好氧堆肥用枯草芽孢桿菌GX2 產(chǎn)芽孢工藝優(yōu)化

李月月 ， 李秀芬 *， 齊希光 ， 李 健 ， 任月萍 ， 王新華 ， 夏瓊瓊

（1.江南大學(xué) 環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院，江蘇 無(wú)錫 214122；2.江蘇省厭氧生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 無(wú)錫 214122；3.江蘇省水處理技術(shù)與材料協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇 蘇州 215009；4.江南大學(xué) 食品學(xué)院，江蘇 無(wú)錫 214122；5.中國(guó)市政工程華北設(shè)計(jì)研究總院有限公司，天津300074）

好氧堆肥化是有機(jī)固體廢棄物減量化、無(wú)害化及資源化的有效途徑之一，是在微生物作用下通過(guò)高溫發(fā)酵使有機(jī)物變成腐熟肥料的過(guò)程。 好氧堆肥不僅含有大量可被植物吸收利用的有效態(tài)氮、 磷、鉀及其化合物，而且含有構(gòu)成土壤肥力的重要活性物質(zhì)腐殖質(zhì)[1]，既解決了有機(jī)固體廢棄物的環(huán)境污染問(wèn)題，又起到改良土壤和增加肥效的作用[2]。 在好氧堆肥過(guò)程中添加外源微生物菌劑可有效提高堆體中功能微生物的數(shù)量，加快有機(jī)物轉(zhuǎn)化及堆肥進(jìn)程，提高肥效[3]。 Xi 等[4]通過(guò)接種復(fù)合菌劑增加堆肥過(guò)程中細(xì)菌的多樣性，可有效提高堆肥效率。 Zhao等[5]發(fā)現(xiàn)在堆肥過(guò)程中接種放線菌可顯著提高纖維素酶活性，加速纖維素降解，提高腐殖質(zhì)含量，減少溫室氣體排放。 微生物菌劑的應(yīng)用效果與活菌數(shù)密切相關(guān)，有效活菌數(shù)是衡量微生物菌劑品質(zhì)的重要指標(biāo)[6]，然而，隨著微生物菌劑保存時(shí)間的延長(zhǎng)，活菌數(shù)不斷減少，降低菌劑的使用效果[7]，同時(shí)，微生物菌劑的制備成本較高，影響了其工業(yè)化應(yīng)用。

芽孢桿菌具有較強(qiáng)的抗逆性，能耐熱、酸和堿等不良環(huán)境， 可有效保持菌劑中的微生物活性，提高菌劑質(zhì)量及應(yīng)用效果[8-9]。 王雪蓮等[10]采用響應(yīng)面法對(duì)影響枯草芽孢桿菌B579 的培養(yǎng)基進(jìn)行了優(yōu)化，為進(jìn)一步提高細(xì)胞濃度和后續(xù)放大培養(yǎng)提供參考，同時(shí)，對(duì)其產(chǎn)芽孢條件進(jìn)行了優(yōu)化。 王法國(guó)等[11]通過(guò)單因素試驗(yàn)、Plackett-Burman 試驗(yàn)設(shè)計(jì)和響應(yīng)面法對(duì)解淀粉芽孢桿菌JT84 的培養(yǎng)基成分和發(fā)酵條件進(jìn)行了優(yōu)化， 所得發(fā)酵液的芽孢含量為1.67×109CFU/mL， 與基礎(chǔ)培養(yǎng)基相比， 提高了159%。 郭曉軍等[8]通過(guò)對(duì)堆肥用產(chǎn)蛋白酶菌株的單因素、正交試驗(yàn)產(chǎn)芽孢條件優(yōu)化，芽孢產(chǎn)率達(dá)95.0%，為解決以芽孢桿菌為主的微生物菌劑產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)過(guò)程中存在的活性低等問(wèn)題提供了重要參考。

作者采集污泥與秸稈混合好氧堆肥樣品，進(jìn)行微生物初篩、復(fù)篩及分離純化，分子鑒定后獲得一株用于好氧堆肥的枯草芽孢桿菌GX2， 具有耐高溫、耐酸等特點(diǎn)，將其應(yīng)用于堆肥過(guò)程能有效縮短堆肥周期，提高堆肥品質(zhì)。 針對(duì)上述枯草芽孢桿菌GX2，通過(guò)搖瓶培養(yǎng)條件優(yōu)化，在3 L 發(fā)酵罐中通過(guò)分批補(bǔ)料技術(shù)進(jìn)一步提高細(xì)胞濃度，并通過(guò)單因素和正交試驗(yàn)優(yōu)化產(chǎn)芽孢工藝條件，可為降低其發(fā)酵及菌劑制備成本提供有益參考。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

