金針菇菌渣飼料中添加纖維素酶及甘露寡糖對草魚生長、腸道結(jié)構(gòu)及血清生理生化指標的影響

朱 波 趙青海 鐘 蕾 胡 毅*

（1.湖南農(nóng)業(yè)大學動物科學技術(shù)學院，湖南長沙410128；2.水產(chǎn)高效健康生產(chǎn)湖南省協(xié)同創(chuàng)新中心，湖南常德415000）

金針菇菌渣是收集金針菇子實體后廢棄的培養(yǎng)基基質(zhì)，其中含有多種必需氨基酸、大量未分解的纖維素及部分子實體殘體。據(jù)中國食用菌協(xié)會統(tǒng)計，2018 年全國金針菇產(chǎn)量為257.6 萬噸，按菌渣量為子實體產(chǎn)量的25%～33%計算[1]，金針菇菌渣年產(chǎn)量將達64.4萬噸以上。將金針菇菌渣應用于水產(chǎn)飼料，不僅能減少資源浪費，還可降低養(yǎng)殖成本。但現(xiàn)有研究表明飼料中高含量的金針菇菌渣可能會抑制動物生長，降低飼料表觀消化率，影響機體抗氧化性能[2-3]。因此需尋求適宜的途徑以提高金針菇菌渣的添加量。纖維素酶來源廣泛，從細菌或真菌中均可提取，它可破壞纖維素結(jié)構(gòu)從而提高動物對粗纖維飼料的消化率。纖維素酶能提高草魚[4]攝食率，改善大西洋鮭[5]后腸形態(tài)，增強動物非特異性免疫力[6]。甘露寡糖可從酵母細胞壁中提取，作為一種免疫增強劑，可改善水產(chǎn)動物腸道消化功能，提高增重率[7-9]。甘露寡糖還可增強動物免疫性能，提高抗應激能力，降低頭腎組織炎癥反應[10-13]。因此本實驗以我國淡水人工養(yǎng)殖產(chǎn)量最大的草魚為研究對象，在草魚高金針菇菌渣飼料中添加纖維素酶及甘露寡糖喂養(yǎng)草魚，通過研究草魚生長性能、腸道結(jié)構(gòu)、血清生化指標的變化。以期提高金針菇菌渣在水產(chǎn)動物配合飼料中的應用效果。

1 材料與方法

1.1 實驗材料與配方

實驗所用纖維素酶(Cellulase，活性為20 000 U/g)、甘露寡糖（Mannose oligosaccharide，MOS）購自青島瑪斯特生物技術(shù)有限公司。以商品飼料作為空白對照組飼料（Ⅰ組），在空白對照組飼料中添加15%的金針菇菌渣配制對照組飼料（Ⅱ組），在對照組飼料中分別添加0.05%的纖維素酶（Ⅲ組）、0.05%的甘露寡糖（Ⅳ組）配制2組實驗飼料，共配制成4組等氮等脂實驗飼料。飼料組成及營養(yǎng)水平見表1。

1.2 實驗魚與養(yǎng)殖管理

養(yǎng)殖實驗于湖南省婁底市新化縣車田江水庫的聚乙烯網(wǎng)箱（1.5 m×1.5 m×1.5 m）中進行。魚苗購自湖南省湘潭市某苗種場，魚苗購入后于水庫網(wǎng)箱暫養(yǎng)一個月，以適應養(yǎng)殖環(huán)境。每組設置3 個重復網(wǎng)箱，每個網(wǎng)箱隨機挑選40 尾規(guī)格一致，均重為（20.01±0.05）g 的草魚。養(yǎng)殖實驗持續(xù)56 d，每天投喂3 次（07：00，12：00，17：00），投餌率為體重的3%～5%。養(yǎng)殖期間水溫26.0～31.5 ℃，水體溶氧（6.8±0.5）mg/L，氨氮≤0.21 mg/L。

表1 實驗飼料組成及營養(yǎng)水平（風干基礎(chǔ)，%）

1.3 樣品采集

采樣前，實驗魚預先饑餓24 h。實驗開始及結(jié)果分別稱量每個網(wǎng)箱草魚的總重量，記錄總尾數(shù)，用以計算增重率、飼料系數(shù)、存活率。實驗結(jié)束后每個實驗箱隨機取3尾草魚麻醉后于冰盤上迅速解剖，稱取個體重、肝重、腸重用于計算肝體比、腸體比；每個網(wǎng)箱隨機選取3 尾草魚，解剖后取中腸，使用多聚甲醛溶液固定，用于制作腸道組織切片；每個網(wǎng)箱隨機取4 尾草魚，取中腸，裝于1.5 mL 無酶管，-80 ℃保存用以測定腸道消化酶活性。每個網(wǎng)箱隨機取6尾草魚，使用丁香油麻醉后從尾靜脈取血，裝于1.5 mL離心管中，在4 ℃下靜置12 h 后，于離心機3 000 r/min 離心10 min，取上清液，保存于-80 ℃冰箱待測。

