高效酶提取雞肺明膠及其結構與性質的研究

潘佳昕， 楊 恒， 時海波， 張新笑， 鄒 燁， 徐為民， 王道營

（江蘇省農業(yè)科學院 農產品加工所，江蘇 南京 210014）

2017 年，中國的雞肉產量為 1 200 萬噸[1]，雞肺產量約為8.5 萬噸， 但其高值化產品的開發(fā)與綜合利用卻沒有很好地進行。 雞肺難以清洗，故不為人類食用。 目前，雞肺基本以贈送的方式外包給養(yǎng)殖戶作為狐貍和貂等的動物飼料或直接棄置于環(huán)境中，造成副產物資源浪費以及環(huán)境污染。 雞肺干物質中蛋白質質量分數(shù)高達70%，但現(xiàn)有文獻對雞肺的研究極少。 李小勇[2]、王春煥等[3]對豬肺及牛肺中的膠原蛋白進行了提取和純化，為從動物肺中提取蛋白質提供了可行性參考，但有關雞肺膠原蛋白的理化性質研究并未見報道。 明膠是一種從豬、牛、魚等動物性食品副產物中提取的天然高分子化合物，是膠原在酸、堿、酶或高溫下的水解變性產物[4]，可廣泛應用于食品工業(yè)中。

膠原明膠化的過程涉及膠原三螺旋結構的共價交聯(lián)的維系和穩(wěn)定及非共價鍵的破壞，三螺旋結構從而展開，非螺旋結晶區(qū)的破壞使得膠原亞基分子游離出來[5]。 制備明膠預處理的方法主要包括酸法、堿法、酶法、超高壓法等，目前，廣泛應用于生產的只有傳統(tǒng)的酸堿法，而對于酶法制膠的理論研究較少。 伴隨著常規(guī)酸堿法產率低、生產周期長及廢液污染等問題，Singh 等[6]比較了酸和胃蛋白酶預處理的明膠得率和特性，發(fā)現(xiàn)酶法提取率高，且對膠原的三螺旋結構無明顯影響。 超聲波產生的空化效應、機械效應等多重效應不但能加快化學反應的進行，促進蛋白質溶出，還能打開膠原的纖維結構促進酶解[7]。 Kim[8]等發(fā)現(xiàn)超聲輔助乙酸提取鱸魚皮膠原的得率較高。Li[7]等發(fā)現(xiàn)超聲輔助胃蛋白酶提取的膠原與單一酶法比較，得率較高且生產周期縮短。

作者采用超聲輔助酶解法從雞肺中提取明膠，研究超聲輔助酶提明膠的效果及在食品體系中的應用，為肉雞副產物的高值化利用與綜合開發(fā)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

雞肺：常州市立華牧業(yè)有限公司提供；胃蛋白酶（USP 級）：上海源葉生物科技有限公司提供。

超聲波細胞粉碎機（SCIENTZ-IID）：寧波新芝生物科技股份有限公司產品；磁力加熱攪拌器（78-1）：常州國華電器有限公司產品；循環(huán)水式多用真空泵（SHB-Ⅲ）：南京科爾儀器設備有限公司產品；CHRIST 冷凍干燥機（Alpha 1-2 LDplu）：北京五洲東方科技發(fā)展有限公司產品； 差示掃描量熱儀（STA-449C）：德國 NETZSCH 公司產品；圓二色譜儀（Jasco-715）：日本Jasco 公司產品；掃描電子顯微鏡 （EVO-LS10）： 德國 ZEISSE Oberkochen 公司產品；紫外分光光度儀（UV-6100）：上海美普達儀器有限公司產品； 馬爾文激光粒度分析 （Zetasizer Nano Zs90）：英國Malvern 儀器有限公司產品；分散均質機T25：德國IKA 公司產品。