堆肥用菌株：好氧堆肥用枯草芽孢桿菌GX2 為實(shí)驗(yàn)室保存菌株；種子培養(yǎng)基：蛋白胨10 g/L，牛肉浸膏 3 g/L，氯化鈉 5 g/L，pH 為 7.2±0.2；

計(jì)數(shù)培養(yǎng)基：蛋白胨10 g/L，牛肉浸膏3 g/L，氯化鈉 5 g/L， 瓊脂 15 g/L，pH 為 7.0～7.2； 搖瓶及 3L發(fā)酵罐的基礎(chǔ)培養(yǎng)基：酪蛋白胨15 g/L，大豆蛋白胨5 g/L，NaCl 5 g/L，pH 7.3，消泡劑 0.2%（體積分?jǐn)?shù)）；補(bǔ)料培養(yǎng)基：50 g/L 的蔗糖溶液；營(yíng)養(yǎng)肉湯、營(yíng)養(yǎng)瓊脂、胰蛋白胨、牛肉浸膏、硫酸錳、蔗糖和硝酸鈉：上海國(guó)藥集團(tuán)產(chǎn)品。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 菌株活化及種子液制備將4 ℃冰箱內(nèi)保藏的菌株接入已滅菌的液體肉湯培養(yǎng)基中，搖床上45 ℃、160 r/min 活化 12 h 后，在固體營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上三區(qū)平板劃線，置于45 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，挑選三區(qū)單菌落傳代兩次后，作為發(fā)酵菌株使用。

挑取已活化的發(fā)酵菌株單菌落， 接種于裝有100 mL 已滅菌的肉湯培養(yǎng)基250 mL 三角瓶中，置于搖床振蕩培養(yǎng)，在溫度為45 ℃，轉(zhuǎn)速為160 r/min培養(yǎng)12 h 作為種子液。

1.2.2 搖瓶培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件優(yōu)化在搖床發(fā)酵培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上，以O(shè)D 值為指標(biāo)，對(duì)菌株GX2 進(jìn)行碳源種類(lèi)（葡萄糖、蔗糖、淀粉）、最佳碳源質(zhì)量濃度（5、10、20、30、40 g/L）、氮源種類(lèi)（酵母粉、氯化銨、硝酸鈉）、最佳氮源質(zhì)量濃度（5、10、15、20、25 g/L）、裝液量（50、100、150、200 mL）的單因素優(yōu)化。 搖床培養(yǎng)的初始條件為溫度45 ℃，轉(zhuǎn)速160 r/min，裝液量 100 mL（250 mL），pH 7.3。 實(shí)驗(yàn)在同一時(shí)間取樣測(cè)定OD 值來(lái)優(yōu)化培養(yǎng)基及其培養(yǎng)條件， 優(yōu)化后的培養(yǎng)基用于發(fā)酵罐培養(yǎng)。 每組試驗(yàn) 3 次重復(fù)，結(jié)果取平均值。

1.2.3 發(fā)酵罐分批補(bǔ)料培養(yǎng)發(fā)酵罐型號(hào)為BIOTECH-3JG-3JG-9000D，上海保光公司產(chǎn)品。 在前期搖床培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件優(yōu)化的基礎(chǔ)上，將發(fā)酵罐初始條件設(shè)置為工作體積1.5 L、壓力0.05 MPa、攪拌轉(zhuǎn)速 300 r/min、 溫度 45 ℃、 接種量為 1×107CFU/mL， 通過(guò)流加 3 mol/L 的 NaOH 和 HCl 將 pH值自動(dòng)控制在7.3。 將3 L 發(fā)酵罐進(jìn)行滅菌，然后裝入1.5 L 發(fā)酵培養(yǎng)基于121 ℃滅菌30 min， 取出后將溫度、pH、 轉(zhuǎn)速、 溶氧設(shè)置在初始條件， 以 1×107CFU/mL 的接入量接種新鮮活化的GX2 種子液。

分批發(fā)酵是在上述條件下上罐進(jìn)行菌株發(fā)酵，測(cè)定發(fā)酵過(guò)程中OD 值、殘?zhí)菨舛?、活菌?shù)，獲得菌株在發(fā)酵罐上的補(bǔ)料時(shí)間和補(bǔ)料量。 分批補(bǔ)料發(fā)酵是在分批發(fā)酵的基礎(chǔ)上，當(dāng)總糖量消耗一半時(shí)[12-13]，加入碳源至原濃度，繼續(xù)發(fā)酵培養(yǎng)，當(dāng)細(xì)胞濃度達(dá)到穩(wěn)定時(shí)停止補(bǔ)料發(fā)酵。 以最大OD 值和最大活細(xì)胞數(shù)作為參考值，來(lái)分析分批發(fā)酵和分批補(bǔ)料發(fā)酵的效果。