1.4 指標測定

1.4.1 生長指標測定

生長指標計算參照朱波等[3]公式計算。

存活率（survival rate，%）=100×Ne/Ns

飼料系數(shù)（diet conversion rate）=Wr/（We-Ws+Wd）

增重率（weight gain rate，%）=100×（Wea-Wsa）/Wsa

肥滿度（condition factor，g/cm3）=Wb/L3

肝體比（hepatosmatic index，%）=100×Wl/Wb

腸體比（viserosomatic index，%）=100×Wc/Wb

式中：Ne——每箱草魚終末尾數(shù)(尾)；

Ns——每箱初始尾數(shù)(尾)；

Wr——攝入飼料總量(g)；

We——每箱終末總重(g)；

Ws——初始總重(g)；

Wd——每箱死亡個體重(g)；

Wea——每箱終末均重(g)；

Wsa——初始均重(g)；

Wb——采樣個體重(g)；

L——采樣個體長(cm)；

Wl——采樣個體肝重(g)；

Wc——采樣個體腸重(g)。

1.4.2 腸道消化酶活性測定、腸道結(jié)構(gòu)觀察

腸道樣品在測定前于冰盒中解凍，稱重。待測組織用生理鹽水進行勻漿，2 500 r/min 離心10 min，取上清液測定總蛋白含量（Total protein），淀粉酶（Amy?lase）、脂肪酶（Lipase）活性。另稱取腸道組織樣用胰蛋白酶勻漿液進行勻漿，2 500 r/min 離心10 min，取上清液測定胰蛋白酶（Trypsin）活性。消化酶試劑盒購自南京建成生物工程研究所。

使用光學顯微鏡觀察草魚中腸組織結(jié)構(gòu)，于100倍下測定絨毛高度、肌層厚度；于400 倍下進行杯狀細胞計數(shù)。

1.4.3 血清生化與免疫指標測定

血清補體C3、C4、免疫球蛋白M含量采用酶聯(lián)免疫吸附法測定，所用試劑購自浙江伊利康生物技術(shù)有限公司。其余血清生化指標均采用南京建成生物工程研究所的相應試劑盒測定。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

采用Microsoft Excel 2016和SPSS 19.0 軟件進行單因素方差分析（One-Way ANOVA），用Duncan's 多重法比較組間差異性，當P＜0.05 時表示差異顯著，數(shù)據(jù)表示為“平均值±標準誤”。

2 結(jié)果

2.1 纖維素酶及甘露寡糖對草魚生長和形體指標的影響（見表2）

表2 纖維素酶及甘露寡糖對草魚生長及形體指標的影響（n=3）

由表2可知，與Ⅰ組比較，Ⅱ組草魚增重率及飼料系數(shù)無顯著差異（P＞0.05）；Ⅲ組及Ⅳ組增重率均顯著高于Ⅱ組及Ⅰ組（P＜0.05）。而草魚存活率、飼料系數(shù)、肥滿度、肝體比及腸體比，各組間沒有顯著差異（P＞0.05）。

2.2 纖維素酶及甘露寡糖對草魚腸道消化酶活性的影響（見表3）

表3 纖維素酶及甘露寡糖對草魚腸道消化酶活性的影響（n=3）

由表3可知，Ⅱ組草魚腸道淀粉酶及脂肪酶活性顯著低于Ⅰ組(P＜0.05)。Ⅲ組草魚腸道淀粉酶及胰蛋白酶活性顯著高于Ⅱ組及Ⅰ組(P＜0.05)。Ⅳ組草魚腸道淀粉酶、脂肪酶及胰蛋白酶活性顯著高于Ⅱ組及Ⅰ組(P＜0.05)。

2.3 纖維素酶及甘露寡糖對草魚中腸組織結(jié)構(gòu)的影響（見表4、圖1）

由表4可知，Ⅱ組草魚中腸肌層厚度顯著大于Ⅰ組（P＜0.05），Ⅲ組及Ⅳ組中腸肌層厚度與Ⅱ組沒有顯著差異（P＞0.05），但均顯著大于Ⅰ組（P＜0.05）。Ⅲ組腸道絨毛高度及杯狀細胞數(shù)目顯著高于Ⅱ組及Ⅰ組（P＜0.05）。Ⅳ組杯狀細胞數(shù)目顯著多于Ⅱ組及Ⅰ組（P＜0.05）。