1.2 試驗方法

1.2.1 雞肺除雜雞肺雜蛋白質去除參照李越[9]的方法，并加以修改。

1.2.2 常規(guī)熱水提取雞肺明膠參考張思琦[10]的方法提取明膠，并作改進。

1.2.3 超聲輔助酶解提取雞肺明膠取10 g 脫雜雞肺， 溶于 0.5 mol/L 乙酸，200 W 超聲處理 10 min，超聲處理器工作 2 s，停歇 3 s。 隨后于 42 ℃恒溫水浴鍋中150 r/min 磁力攪拌，加胃蛋白酶1 mL，酶提 4 h， 反應結束后 100 ℃滅酶 10 min。 放置室溫，再將樣品通過真空抽濾瓶抽濾，收集濾液，倒入干凈的表面皿， 于-40 ℃冰箱冷凍， 最后冷凍干燥24 h，收集樣品。

1.2.4 明膠得率的計算明膠的得率根據(jù)Nagarajan[11]等報道的方法測定，以去雜原料與制得樣品經冷凍干燥后的質量的比值計。

1.2.5 熱穩(wěn)定性明膠的玻璃轉化溫度用差示掃描量熱（DSC）儀測定，參考汲聰玲[12]的方法。 精準稱量8 mg 樣品蛋白于鋁坩堝中，加蓋密封，設置溫度的掃描范圍為 20～200 ℃，升溫速率為 2 ℃/min。 以空鋁坩堝為參比。

1.2.6 圓二色譜 （CD）明膠溶液的近紫外圓二光譜變化通過圓二色譜儀測定。 將制備的樣品配制成質量濃度為0.1 mg/mL 蛋白溶液， 注入1 mm 厚的樣品池。 設置掃描范圍為190～260 nm，掃描速度為50 nm/min，光譜間隔為1.0 nm。CD 數(shù)據(jù)以平均橢圓率表示，采用CD Pro 軟件分析明膠的二級結構。

1.2.7 聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）分析配制分離膠（12 g/dL）和濃縮膠（5 g/dL），明膠的亞基組分測定參照汲聰玲[12]的方法并作改進。 將明膠溶液與pH 8.8 的0.06 mol/L Tris-HCl 緩沖液、質量分數(shù) 25%甘油、2% SDS、0.1%溴酚藍、5% β-巰基乙醇混合，沸水煮 10 min 后 10 000 g 離心 3 min，取 10 μL上清液上樣。用相對分子質量為11 000～135 000 的蛋白Markers 做對照。 加入電泳緩沖液 （質量分數(shù)0.1% SDS、0.192 mol/L 甘 氨 酸 、0.025 mol/L Tris-HCl），在 16 mA 電流下進行 30 min 電泳后，調節(jié)電流強度為32 mA 繼續(xù)進行1.5 h。 電泳結束后，取用R-250 考馬斯亮藍對其染色30 min，然后用混合液（體積分數(shù)20%乙醇與80%蒸餾水） 脫色至能辨清條帶為止。

1.2.8 紫外吸收光譜掃描雞肺明膠的紫外吸收光譜采用紫外分光光度儀測定。 取適量明膠水解液，在190～500 nm 波長范圍內，設置分辨率為0.5 nm，用紫外分光光度儀對明膠溶液進行掃描。 以去離子水為參比。

1.2.9 粒徑分布采用馬爾文激光粒度分析儀檢測明膠顆粒的分布。 設置高穩(wěn)定氦-氖激光器的光源為633 nm，固體藍光光源波長為466 nm，掃描速度為 1 000 次/秒， 重復性誤差≤±0.5%， 準確性誤差≤±1.0%。 取 0.5 mol/L 乙酸的多分散系數(shù)（Polydispersity Index） 為 1.320， 明膠的散射指數(shù)（refractive index of the scatterers）為 1.500。 以濕法進樣，每個樣品測3 次，取平均值。

1.2.10 掃描電鏡（SEM）取凍干后的明膠切片，置于EVO-LS10 型掃描電子顯微鏡的樣品艙中，在15 mA 的電流下噴金90 s。 取出置于掃描電鏡觀察室，以200 倍的放大倍數(shù)，選取不同位置的數(shù)點，調節(jié)圖像至清晰，觀察并拍攝雞肺明膠的微觀結構。

