞用結(jié)合熒光的凝集素LCA 或生物素凝集素LCA 染色[26]，ST6GAL1 敲除的細胞用生物素凝集素 SSA（Bio-SSA，Cosmo Bio，Japan）染色[21]。采用流式細胞分析儀分析細胞的熒光信號。

1.6 熒光顯微鏡檢測

用1 g/dL 的明膠溶液將墊片固定于24 孔板中， 然后加入大約3.3×104個細胞及質(zhì)量分數(shù)10%FBS 培養(yǎng)基培養(yǎng) 1～2 d。 用 4 g/dL 的多聚甲醛固定液固定細胞然后加入氯化銨溶液。 將墊片置于一片干凈的載玻片上并封閉，通過共聚焦熒光顯微鏡檢測細胞的熒光信號。

1.7 核型分析

在6 孔板上接種待檢測細胞并培養(yǎng)至細胞長至平板底面積的50%。 向平板中加入秋水仙胺（質(zhì)量濃度1 μg/mL）培養(yǎng)3 h，使細胞的有絲分裂停止于染色體辨識性最高的分裂中期[27]。 用1 g/dL 的檸檬酸鈉溶液處理以防止細胞黏連，用乙酸與甲醇的混合溶液（體積比為1∶3）固定細胞。 將細胞液滴于溫熱的載玻片后滴加Hochest 溶液使染色體著色，蓋上蓋玻片并用指甲油封閉。 通過共聚焦熒光顯微鏡觀察細胞熒光信號。

1.8 細胞生長活性檢驗

收集并計數(shù)細胞， 將200 個細胞接種到96 孔板中用100 mL 質(zhì)量分數(shù)10% FBS 培養(yǎng)基培養(yǎng)。4 h后加入 10 μL CCK-kit，1 h 后借助酶標儀 （450 nm波長）分析細胞活性。

2 結(jié)果與討論

2.1 PIGA-KO-Hyg-GFP 細胞株和PIGK-KOBSD-BFP 細胞株的構(gòu)建

通過穩(wěn)定轉(zhuǎn)染方法將抗潮霉素基因和綠色熒光蛋白（GFP）基因插入PIGA-KO 細胞株中，同時將抗殺稻瘟菌素基因和藍色熒光蛋白（BFP）基因插入PIGK-KO 細胞株，從而便于用抗性培養(yǎng)基篩選細胞以及借助流式細胞儀和共聚焦熒光顯微鏡確定細胞類型。 流式分析結(jié)果顯示PIGA-KO 細胞樣本具有綠色熒光、無藍色熒光且不能結(jié)合Anti-CD59 抗體，如圖1（a）、（b），共聚焦顯微鏡結(jié)果顯示細胞具有綠色熒光、無藍色熒光，如圖1（c）；PIGK-KO 樣本細胞具有藍色熒光、 無綠色熒光且不能結(jié)合Anti-CD59 抗體，如圖2（a）、（b），共聚焦顯微鏡結(jié)果顯示細胞具有藍色熒光、無綠色熒光，如圖2（c）。從而確定PIGA-KO 細胞樣本為PIGA-KO-Hyg-GFP 細胞株，PIGK-KO 細胞樣本為 PIGK-KOBSD-BFP 細胞株。

圖1 PIGA-KO-Hyg-GFP 細胞株的鑒定Fig.1 Identification of PIGA-KO-Hyg-GFP cell line

圖2 PIGK-KO-BSD-BFP 細胞株的鑒定Fig.2 Identification of PIGK-KO-BSD-BFP cell line

2.2 PIGA-KO-Hyg-GFP & PIGK-KO-BSDBFP 融合細胞株構(gòu)建

以 PIGA-KO-Hyg-GFP 細胞株和 PIGK-KOBSD-BFP 細胞株為模型構(gòu)建融合細胞株。將上述兩種細胞株混合并用PEG 處理。 流式分析結(jié)果顯示，部分細胞株融合，如圖3（a）。 限制性稀釋含多種細胞株的混合樣本，以期獲得單克隆細胞株。 流式分析結(jié)果顯示單克隆細胞株能夠結(jié)合Anti-CD59 抗體，這表明已獲得融合單克隆細胞株，如圖3（b）。通過鏡檢可檢測到綠色熒光信號和藍色熒光信號，如圖3（c），并且核型分析結(jié)果表明融合細胞中染色體數(shù)目近乎是PIGA-KO-Hyg-GFP 細胞株和PIGKKO-BSD-BFP 細胞株的染色體數(shù)目總和， 如圖3（d）， 這充分證明已獲得 PIGA-KO-Hyg-GFP &PIGK-KO-BSD-BFP 融合細胞株且可以穩(wěn)定培養(yǎng)。