在分批補(bǔ)料發(fā)酵的基礎(chǔ)上，取樣測(cè)定活菌數(shù)和芽孢數(shù)，繪制芽孢曲線圖。 在產(chǎn)芽孢時(shí)開(kāi)始控制條件來(lái)優(yōu)化芽孢率，并在芽孢率最大時(shí)取樣測(cè)定。

1.2.4 發(fā)酵罐培養(yǎng)條件優(yōu)化

1） 單因素優(yōu)化芽孢率 在發(fā)酵罐分批補(bǔ)料優(yōu)化的基礎(chǔ)上，分別研究培養(yǎng)溫度、攪拌轉(zhuǎn)速和pH 值對(duì)芽孢桿菌產(chǎn)芽孢的影響。

2） 正交試驗(yàn)優(yōu)化芽孢率 根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果得到的 pH（A），溫度（B）、轉(zhuǎn)速（C）的基礎(chǔ)上，設(shè)計(jì)3 因素3 水平正交試驗(yàn)， 并根據(jù)正交試驗(yàn)數(shù)據(jù)的極差分析，得到菌株產(chǎn)芽孢的最佳發(fā)酵條件。

3） 追加驗(yàn)證實(shí)驗(yàn) 根據(jù)正交試驗(yàn)分析的最佳發(fā)酵培養(yǎng)條件，進(jìn)行追加驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)。

1.3 分析測(cè)試項(xiàng)目與方法

細(xì)胞濃度：采用比色法，以空白培養(yǎng)基作參比，在 600 nm 處測(cè)定發(fā)酵液 OD 值[13-16]。

活細(xì)胞數(shù)：采用稀釋平板培養(yǎng)計(jì)數(shù)法，發(fā)酵液進(jìn)行10 倍稀釋后，涂布平板進(jìn)行活菌計(jì)數(shù)[17]。

芽孢數(shù)：將發(fā)酵液在70 ℃下處理15 min 后，冷卻，采用稀釋梯度平皿計(jì)數(shù)法統(tǒng)計(jì)活菌數(shù)[18]。

芽孢率：芽孢數(shù)占活菌數(shù)的百分?jǐn)?shù)[18]。

總糖含量：采用 3，5-二硝基水楊酸（DNS）比色法[19]。

2 結(jié)果與分析

2.1 搖瓶培養(yǎng)條件優(yōu)化

2.1.1 生長(zhǎng)曲線繪制微生物菌株生長(zhǎng)一般經(jīng)歷延滯期、對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期、穩(wěn)定期和衰亡期4 個(gè)階段[20]。首先是菌體生長(zhǎng)的遲滯期，生長(zhǎng)緩慢，細(xì)胞濃度基本不會(huì)增加；適應(yīng)新環(huán)境后，微生物生長(zhǎng)繁殖速度加快，細(xì)胞濃度快速提高，進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期；此后，隨著底物不斷被消耗，細(xì)胞濃度進(jìn)入穩(wěn)定期；底物進(jìn)一步消耗殆盡，微生物生長(zhǎng)進(jìn)入衰亡期，細(xì)胞濃度明顯下降。 繪制微生物菌株的生長(zhǎng)曲線可為其培養(yǎng)條件優(yōu)化提供重要參考，圖1 給出了枯草芽孢桿菌GX2 的發(fā)酵液OD 值隨培養(yǎng)時(shí)間的變化情況。

圖1 菌株GX2 生長(zhǎng)曲線Fig.1 Growth curve of strain GX2

由圖1 可知，細(xì)胞濃度在前期有短暫的生長(zhǎng)停滯期， 之后發(fā)酵液在波長(zhǎng)600 nm 處的吸光度呈直線上升趨勢(shì)，至14 h 時(shí)，細(xì)胞濃度達(dá)到最大，A600nm為1.698，之后開(kāi)始下降。 通常情況下，處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的菌株活力最強(qiáng)[21]，細(xì)胞濃度也最高，因此，確定14 h 為枯草芽孢桿菌GX2 的最佳培養(yǎng)時(shí)間，并用作后續(xù)搖瓶培養(yǎng)條件優(yōu)化研究的發(fā)酵終止時(shí)間。

2.1.2 碳源種類(lèi)及其質(zhì)量濃度的優(yōu)化培養(yǎng)基是富含多種營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的混合物，碳源是組成培養(yǎng)基的主要成分之一，其主要作用是構(gòu)成菌體細(xì)胞成分并為生命活動(dòng)提供所需能量[22]，葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、乳糖和可溶性淀粉均是易被微生物利用的碳源[23]。作者選擇價(jià)廉易得的葡萄糖、蔗糖和可溶性淀粉為碳源， 進(jìn)行碳源篩選及質(zhì)量濃度優(yōu)化， 結(jié)果如圖2所示。