1.2.11 乳化性利用濁度法測定明膠的乳化活性（EAI）和乳化穩(wěn)定性（ESI）。 用磷酸鈉鹽緩沖溶液（PBS，0.1 mol/L）配制 10 g/L 明膠溶液 12 mL，并調節(jié)pH 至3.0，加入花生油5 mL。 采用均質機將混合液于10 000 g 下均質1 min，制得乳狀液，分別在0 min 和 10 min 時從容器底部取 50 μL，加入 5 mL質量分數(shù)0.1%的SDS， 混勻后以質量分數(shù)0.1%的SDS 溶液作參比， 立即測定其在500 nm 處的吸光度 A0，10 min 后，測吸光度值 A10。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

采用SPSS19.0 統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)處理，樣品作3 次平行試驗。 用組間 ANOVA 進行統(tǒng)計分析，Turkey 檢驗用于組間數(shù)據(jù)分析，P＜0.05，表示兩組之間差異顯著，并用Origin 8.0 軟件作圖。

2 結果與分析

2.1 明膠得率和效率

明膠的得率為干燥后明膠干質量（g）與脫雜雞肺干質量（g）的比例。 本試驗中，胃蛋白提取的雞肺明膠得率為30.08%，比常規(guī)熱水提取的雞肺明膠得率（8.77%）提高了2.43 倍。通常，魚皮明膠的得率為50%左右[13]，雞肺中的雜蛋白較多，并且雞肺的韌性及分子內與分子間的交聯(lián)程度較高， 導致雞肺明膠的提取率較低， 僅高于經常規(guī)熱水提取法制得的軍曹魚 （13.8%）[14]、 舌鰨 （10.3%）[14]、 羅非魚魚鱗（7.08%）[15]等少數(shù)魚源明膠。

2.2 熱穩(wěn)定性

明膠的熱變性溫度通過差示量熱掃描（DSC）法進行測定。加熱過程的DSC 曲線中的吸熱峰所對應的轉變斜線中點即為明膠的熱變性溫度，它表示明膠分子的結構由螺旋向卷曲轉變[16]。圖1 顯示，明膠胃蛋白酶提取的熱變性溫度為90.22 ℃， 略低于常規(guī)熱水提取，這一結果與陳日春[17]的研究相符，通常酸法提取的膠原蛋白變性溫度稍高于酶法提取的膠原蛋白。 明膠分子的交聯(lián)作用越多，其變性溫度越高[18]，表明胃蛋白酶提取的明膠分子間的交聯(lián)程度較高。 試驗提取的雞肺明膠的熱變性溫度高于一般的魚類明膠，如黃華雙[19]提取的魚鱗明膠（27 ℃）以及劉全嬌[20]提取的羅非魚皮明膠（76.36 ℃）。因此雞肺明膠具有熱變性溫度高的優(yōu)勢，可通過復合改性制備可食性膜用于食品的天然包裝中，因為其既不會因為溫度的升高在保存期內熔化，又方便產品的運輸。 此外也可作為穩(wěn)定劑和增稠劑添加至對溫度敏感的冷品，如冰淇淋、酸奶等食品中，能更好地抑制結晶[21]，降低熔化速度，使產品組織更堅實細膩。

圖1 雞肺明膠的DSC 曲線Fig.1 DSC curves of chicken lung gelatin films

2.3 圓二色譜（CD）

通常， 膠原在CD 光譜圖中會表現(xiàn)出典型的三股螺旋結構的分子特征， 即在220～230 nm 和200 nm 處分別出現(xiàn)正吸收峰和負吸收峰[22]。 由圖2 可見， 超聲輔助酶提明膠在201 nm 波長處存在負吸收峰，在223 nm 波長出現(xiàn)了一定程度的正吸收峰。220～230 nm 波段的正值吸收對應蛋白質α-螺旋[23]，胃蛋白酶切斷膠原分子的N 及C 端的非膠原性肽[24]，對膠原的三螺旋結構無明顯影響，但會導致α鏈的降解[25]，導致正吸收峰不明顯。 有研究表明，負峰強度越大，無規(guī)則卷曲程度越大[26]，圖2 中胃蛋白酶提取的明膠的負峰強度明顯小于常規(guī)熱水提取的明膠，膠原的三螺旋結構較為完好，與鄭雅爻等[27]的測試結果相符。 利用胃蛋白酶提取的明膠形成類膠原三股螺旋結構[28]， 天然膠原的α-螺旋部分解鏈，但仍維持著膠原的三螺旋結構，說明超聲輔助酶提明膠的二級結構更加有序。