2.3 細胞融合條件優(yōu)化

依據(jù)現(xiàn)有融合方法獲得HEK 293 融合細胞的效率極低，所以在此以HEK 293 細胞為研究模型進行細胞融合條件的優(yōu)化，從而提高細胞融合效率。

2.3.1 以PEG 為融合試劑的細胞融合條件優(yōu)化PEG 可以改變各種細胞膜結(jié)構(gòu)，使兩個細胞接觸部分的脂質(zhì)分子疏散并重組[2]，從而引發(fā)細胞融合，如圖4（a）。 由于 PEG 的相對分子質(zhì)量不同，因而被分為不同的類型， 例如本實驗中用到的Solar 4000、Merck 4000、Sigma 8000、Roche 1500 和 Solarbio 3350 5 種 PEG。首先以 PEG 為融合試劑，從 PEG 的種類，如圖4（b）；37 ℃培養(yǎng)時間，如圖4（c）；室溫培養(yǎng)時間，如圖4（d）；PEG 濃度，如圖4（e）共 4 個方面對細胞融合條件進行了優(yōu)化。 由于每個實驗中細胞的融合效率不完全相同，因此作者僅展示其中的代表性結(jié)果以說明其趨勢。 得到最優(yōu)條件為：混合兩種細胞 （各 5×106個細胞） 后用預熱的 PBS 和DMEM 清洗， 室溫下緩慢加入1 mL 質(zhì)量分數(shù)50%的PEG，室溫培養(yǎng)5 min，加入預熱的DMEM 溶液，37 ℃培養(yǎng)120 min，用預熱的DMEM 溶液清洗細胞2 次，然后用質(zhì)量分數(shù) 10% FBS 培養(yǎng)基培養(yǎng) 3 d。 經(jīng)過條件優(yōu)化，細胞融合效率達到了6%。

圖3 PIGA-KO-Hyg-GFP 和PIGK-KO-BSD-BFP 融合細胞株的鑒定Fig.3 Identification of PIGA-KO-Hyg-GFP & PIGK-KO-BSD-BFP fused cell line

圖4 PEG 介導的細胞融合條件優(yōu)化Fig.4 Optimization of cell fusion by PEG

2.3.2 以HVJ-E 為融合試劑的細胞融合條件優(yōu)化HVJ-E 可以像完整病毒一樣使細胞膜發(fā)生改變從而引起細胞融合，如圖5（a），卻沒有細胞致死性。也以HVJ-E 為融合試劑，從HVJ-E 使用劑量，如圖5（b）；是否需要離心，如圖5（c）；冰上培養(yǎng)時間，如圖5（d）；37 ℃培養(yǎng)時間，如圖5（e）共 4 個方面對細胞融合條件進行了優(yōu)化。 由于每個實驗中細胞的融合效率不完全相同，因此作者僅展示其中的代表性結(jié)果以說明其趨勢。 得到最優(yōu)條件為：分別收集兩種細胞（各2×105個細胞）后分別用PBS 清洗細胞一次并用25 μL 的融合緩沖液重懸細胞，將兩種細胞溶液在2 mL 離心管中混合再加入2.5 μL 冰凍HVJE 溶液并用手輕敲離心管混勻， 冰上放置培養(yǎng)15 min，2 000 r/min 4 ℃離心 3 min，然后 37 ℃培養(yǎng) 25 min。 最后將細胞轉(zhuǎn)移至6 孔板并加入預熱的質(zhì)量分數(shù)10% FBS 培養(yǎng)基培養(yǎng)3 d。經(jīng)過條件優(yōu)化，細胞融合效率達到了8.8%。

2.4 FUT8-KO-Hyg 細胞株和 ST6GAL1-KOBSD 細胞株的構(gòu)建與融合

核心巖藻糖能被凝集素LCA 特異性識別并結(jié)合[26]，因此可用結(jié)合熒光的凝集素（LCA-FITC）處理細胞并用流式細胞儀鑒定細胞表面糖鏈結(jié)構(gòu)。 當唾液酸與半乳糖以α-2，6 連接時，唾液酸可被凝集素SSA 特異性識別并結(jié)合， 因此可用生物素凝集素（Bio-SSA）處理細胞并用流式細胞儀鑒定細胞表面糖鏈結(jié)構(gòu)，如圖6（a）。