圖2 碳源對(duì)菌株GX2 細(xì)胞濃度的影響Fig.2 Effect of carbon source on cell concentration of strain GX2

由圖2（a）可知，與對(duì)照不添加碳源相比，添加蔗糖的細(xì)胞濃度略高，A600nm達(dá)0.917， 而其他兩種碳源的細(xì)胞濃度均低于對(duì)照，說(shuō)明蔗糖有利于GX2的快速繁殖。其中，葡萄糖的A 值顯著低于對(duì)照，其可能是因?yàn)闇缇鷷r(shí)會(huì)與其他物質(zhì)反應(yīng)生成抑制菌株生長(zhǎng)的有毒物質(zhì)，即“美拉德反應(yīng)”產(chǎn)物[19]。 此外，隨著蔗糖濃度的升高，細(xì)胞濃度先增加后降低（圖2（b）），蔗糖添加量為 5 g/L 時(shí)，細(xì)胞濃度最大，發(fā)酵液的A600nm為1.175。 故確定GX2 的最佳碳源為蔗糖，添加質(zhì)量濃度為5 g/L。

2.1.3 氮源種類(lèi)及其質(zhì)量濃度優(yōu)化氮源主要用來(lái)構(gòu)成微生物細(xì)胞和代謝產(chǎn)物的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)[22]，常用的氮源有無(wú)機(jī)氮源和有機(jī)氮源。 無(wú)機(jī)氮源成分單一，吸收利用較快；有機(jī)氮源含有豐富的蛋白質(zhì)和游離的氨基酸，可以被生物緩慢利用[23]。氮源種類(lèi)及質(zhì)量濃度優(yōu)化結(jié)果如圖3（a）和圖3（b）所示。

由圖3（a）可知，與不添加氮源相比，氯化銨和硝酸鈉的添加更有利于GX2 細(xì)胞濃度的增加，A 值均高于對(duì)照，其中硝酸鈉的細(xì)胞濃度最大，而酵母粉的添加不利于GX2 生長(zhǎng)。 在此基礎(chǔ)上，對(duì)硝酸鈉的濃度進(jìn)行了優(yōu)化，結(jié)果如圖3（b）所示。可見(jiàn)，硝酸鈉質(zhì)量濃度為5 g/L 時(shí)， 細(xì)胞濃度最大，A600nm為0.79，故芽孢桿菌GX2 的最佳氮源為硝酸鈉，最佳添加質(zhì)量濃度為5 g/L。

圖3 氮源對(duì)菌株GX2 細(xì)胞濃度的影響Fig.3 Effect of nitrogen source on cell concentration of strain GX2

2.1.4 裝液量?jī)?yōu)化溶解氧為好氧微生物生長(zhǎng)所必需，是進(jìn)行能量代謝的重要物質(zhì)，供氧條件直接影響菌體生長(zhǎng)繁殖以及細(xì)胞代謝[24]。 搖瓶培養(yǎng)的溶解氧濃度主要通過(guò)轉(zhuǎn)速和裝液量進(jìn)行控制，相同攪拌轉(zhuǎn)速條件下，裝液量越大，溶解氧濃度越低，裝液量直接影響菌體在生長(zhǎng)過(guò)程[22]。250 mL 搖瓶中裝液量分別為 50、100、150、200 mL 時(shí)，研究溶解氧對(duì)細(xì)胞濃度的影響， 結(jié)果如圖4 所示。 當(dāng)裝液量為100 mL 時(shí)，枯草芽孢桿菌GX2 的細(xì)胞濃度最大，OD 值達(dá)1.554，比未優(yōu)化前提高了44.3%。

綜上，好氧堆肥用芽孢桿菌GX2 的搖瓶培養(yǎng)條件優(yōu)化結(jié)果表明：GX2 的最佳培養(yǎng)基為搖瓶基礎(chǔ)培養(yǎng)基，5 g/L 蔗糖和 5 g/L NaNO3， 裝液量為 250 mL搖瓶裝液100 mL。 通過(guò)搖床培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件優(yōu)化，可有效提高枯草芽孢桿菌GX2 的細(xì)胞濃度。

圖4 裝液量對(duì)菌株GX2 的細(xì)胞濃度的影響Fig.4 Effect of liquid loading on cell concentration of strain GX2