圖2 雞肺明膠的CD 圖Fig.2 The CD spectra of gelatin extracted from chicken lung films

2.4 SDS-PAGE 分析

采用SDS-PAGE 檢測明膠樣品的亞基組成與相對分子質量分布，明膠分子包含 α1、α2、β 這 3 條鏈，相對分子質量在 130 000～250 000 之間[9]。 雞肺膠原轉變?yōu)槊髂z的過程涉及次級鍵的斷裂，隨機斷裂的鍵造成了膠原水解產物組分的多樣化，明膠分子既可能是單鏈，也可能是α 鏈片段的共價交聯(lián)體[29]。 如圖3，電泳條帶2 顯示，常規(guī)熱水提取的雞肺明膠組分包括α1、α2 鏈，以及不清晰的小分子片段，與李越[9]在SDS-PAGE 圖譜中觀察到的市售明膠類似。 雞肺胃蛋白酶提取的明膠電泳條帶1 沒有明顯的 α1、α2、β 這 3 條鏈對應的電泳條帶中出現(xiàn)45 000～95 000 之間的一些占絕大部分的蛋白降解條帶，沒有明顯的 α1、α2、β 這 3 條鏈對應的電泳條帶。 在酸性條件下用胃蛋白酶處理可切斷膠原分子N 及 C 端的非膠原性肽[24]，導致 α1、α2 鏈的展開。超聲波可以對雞肺膠原的三螺旋結構造成輕微降解，氫鍵的斷裂使得肽鏈變得松散，利于后期酸性pH 條件下的酶處理。 隨著酶解時間的延長，加熱過程中膠原的肽端受到破壞， 分子間的共價鍵斷裂，高分子組分更容易降解，明膠分子游離出來。 孫藝等[30]在提取大目金槍魚皮明膠中的發(fā)現(xiàn)，內源性蛋白酶的存在使明膠降解為小分子，電泳條帶1 中出現(xiàn)了低于45 000 的幾條模糊的小分子蛋白條帶，可能是由于進一步的酶解， 明膠斷裂為更小的分子。也可能是在酸性條件下浸提使明膠發(fā)生了熱降解[26]，溶脹的膠原由于其疏松的結構在熱水提取時更容易降解。

圖3 雞肺明膠的SDS-PAGE 圖Fig.3 SDS-PAGE electrophoresis pattern of gelatin from chicken lung

2.5 紫外吸收光譜圖

明膠中由于存在 C＝O、CONH2、—COOH 等發(fā)色基團， 紫外特征吸收峰通常出現(xiàn)在220 nm 波長左右[31]，結果見圖4。 與圖中曲線吸收峰（229 nm）吻合，證明明膠肽鏈分子中存在酰胺鍵[32]，雞肺明膠溶液的紫外吸收光譜與Chandra[32]等的結果類似。大多數(shù)蛋白質中存在的一些芳香族氨基酸殘基在波長270～280 nm 處存在紫外吸收峰，在一般經純化的明膠中不會出現(xiàn)，超聲輔助酶提明膠與常規(guī)熱水提取的明膠在280 nm 處有微量吸收， 說明明膠樣品中只含有少量芳香族氨基酸，可以初步判斷試驗提取的雞肺明膠具有較高的純度。 超聲輔助酶提明膠的雜峰較常規(guī)熱水提取的明膠雜峰更明顯。