圖5 HVJ-E 介導的細胞融合條件優(yōu)化Fig.5 Optimization of cell fusion by HVJ-E

2.4.1 FUT8-KO-Hyg 細胞株和ST6GAL1-KO-BSD細胞構(gòu)建通過瞬時轉(zhuǎn)染方法將pX330-FUT8-cr1和pX330-FUT8-cr2 質(zhì)粒轉(zhuǎn)入HEK 293 野生型細胞，并經(jīng)限制性稀釋獲得FUT8-KO 單克隆細胞株。通過穩(wěn)定轉(zhuǎn)染方法將pME-Hyg 轉(zhuǎn)入FUT8-KO 單克隆細胞株， 并用400 μg/mL Hyg 培養(yǎng)基篩選以期獲得FUT8-KO-Hyg 細胞株。 流式分析結(jié)果表明細胞不能結(jié)合 LCA-FITC， 如圖6 （b）， 即獲得了FUT8-KO-Hyg 細胞株。

通過瞬時轉(zhuǎn)染方法將pX330-ST6GAL1-cr1 和pX330-ST6GAL1-cr2 質(zhì)粒轉(zhuǎn)入HEK293 野生型細胞，并經(jīng)限制性稀釋獲得ST6GAL1-KO 單克隆細胞株。 通過穩(wěn)定轉(zhuǎn)染方法將 pME -BSD 轉(zhuǎn)入ST6GAL1-KO 單克隆細胞株， 并用 10 μg/mL BSD培養(yǎng)基篩選以期獲得ST6GAL1-KO-BSD 細胞株。流式分析結(jié)果表明細胞不能結(jié)合Bio-SSA， 如圖6（c），即獲得了 ST6GAL1-KO-BSD 細胞株。

2.4.2 FUT8-KO-Hyg 細胞株和ST6GAL1-KO-BSD細胞株融合以PEG 為融合試劑，依據(jù)細胞融合最優(yōu)條件對FUT8-KO-Hyg 細胞株和ST6GAL1-KOBSD 細胞株進行融合處理。 用 400 μg/mL Hyg 和10 μg/mL BSD 培養(yǎng)基篩選后進行流式分析，結(jié)果顯示樣品中的絕大多數(shù)細胞均可結(jié)合LCA-FITC 和Bio-SSA，這表明絕大多數(shù)細胞已融合，如圖6（d）。限制性稀釋含多種表型細胞的混合樣本，獲得了單克隆細胞株。 通過流式分析單克隆細胞株，結(jié)果顯示其均可結(jié)合 LCA-FITC 和 Bio-SSA，如圖6（e），這初步表明獲得了融合的單克隆細胞株。 通過電泳檢測分析融合細胞株的FUT8 和ST6GAL1 兩種基因型，結(jié)果顯示融合細胞株中既有野生型的條帶也有敲除型的條帶，如圖6（f）、（g）。 核型分析的結(jié)果表明樣本細胞中染色體數(shù)目近乎是FUT8-KO-Hyg 細胞株和ST6GAL1-KO-BSD 細胞株的染色體數(shù)目總和，如圖6（h），這充分證明已獲得FUT8-KO-Hyg &ST6GAL1-KO-BSD 融合細胞株。

圖6 FUT8-KO-Hyg 細胞株和ST6GAL1-KO-BSD 細胞株的鑒定及融合細胞的鑒定Fig.6 Identification of FUT8-KO-Hyg cell line，ST6GAL1-KO-BSDcell line and fused cell line

2.5 FUT8 和 ST6GAL1 的共敲除

質(zhì)粒Lenti-Cas9-Blast 中有Cas9 基因，通過病毒轉(zhuǎn)染可使HEK 293 細胞表達Cas9 蛋白， 在轉(zhuǎn)入目的基因的目標序列的條件下可以實現(xiàn)目的基因的敲除[5]，如圖7（a）。 作者通過用生物素凝集素（Bio-LCA）和生物素凝集素（Bio-SSA）處理細胞并用流式細胞儀鑒定細胞表型，如圖7（b）。 作者期望可以通過細胞融合獲得基因雙敲除細胞株。

2.5.1 FUT8-cr1-KO-BSD 細胞株和 ST6GAL1-cr1-KO-Puro 細胞株的構(gòu)建、 鑒定及生長活性分析通過病毒轉(zhuǎn)染的方法， 將 Cas9 和 BSD 基因及FUT8-cr1 單向引導 RNA 轉(zhuǎn)入 HEK 293 野生型細胞株， 并用 10 μg/mL BSD 培養(yǎng)基篩選以期獲得FUT8-cr1-KO-BSD 細胞株。 用流式細胞儀分析待測細胞，結(jié)果顯示被檢驗細胞株不能被Bio-LCA 染色，如圖7（c），說明FUT8 基因已被突變且不能表達，表明已獲得FUT8-cr1-KO-BSD 細胞株。