2.2 發(fā)酵罐分批補(bǔ)料技術(shù)研究

在實(shí)際的分批發(fā)酵過(guò)程中，連續(xù)或間隔補(bǔ)加限制性營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)或新鮮培養(yǎng)基，稱(chēng)為分批補(bǔ)料發(fā)酵[25]，可延長(zhǎng)微生物的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期和穩(wěn)定期的持續(xù)時(shí)間，提高細(xì)胞濃度。 分批發(fā)酵過(guò)程在細(xì)胞濃度不斷增加進(jìn)而耗盡可利用底物時(shí)，細(xì)胞濃度不再增加，而分批補(bǔ)料發(fā)酵可有效解決這一問(wèn)題[26]，提高發(fā)酵效率。

2.2.1 發(fā)酵罐分批補(bǔ)料對(duì)細(xì)胞濃度的影響在搖瓶培養(yǎng)條件優(yōu)化的基礎(chǔ)上， 以3 L 發(fā)酵罐進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，當(dāng)蔗糖質(zhì)量濃度低于初始質(zhì)量濃度的一半以下時(shí)，補(bǔ)加質(zhì)量質(zhì)量濃度50 g/L 的蔗糖溶液至初始質(zhì)量濃度， 研究發(fā)酵罐分批補(bǔ)料對(duì)枯草芽孢桿菌GX2 細(xì)胞濃度的影響，結(jié)果如圖5 所示。

可見(jiàn)，與搖瓶培養(yǎng)不同，由于發(fā)酵罐可實(shí)現(xiàn)發(fā)酵條件特別是pH 的在線實(shí)時(shí)控制， 為枯草芽孢桿菌GX2 提供了良好的生長(zhǎng)環(huán)境， 細(xì)胞繁殖速度加快，發(fā)酵至4 h 后即進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，碳源（蔗糖）也快速被消耗， 在第8 小時(shí)時(shí)蔗糖質(zhì)濃度由起始的5.0 g/L 左右降低至1.8 g/L，成為制約菌體生長(zhǎng)的關(guān)鍵因素，此時(shí)，補(bǔ)加50 g/L 的蔗糖溶液至4.5 g/L 左右，細(xì)胞濃度再次呈快速增長(zhǎng)趨勢(shì)，在第9 小時(shí)時(shí)完成第二次補(bǔ)料，最終分批補(bǔ)料的發(fā)酵液最大A600nm達(dá)2.250，而分批發(fā)酵的A600nm為1.900，對(duì)應(yīng)的活菌數(shù)分別為 1.8×1010、1.2×1010CFU/mL， 由此可見(jiàn)，分批補(bǔ)料操作可有效提高發(fā)酵液的營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞濃度。

圖5 菌株GX2 分批和分批補(bǔ)料發(fā)酵的細(xì)胞濃度及碳源消耗Fig.5 Cell concentration and carbon source consumption of batch and batch fed fermentation of strain GX2

2.2.2 發(fā)酵罐分批補(bǔ)料對(duì)芽孢率的影響圖6 顯示了枯草芽孢桿菌GX2 的芽孢發(fā)酵曲線，同時(shí)給出了活菌數(shù)和芽孢率隨發(fā)酵時(shí)間的變化情況。 可見(jiàn)，隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)，活菌和芽孢濃度和芽孢率均呈先增加后降低的變化趨勢(shì)， 發(fā)酵至10 h 和11 h時(shí)，活菌和芽孢濃度達(dá)最大，分別為1.1×1010和7.2×109CFU/mL，此時(shí)，芽孢率也達(dá)最大，為 66.6%。 此后，活菌數(shù)開(kāi)始下降，芽孢數(shù)也相應(yīng)降低，說(shuō)明發(fā)酵過(guò)程進(jìn)入衰亡期。在這個(gè)基礎(chǔ)上，發(fā)酵至9 h 時(shí)改變發(fā)酵條件，開(kāi)展后續(xù)產(chǎn)芽孢條件優(yōu)化研究。

圖6 菌株GX2 的芽孢發(fā)酵曲線Fig.6 Spore fermentation curve of strain GX2

2.3 發(fā)酵罐產(chǎn)芽孢條件優(yōu)化

芽孢是產(chǎn)芽孢細(xì)菌在生長(zhǎng)過(guò)程中形成的一種抗逆休眠體[27]，因其具有耐熱、抗輻射、耐酸堿及抗化學(xué)藥物等特殊性質(zhì)[28]，可有效抵抗外界環(huán)境條件的變化，提高存活率，優(yōu)化芽孢形成條件對(duì)微生物菌劑的制備具有一定的實(shí)踐價(jià)值。 與菌體的生長(zhǎng)繁殖相似，芽孢的形成同樣受營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)及環(huán)境條件等多因素的影響，在分批補(bǔ)料發(fā)酵培養(yǎng)提高細(xì)胞濃度的基礎(chǔ)上，對(duì)影響枯草芽孢桿菌GX2 產(chǎn)芽孢的關(guān)鍵環(huán)境條件進(jìn)行優(yōu)化， 進(jìn)一步提高芽孢數(shù)及芽孢率，可為提高好氧堆肥用微生物菌劑的品質(zhì)及其實(shí)際應(yīng)用效果奠定技術(shù)基礎(chǔ)。