表4 纖維素酶及甘露寡糖對草魚腸道結(jié)構(gòu)的影響（n=3）

由圖1 可知，與Ⅰ組比較，Ⅱ組草魚中腸絨毛密度減小，腸絨毛結(jié)構(gòu)受損；而與Ⅱ組相比，Ⅲ組及Ⅳ組草魚腸道絨毛密度增大，腸道絨毛杯狀細胞數(shù)目顯著增加，Ⅲ組絨毛高度顯著增加。兩組添加劑均可一定程度促進腸道發(fā)育。

2.4 纖維素酶及甘露寡糖對草魚血清生化指標的影響（見表5）

由表5 可知，Ⅱ組草魚血清谷草轉(zhuǎn)氨酶、谷丙轉(zhuǎn)氨酶活性，總膽汁酸含量顯著高于Ⅰ組（P＜0.05）；Ⅲ組及Ⅳ組草魚血清尿素氮含量顯著低于Ⅱ組及Ⅰ組（P＜0.05）；Ⅳ組谷草轉(zhuǎn)氨酶、谷丙轉(zhuǎn)氨酶活性、總膽汁酸、總膽固醇含量顯著低于Ⅱ組（P＜0.05）。而Ⅲ組谷草轉(zhuǎn)氨酶、谷丙轉(zhuǎn)氨酶活性、總膽汁酸、總膽固醇及三酰甘油含量與Ⅱ組沒有顯著差異（P＞0.05）。

2.5 纖維素酶及甘露寡糖對草魚血清免疫及抗氧化功能的影響（見表6）

由表6 可知。Ⅱ組草魚血清補體3、免疫球蛋白M、抗超氧陰離子含量顯著低于Ⅰ組（P＜0.05），丙二醛含量顯著高于Ⅰ組（P＜0.05）。Ⅲ組及Ⅳ組補體3、免疫球蛋白M含量顯著高于Ⅱ組（P＜0.05），超氧化物歧化酶活性及抗超氧陰離子含量顯著低于Ⅱ組（P＜0.05）。Ⅳ組丙二醛含量顯著低于Ⅱ組（P＜0.05）。

圖1 草魚中腸組織切片圖

表5 纖維素酶及甘露寡糖對草魚血清生理生化指標的影響（n=3）

表6 纖維素酶及甘露寡糖對草魚血清免疫及抗氧化指標的影響（n=3）

3 討論

3.1 纖維素酶及甘露寡糖對草魚生長與腸道組織結(jié)構(gòu)的影響

生長性能是水產(chǎn)動物人工養(yǎng)殖最直觀有效的評價指標之一。水產(chǎn)動物對飼料營養(yǎng)的吸收主要在腸道進行，腸道的消化功能直接影響水產(chǎn)動物生長。在本實驗中，添加金針菇菌渣對草魚增重率沒有顯著影響，但降低了草魚腸道淀粉酶及脂肪酶活性。而在金針菇菌渣飼料中添加纖維素酶或甘露寡糖均可提高草魚增重率。與增重率變化相適應的是兩種添加劑均提高了草魚腸道淀粉酶及胰蛋白酶活性，消化酶活性甚至高于空白對照組水平。纖維素酶能提高草魚增重率可能與金針菇菌渣具有較高水平的粗纖維有關(guān)[14]。纖維素構(gòu)成的植物細胞壁阻礙了腸道對飼料的消化，導致對照組草魚腸道消化酶活性下降，而添加纖維素酶可裂解細胞壁[15]，提高飼料中植物原料的利用率。有研究報道，飼料中添加纖維素酶能提高大西洋鮭魚生長性能[5]，還可提高虹鱒魚對飼料營養(yǎng)元素的表觀消化率[16]。添加甘露寡糖可提高草魚增重率與在克氏原螯蝦[8]及虹鱒[10]的研究結(jié)果一致。甘露寡糖可通過調(diào)節(jié)腸道黏膜菌群結(jié)構(gòu)以消除病原菌[17]，維護腸道菌群的平衡發(fā)展，進而改善機體健康，促進生長性能[18]。還有研究得出甘露寡糖可增加歐洲鱸腸道黏膜細胞數(shù)目[19]而不影響后腸褶皺長度與寬度[20]。本實驗中，添加金針菇菌渣使草魚腸道肌層厚度上升，可能是飼料粗纖維水平提高，促進消化道蠕動，導致腸道肌層厚度適應性增加。杯狀細胞能分泌黏蛋白[21]，形成黏膜屏障以保護腸道[22]，腸絨毛是吸收營養(yǎng)的主要結(jié)構(gòu)，添加纖維素酶及甘露寡糖可增加草魚中腸杯狀細胞數(shù)目，添加纖維素酶可提高腸道絨毛高度，這可能也是草魚生長性能提高的原因之一。