通過病毒轉(zhuǎn)染的方法， 將Cas9 和Puro 基因及ST6GAL1-cr1 單向引導RNA 轉(zhuǎn)入HEK 293 野生型細胞株， 并用1 μg/mL Puro 培養(yǎng)基篩選以期獲得ST6GAL1-cr1-KO-Puro 細胞株。用流式細胞儀分析待測細胞， 結(jié)果顯示被檢驗細胞株不能被Bio-SSA染色，如圖7（c），說明ST6GAL1 基因已被突變且不能表達，表明已獲得ST6GAL1-cr1-KO-Puro 細胞株。

檢測FUT8-cr1-KO-BSD 細胞株和ST6GAL1-cr1-KO-Puro 細胞株的生長活性并與HEK 293 野生型細胞進行比較，結(jié)果顯示，3 種細胞的生長曲線基本一致，如圖7（d）。 這表明 FUT8 或 ST6GAL1 的敲除不影響細胞的生長。

2.5.2 FUT8-ST6GAL1-DKO 細胞株的構(gòu)建以HVJ-E 為融合劑， 依據(jù)細胞融合最優(yōu)條件融合FUT8-cr1-KO-BSD 細胞株和 ST6GAL1-cr1-KOPuro 細胞株。 理論上兩種細胞株融合以后，其胞內(nèi)存在的目標序列產(chǎn)生的目標導向RNA 和Cas9 表達產(chǎn)生的蛋白會使對方細胞中的目的基因突變，如圖8（a）。 借助流式細胞儀分析用 Bio-LCA 或 Bio-SSA 處理過的 FUT8-cr1-KO-BSD 細胞株和ST6GAL1-cr1-KO-Puro 融合細胞株， 結(jié)果顯示：部分細胞未被Bio-LCA 染色，如圖8（b），表明部分細胞中FUT8 被敲除； 絕大部分細胞未被Bio-SSA 染色，表明部分細胞中 ST6GAL1 被敲除，如圖8（b）。通過計算，F(xiàn)UT8 的敲除效率為40.8%；ST6GAL1的敲除效率為99.9%。 而事實上，F(xiàn)UT8-cr1-KO-BSD& ST6GAL1-cr1-KO-Puro 細胞株既不能結(jié)合Bio-LCA 又不能結(jié)合 Bio-SSA，如圖8（c），這說明融合細胞中的FUT8 和ST6GAL1基因均被突變且不能表達，即已構(gòu)建FUT8-ST6GAL1-DKO 細胞株。

圖7 FUT8-cr1-KO-BSD 細胞株和ST6GAL1-cr1-KO-Puro 細胞株的鑒定及生長活性檢驗Fig.7 Identification of FUT8-cr1-KO-BSD cell line and ST6GAL1-cr1-KO-Puro cell line and cell growth activity test

圖8 FUT8-ST6GAL1-DKO 細胞株的鑒定Fig.8 Identification of FUT8-ST6GAL1-DKO cell line

3 結(jié) 語

作者構(gòu)建了PIGA-KO-Hyg-GFP 細胞株和PIGK-KO-BSD-BFP 細胞株并將兩者融合獲得PIGA-KO-Hyg-GFP & PIGK-KO-BSD-BFP 融合細胞株。 通過對細胞融合實驗條件的優(yōu)化，使以PEG為融合試劑的細胞融合效率達到了6%，而以HVJE 為融合試劑的細胞融合效率達到了8.8%。 HVJ-E作為誘導劑進行細胞融合更具優(yōu)勢，如所需細胞數(shù)量少，不必大規(guī)模培養(yǎng)細胞，完成實驗所需時間短，細胞融合效率高， 融合細胞死亡率低等，HVJ-E 作為誘導劑更有利于實驗的進行。 構(gòu)建了FUT8-KOHyg 細胞株和 ST6GAL1-KO-BSD 細胞株， 并以PEG 為融合試劑將其融合構(gòu)建了FUT8-KO-Hyg 和ST6GAL1-KO-BSD 融合細胞株；構(gòu)建了FUT8-cr1-KO-BSD 細胞株和ST6GAL1-cr1-KO-Puro 細胞株，并證明了FUT8 或ST6GAL1的敲除對細胞的生長活性沒有影響。此外還以HVJ-E 為融合試劑將兩者融合，并檢測了基因敲除效率，最終構(gòu)建了FUT8-ST6GAL1-DKO 細胞株。

與逐個敲除的常規(guī)方法相比，本研究可以直接通過細胞融合獲得基因敲除細胞株，這有效地縮短了構(gòu)建雙基因敲除的哺乳動物細胞株所需的時間，也奠定了快速構(gòu)建哺乳動物細胞多基因共敲除細胞株的基礎(chǔ)。 但是融合細胞中存在染色體數(shù)目加倍且細胞生長相對緩慢的問題，后續(xù)研究將致力于此問題的解決。