2.3.1 培養(yǎng)溫度對(duì)枯草芽孢桿菌GX2 芽孢率的影響培養(yǎng)溫度是影響微生物生長(zhǎng)繁殖和芽孢形成的重要環(huán)境條件之一，它主要通過(guò)影響細(xì)胞內(nèi)生物大分子酶和蛋白質(zhì)的合成與活性來(lái)促進(jìn)芽孢形成[14]。 作者在搖瓶實(shí)驗(yàn)優(yōu)化的最佳培養(yǎng)基條件下進(jìn)行培養(yǎng)，并采用分批補(bǔ)料技術(shù)，使得細(xì)胞濃度在培養(yǎng)9 h 時(shí)達(dá)到最大，然后調(diào)整培養(yǎng)溫度，研究溫度對(duì)芽孢桿菌GX2 芽孢率的影響， 結(jié)果如圖7 所示?？梢?jiàn)，培養(yǎng)溫度可在一定程度上影響微生物的生長(zhǎng)繁殖及芽孢的形成，隨溫度升高，活菌及芽孢濃度均呈大致增加的趨勢(shì)，而芽孢率先升高后降低。 當(dāng)培養(yǎng)溫度為35 ℃時(shí)，活菌和芽孢濃度均較低，分別為 9.2×109、5.5×109CFU/mL，芽孢率為 59.8%。此后，隨著培養(yǎng)溫度升高， 活菌濃度和芽孢數(shù)逐步提高，50 ℃時(shí)，芽孢數(shù)和芽孢率均最大，分別為7.55×109CFU/mL 和70.6%。當(dāng)溫度進(jìn)一步升高至55 ℃時(shí)，盡管活菌數(shù)和芽孢數(shù)略有升高， 但芽孢率開(kāi)始下降，因此，后續(xù)產(chǎn)芽孢研究的培養(yǎng)溫度采用50 ℃。

圖7 培養(yǎng)溫度對(duì)芽孢桿菌GX2 產(chǎn)芽孢的影響Fig.7 Effect of temperature on spore production of Bacillus GX2

2.3.2 攪拌轉(zhuǎn)速對(duì)枯草芽孢桿菌GX2 芽孢率的影響好氧堆肥用枯草芽孢桿菌GX2 為好氧菌，氧氣是其生長(zhǎng)繁殖和芽孢生成的重要影響因素[29]。同時(shí)，溶解氧對(duì)發(fā)酵生產(chǎn)的穩(wěn)定性和生產(chǎn)成本也具有較大影響[24]。發(fā)酵罐培養(yǎng)時(shí)，發(fā)酵液中的溶解氧與通氣量和攪拌轉(zhuǎn)速有關(guān)，當(dāng)通氣量一定時(shí)，可通過(guò)調(diào)整攪拌轉(zhuǎn)速改變發(fā)酵液中的溶解氧濃度，進(jìn)而優(yōu)化發(fā)酵及產(chǎn)芽孢過(guò)程。攪拌轉(zhuǎn)速對(duì)枯草芽孢桿菌GX2 產(chǎn)芽孢的影響如圖8 所示。 可見(jiàn)，隨攪拌轉(zhuǎn)速的升高，活菌濃度不斷下降，而芽孢濃度和芽孢率卻呈先升高后降低的變化趨勢(shì)。 由于發(fā)酵液中的細(xì)胞（活菌）濃度較高，約1.2×1010CFU/mL，較高的攪拌轉(zhuǎn)速帶來(lái)較大的剪切力，不利于細(xì)胞存活，因此，隨攪拌轉(zhuǎn)速升高活菌數(shù)不斷下降，這與文獻(xiàn)報(bào)道一致[30]。 同時(shí)，隨攪拌轉(zhuǎn)速升高，較高的剪切力使得更多營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞轉(zhuǎn)化為芽孢，當(dāng)攪拌轉(zhuǎn)速為100 r/min 時(shí)，芽孢濃度和芽孢率均最大， 分別為9.7×109CFU/mL 和82.9%，進(jìn)一步提高攪拌轉(zhuǎn)速，芽孢率開(kāi)始下降，這與較高轉(zhuǎn)速下活菌數(shù)較低有關(guān)。