3.2 纖維素酶及甘露寡糖對草魚血清生化指標的影響

轉(zhuǎn)氨酶參與肝臟中氨基酸代謝，總膽汁酸是三酰甘油代謝產(chǎn)物，他們在血清中的含量可作為肝臟結(jié)構(gòu)及代謝障礙的參考指標。從本實驗的結(jié)果來看，對照組草魚血清谷草轉(zhuǎn)氨酶、谷丙轉(zhuǎn)氨酶活性及總膽汁酸含量相比于空白對照組顯著增加，金針菇菌渣飼料可能影響了草魚肝組織結(jié)構(gòu)或代謝功能，而在金針菇菌渣中添加甘露寡糖可顯著降低草魚血清谷草轉(zhuǎn)氨酶活性及總膽汁酸含量，甘露寡糖具有改善肝組織結(jié)構(gòu)與功能的作用。有研究得出甘露寡糖可提高虹鱒肝臟免疫蛋白HAPT、SAA和LECT2基因表達水平[11]，也能在嗜水氣單胞菌感染異育銀鯽后，提高魚體肝臟應激蛋白HSP70 的基因表達水平[23]。尿素氮是蛋白質(zhì)代謝產(chǎn)物，在肝臟產(chǎn)生經(jīng)由腎臟排出。血清尿素氮含量與攝入蛋白質(zhì)的數(shù)量和質(zhì)量有關(guān)[24]，可反映機體對蛋白質(zhì)的代謝率。血清尿素氮含量降低，說明機體對蛋白質(zhì)的利用率提高，增加了氮的沉積率[2]。纖維素酶組及甘露寡糖組草魚血清尿素氮含量降低，說明纖維素酶及甘露寡糖可提高草魚氮沉積率，改善腎臟功能。三酰甘油及總膽固醇是血清主要脂類[25]。從本實驗的結(jié)果來看，甘露寡糖可以顯著降低草魚血清總膽固醇含量，三酰甘油含量也有一定程度的降低，這與在大菱鲆[26]中的研究得到的結(jié)果一致。甘露寡糖具有提高草魚脂肪代謝的作用，草魚腸道脂肪酶活性的提高驗證了這一點。

3.3 纖維素酶及甘露寡糖對草魚血清免疫及抗氧化指標的影響

補體廣泛分布于動物體液及細胞表面，可介導免疫和炎癥反應，通過改變吞噬細胞和病原細胞表面分子構(gòu)象消除抗原。IgM 具有強大的殺菌、激活補體、免疫調(diào)理作用。本實驗中，對照組草魚血清C3及IgM含量顯著低于空白對照組，這可能是金針菇菌渣中的黃曲霉毒素等物質(zhì)影響草魚健康，改變了血清免疫物質(zhì)含量[14]，而在金針菇菌渣中添加纖維素酶或甘露寡糖均可顯著增加血清C3 及IgM 的含量。有研究得出甘露寡糖可提高線鱧血清免疫球蛋白含量及溶菌酶活性，進而提高魚體免疫力[12]。而纖維素酶提高了草魚對飼料營養(yǎng)的利用率，間接提高了草魚免疫應答能力，促進了相關(guān)免疫因子的合成。SOD、ASAFR 可清除活性氧自由基，MDA是脂質(zhì)氧化產(chǎn)物。本實驗中，對照組與空白對照組相比，草魚血清MDA 含量顯著上升，機體脂質(zhì)氧化程度增加，而血清抗氧化物質(zhì)ASAFR 含量卻減少，草魚抗氧化能力下降，這可能與高含量金針菇菌渣中一些霉菌毒素的累積有關(guān)[14]；而在金針菇菌渣中添加甘露寡糖后，草魚血清MDA 含量顯著下降，膜脂氧化程度降低。甘露寡糖可調(diào)節(jié)水產(chǎn)動物腸黏膜屏障，刺激局部和全身免疫系統(tǒng)，增強機體抗菌能力，促進非特異性免疫反應[27-29]，是良好的免疫增強劑。甘露寡糖還可清除機體內(nèi)的活性氧，保護細胞免受氧自由基的攻擊，而氧自由基的減少可能是超氧化物歧化酶活性及抗超氧陰離子含量下降的原因之一。添加纖維素酶后草魚血清SOD 活性、ASAFR 含量顯著下降，而MDA 含量與對照組沒有顯著差異，原因可能是在水產(chǎn)動物飼料中纖維素酶的添加量超過適宜范圍后，會對水產(chǎn)動物非特異性免疫產(chǎn)生負面作用[6，30]。

4 結(jié)論

①飼料中添加15%的金針菇菌渣會影響草魚肝臟、腸道組織結(jié)構(gòu)與功能，降低抗氧化性能。

②在金針菇菌渣飼料中添加0.05%的纖維素酶可提高草魚增重率，改善腸道結(jié)構(gòu)與功能；而添加0.05%的甘露寡糖可以提高草魚增重率，增強腸道消化酶活性，提高機體非特異性免疫力。添加纖維素酶或甘露寡糖可促進金針菇菌渣在草魚飼料中的應用。