2.6 粒徑分布

由圖5 可知，超聲輔助胃蛋白酶提取的明膠平均粒徑為396 nm，小于常規(guī)熱水提取。 超聲波處理會改變明膠的二級結構，Yu 等[33]的研究表明超聲波處理過的明膠，其平均粒徑顯著下降。 可能是由于超聲波的物理效應對分子間靜電作用的破壞以及氣穴效應產生的強剪切力[34]，使得后續(xù)酶解過程中膠原的三螺旋結構解鏈程度較高，分子間的交聯(lián)鍵斷裂更為徹底，大分子蛋白進一步降解得到明膠亞基，與SDS-PAGE 分析所得結果一致。

圖4 雞肺明膠的紫外圖譜Fig.4 Ultraviolet absorption spectra of gelatin from chicken lung

圖5 雞肺明膠的粒徑分布Fig.5 Particle size distribution of gelatin from chicken lung

2.7 掃描電鏡（SEM）

雞肺明膠的微觀結構利用SEM 觀察，與常規(guī)熱水提取的雞肺明膠（圖6（b））相比，經過超聲輔助酶提取的明膠化膠原（圖6（a）），表面有較大程度的破碎，甚至出現(xiàn)較多的孔洞，這一變化與陳書霖等[35]研究的不同酸預處理下鰱魚皮明膠的表觀類似。 在酸性條件下膠原分子間的排斥力會增強，結果導致膠原在乙酸浸泡過程中逐漸發(fā)生溶脹，膠原表觀被明顯破壞。 超聲波對明膠的分子結構起到疏松的效果[36]，雞肺膠原蛋白間原本緊密的交聯(lián)變得松散，有利于后期在酸性條件下進行的酶解，使分子間的共價交聯(lián)和非共價鍵斷裂，大分子的膠原蛋白絕大多數(shù)被降解為小分子的膠原亞基，可能導致分子間疏水基團的暴露，明膠化膠原呈無規(guī)則卷曲狀。 超聲輔助酶提明膠具有疏松孔洞的結構特點，在糖果工業(yè)中，可作為攪打劑應用于軟糖的生產，起吸水、增大體積、維持形態(tài)的作用。

圖6 雞肺明膠的微觀結構（×200）Fig.6 Microstructure of gelatin from chicken lung（×200）

2.8 乳化性

明膠作為一種親水、親油的表面活性劑，肽鏈的疏水基團使其具有一定的乳化性[37]，可以阻止晶體或離子的聚集，穩(wěn)定非均相懸浮液。 高速勻漿機的分散作用使得明膠分子與油滴界面接觸的數(shù)量增多，溶液中的明膠蛋白覆在油滴表面形成水包油的狀態(tài)。 制備的兩種明膠的乳化活性無明顯差異，其中超聲輔助酶提明膠的乳化穩(wěn)定性 （（139.92±9.8） min）略低于常規(guī)熱水提取明膠（（148.72±11.3）min），但仍顯著高于鯰魚皮明膠[38]（＜60 min）。 乳液中分子間的吸引力與運動碰撞形成了較大的液滴，其表面的解吸附作用使得液滴變得不穩(wěn)定，均質后的明膠會出現(xiàn)一些較大的乳液液滴。 明膠分子與油滴界面間的疏水平衡隨著明膠溶解度的降低而被破壞，超聲輔助酶提明膠的乳化穩(wěn)定性由于乳液粒徑的增大而出現(xiàn)下降，可通過添加表面活性劑或修飾側鏈基團對酶提明膠進行改性。

3 結 語

以雞肺為原料提取明膠，通過分析其結構和乳化性，探究超聲輔助酶法的影響。 研究發(fā)現(xiàn)，在超聲波和胃蛋白酶的作用下，雞肺明膠的相對分子質量降低， 表面微觀結構疏松破碎， 平均粒徑減小13.7%。 試驗結果表明，雞肺明膠具有較高的純度，與常規(guī)熱水法相比，超聲輔助酶提明膠的生產周期顯著縮短，得率顯著提高，具有良好的熱穩(wěn)定性與乳化穩(wěn)定性，二級結構更為有序，可作為魚源明膠的替代品。