圖8 攪拌轉(zhuǎn)速對(duì)芽孢桿菌GX2 產(chǎn)芽孢的影響Fig.8 Effect of rotation speed on spore production by Bacillus GX2

2.3.3 pH 對(duì)枯草芽孢桿菌 GX2 芽孢率的影響不同微生物菌株適宜的pH 條件不同， 酸堿度影響微生物細(xì)胞膜的通透性、膜結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性以及物質(zhì)的溶解性或電離性，致使微生物對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的吸收和利用呈現(xiàn)差異[23]，進(jìn)而影響微生物的生長(zhǎng)繁殖，并對(duì)芽孢桿菌的芽孢率產(chǎn)生影響。 由圖9 可知，隨pH升高，活菌數(shù)、芽孢數(shù)和芽孢率均呈先升高后降低的變化趨勢(shì)。 當(dāng)pH 為6.8 時(shí)， 活菌濃度最大，為1.25×1010CFU/mL。 當(dāng) pH 升高至 7.3 時(shí)，盡管活菌數(shù)開(kāi)始降低，但芽孢濃度和芽孢率達(dá)最大，分別為9.7×109CFU/mL 和82.9%。進(jìn)一步升高pH，活菌數(shù)、芽孢濃度以及芽孢率均明顯降低。

圖9 pH 對(duì)芽孢桿菌GX2 產(chǎn)芽孢的影響Fig.9 Effect of pH on the spore production of Bacillus GX2

2.3.4 正交試驗(yàn)優(yōu)化及驗(yàn)證正交試驗(yàn)是考察關(guān)鍵影響因素綜合效應(yīng)及進(jìn)行多條件優(yōu)化的研究方法之一。 這里，在單因素優(yōu)化的基礎(chǔ)上，以培養(yǎng)溫度、攪拌轉(zhuǎn)速和pH 為關(guān)鍵影響因素，選用正交表進(jìn)行3 因素3 水平的正交試驗(yàn)研究，以活菌數(shù)和芽孢數(shù)為評(píng)價(jià)指標(biāo)，研究關(guān)鍵影響因素對(duì)芽孢桿菌GX2產(chǎn)芽孢的綜合效應(yīng)， 因素水平設(shè)計(jì)如表1 所示，實(shí)驗(yàn)方案設(shè)計(jì)及結(jié)果如表2 所示，正交試驗(yàn)極差分析結(jié)果如表3 所示。結(jié)果表明，3 個(gè)影響因素對(duì)活菌數(shù)的影響主次順序?yàn)閜H＞攪拌轉(zhuǎn)速＞培養(yǎng)溫度， 由均值 k 得出最優(yōu)組合為 A2B2C2，即 pH 為 7.3，培養(yǎng)溫度為45℃，攪拌轉(zhuǎn)速為100 r/min。 從芽孢率角度，3個(gè)影響因素的主次順序與活菌數(shù)相似，但其最優(yōu)組合不同，為 A1B3C3，即 pH 為 6.8，培養(yǎng)溫度為 50 ℃，攪拌轉(zhuǎn)速為150 r/min。

表1 正交試驗(yàn)因素水平Table 1 Orthogonal optimization experimental factors

表2 正交優(yōu)化設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 2 Orthogonal optimization design and results

表3 極差分析Table 3 Range analysis

較高的活菌數(shù)是提高芽孢率的前提， 因此，從優(yōu)化菌株生產(chǎn)性能，提高芽孢率的角度，選擇枯草芽孢桿菌GX2 的活菌數(shù)和芽孢數(shù)均較高的培養(yǎng)條件和方案，確定最優(yōu)方案為A1B3C3，即pH 為6.8，培養(yǎng)溫度為50 ℃，攪拌轉(zhuǎn)速為150 r/min，在此條件下進(jìn)行3 L 發(fā)酵罐試驗(yàn)驗(yàn)證， 結(jié)果表明， 活菌數(shù)可達(dá)1.57×1010CFU/mL， 芽孢數(shù)達(dá) 1.32×1010CFU/mL，芽孢率為84.1%。與單因素優(yōu)化相比，正交試驗(yàn)優(yōu)化可進(jìn)一步提高芽孢桿菌GX2 的芽孢率，是其工業(yè)化生產(chǎn)應(yīng)用的重要參考。

3 討 論

好氧堆肥過(guò)程中添加微生物菌劑已成為促進(jìn)堆肥腐熟、縮短堆肥周期的重要方法之一[1]。 微生物菌劑的作用效果與活菌數(shù)密切相關(guān)，隨著保存時(shí)間的延長(zhǎng)，活菌數(shù)逐漸減少，影響堆肥效果[7]。 芽孢桿菌因其具有較強(qiáng)的抗逆性，能耐熱、酸、堿等不良環(huán)境，有利于微生物菌劑活性的保持，提高產(chǎn)品質(zhì)量及應(yīng)用效果[31]。 Huo 等[32]通過(guò)研究多粘芽孢桿菌孢子和營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞在生物有機(jī)肥貯藏過(guò)程中的活性，發(fā)現(xiàn)純孢子可提高儲(chǔ)存期間的存活率和孢子形成。 優(yōu)化芽孢桿菌的產(chǎn)芽孢條件，促進(jìn)更多營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞轉(zhuǎn)化為芽孢。

培養(yǎng)條件優(yōu)化是產(chǎn)芽孢條件優(yōu)化的重要前提。作者以實(shí)驗(yàn)室保存的堆肥用枯草芽孢桿菌GX2 為研究對(duì)象， 首先進(jìn)行了搖瓶培養(yǎng)條件及培養(yǎng)基優(yōu)化，在此基礎(chǔ)上，采用分批補(bǔ)料策略在3 L 發(fā)酵罐上進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)， 所得發(fā)酵液的OD 值和營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞濃度可達(dá) 2.250 和 1.8×1010CFU/mL。 汪晶晶等[33]通過(guò)對(duì)淀粉芽孢桿菌的培養(yǎng)基及條件優(yōu)化，發(fā)現(xiàn)菌體生長(zhǎng)量有明顯提高，A600nm由1.228 增加至1.6727。

目前，關(guān)于芽孢桿菌芽孢率的優(yōu)化研究多是在搖床上完成的，郭曉軍等[8]對(duì)堆肥用產(chǎn)蛋白酶的產(chǎn)芽孢條件進(jìn)行了優(yōu)化，芽孢率達(dá)95%。劉虎軍等[32]對(duì)枯草芽孢桿菌進(jìn)行了pH 和溫度的產(chǎn)芽孢條件優(yōu)化，生物量和芽孢數(shù)分別為 5.7×1010、5.2×1010CFU/mL，芽孢率達(dá)91%。 為實(shí)現(xiàn)工業(yè)化應(yīng)用，發(fā)酵罐規(guī)模的產(chǎn)芽孢條件優(yōu)化更具參考價(jià)值，為此，作者在搖瓶培養(yǎng)條件優(yōu)化的基礎(chǔ)上， 結(jié)合分批補(bǔ)料發(fā)酵技術(shù)，在3 L 發(fā)酵罐上進(jìn)行了產(chǎn)芽孢條件優(yōu)化， 經(jīng)單因素及正交試驗(yàn)研究，獲得了堆肥用枯草芽孢桿菌GX2的最佳產(chǎn)芽孢條件，即pH 為6.8，培養(yǎng)溫度為50 ℃，攪拌轉(zhuǎn)速為150 r/min，此時(shí)，芽孢濃度為1.32×1010CFU/mL，芽孢率為84.1%，研究結(jié)果可為芽孢桿菌在微生物菌劑中的工業(yè)化應(yīng)用提供重要參考。

4 結(jié) 語(yǔ)

搖瓶培養(yǎng)條件優(yōu)化結(jié)果表明， 枯草芽孢桿菌GX2 的最佳培養(yǎng)基為酪蛋白胨15 g/L、大豆蛋白胨5 g/L、NaCl 5g/L、蔗糖 5 g/L 和 NaNO35 g/L，最佳培養(yǎng)條件為pH 值7.3，250 mL 搖瓶的裝液量為100 mL，培養(yǎng)溫度為45 ℃。

在搖床培養(yǎng)條件優(yōu)化的基礎(chǔ)上， 在3 L 發(fā)酵罐上進(jìn)行分批補(bǔ)料技術(shù)研究， 以進(jìn)一步提高細(xì)胞濃度，結(jié)果表明，當(dāng)發(fā)酵液中總糖濃度降低至起始值的一半以下時(shí)，開(kāi)始補(bǔ)料，共補(bǔ)料兩次，發(fā)酵液中的細(xì)胞濃度可達(dá)1.8×1010CFU/mL。

在獲得較高細(xì)胞濃度后，通過(guò)單因素和正交試驗(yàn)，在3 L 發(fā)酵罐上對(duì)枯草芽孢桿菌GX2 的產(chǎn)芽孢條件進(jìn)行了優(yōu)化，結(jié)果表明，當(dāng)pH 為6.8、培養(yǎng)溫度為50 ℃和攪拌轉(zhuǎn)速為150 r/min 時(shí)， 芽孢率可達(dá)84.1%。