精養(yǎng)池模式下不同生長速度花鰻鱺的腸道菌群比較研究

王 悅 趙盼月 陳學(xué)豪，2 翟少偉，2*

（1.集美大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院，鰻鱺現(xiàn)代產(chǎn)業(yè)技術(shù)教育部工程研究中心，福建廈門361021；2.福建省水產(chǎn)生物育種與健康養(yǎng)殖工程研究中心，福建廈門361021）

花鰻鱺（Anguilla marmorata）是屬于鰻鱺目（An?guilliformes）、鰻鱺科（Anguillidae）的降海洄游性魚類，在全球的熱帶、亞熱帶西太平洋和印度洋海域均有廣泛分布，在我國主要分布于東南沿海及臺(tái)灣省[1-2]。近年來由于日本鰻鱺（Anguilla japonica）和歐洲鰻鱺（Anguilla anguilla）鰻苗的過度捕撈和環(huán)境問題導(dǎo)致天然捕撈量逐漸減少，價(jià)格急劇攀升[1，3]。而花鰻鱺在世界范圍分布較廣，其鰻苗價(jià)格較為便宜，在我國東南部地區(qū)具有一定的養(yǎng)殖規(guī)模[1,4]。

腸道是魚類消化飼料和營養(yǎng)物質(zhì)吸收的主要部位，具有特殊的微生物群，腸道菌群對(duì)魚類的生長和健康起著重要作用，其組成與魚體生長速度密切相關(guān)，生長速度快的個(gè)體可能擁有更多的腸道益生菌[5-8]。通過比較不同生長速度的魚類腸道菌群的組成，可為腸道原籍益生菌的篩選提供參考。研究表明，原籍益生菌比一般的益生菌更容易在魚類的腸道內(nèi)定植，在維持腸道健康，包括促進(jìn)宿主的生長，產(chǎn)生消化酶和必需營養(yǎng)素，抵抗病原體的感染，刺激先天免疫系統(tǒng)等方面的作用更強(qiáng)[8-9]?；狑~在實(shí)驗(yàn)室循環(huán)水養(yǎng)殖條件下的快速生長個(gè)體腸道內(nèi)擁有更多的益生菌[6]，而其在實(shí)際生產(chǎn)條件下不同生長速度個(gè)體間的腸道微生物差異情況還未見報(bào)道。因此，本研究旨在比較分析花鰻鱺主要的養(yǎng)殖模式——水泥池精養(yǎng)（精養(yǎng)池）條件下不同生長速度個(gè)體腸道菌群的差異，為腸道原籍益生菌的篩選提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物與試驗(yàn)設(shè)計(jì)

試驗(yàn)所用花鰻鱺取自福建龍巖大泉鰻魚養(yǎng)殖有限公司養(yǎng)殖場的方形水泥精養(yǎng)池中（面積為324 m2、水深1 m），養(yǎng)殖時(shí)間為12 個(gè)月。按魚體重量分為三組，即緩慢生長組（SG）、中速生長組（MG）和快速生長組（FG），不同組花鰻鱺平均重量分別為（83.65±9.60）g/尾、（216.98±19.97）g/尾和（386.73±51.90）g/尾；每組6個(gè)重復(fù)。

1.2 試驗(yàn)飼料與飼養(yǎng)管理

試驗(yàn)期間投喂福建天馬科技集團(tuán)股份有限公司生產(chǎn)的黑仔鰻粉狀飼料，主要營養(yǎng)成分為：粗蛋白47.90%、粗脂肪6.34%、粗灰分12.12%、水分6.56%、鈣2.77%、總磷1.9%。每天6：00和18：00飽食投喂，投喂時(shí)在飼料中加入魚油（飼料干重的3%），并按料水比1∶1的比例混勻后攪拌成團(tuán)狀，置于投料臺(tái)供鰻魚攝食。試驗(yàn)期間精養(yǎng)池水溫24～30 ℃，pH值6.0～7.5，溶解氧濃度8～12 mg/L，亞硝酸鹽濃度0.15～0.22 mg/L，每天排出污水2次，每次換水量約為50 m3/池。

1.3 樣品采集

取花鰻鱺腸道樣品前禁食24 h，將其置于MS-222麻醉劑溶液中浸泡10～15 min，接著用75%乙醇沖洗魚體表面，然后用無菌剪刀和鑷子將腸道從腹腔中分離出來，用PBS 緩沖液沖洗，清除干凈腸道內(nèi)容物。最后將每尾魚的中腸黏膜樣品置于1.5 mL 無菌離心管中。不同體重花鰻鱺的腸道樣品分別標(biāo)記為SG組（樣品編號(hào)A1～A6），MG組（樣品編號(hào)A7～A12），F(xiàn)G 組（樣品編號(hào)A13～A18）。所有樣品保存于-80 ℃冰箱中直到提取DNA。

1.4 DNA的提取和腸道菌群生物信息學(xué)分析

按照Fast DNA?SPIN（MP Biomedical，USA）試劑盒的說明書進(jìn)行所有樣品腸道微生物DNA 的提取，之后再利用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測抽提的DNA，檢驗(yàn)合格的樣品委托北京奧維森基因科技有限公司利用Illumina MiSeq 平臺(tái)進(jìn)行16S rDNA高通量測序，并對(duì)測序得到的數(shù)據(jù)進(jìn)行生物信息學(xué)分析。具體步驟與檢測分析過程與Shi等[7]的研究一致。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

測序得到的原始數(shù)據(jù)經(jīng)過進(jìn)一步的過濾得到有效數(shù)據(jù)，對(duì)有效數(shù)據(jù)進(jìn)行OTUs(operational taxonomic units)聚類，默認(rèn)按照0.97 的相似度進(jìn)行OUT 聚類分析。利用QIIME version v.1.8 平臺(tái)分析菌群的α多樣性，分析指標(biāo)包括Shannon 指數(shù)、Chao1指數(shù)和覆蓋度（coverage）。使用LEfSe 軟件分析組間相對(duì)豐度具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的差異菌，設(shè)置LDA Score 篩選值為3.0，P＜0.05。

2 結(jié)果

2.1 腸道菌群多樣性分析（見圖1、表1）

圖1 所有樣品的腸道菌群稀釋曲線

由圖1 的稀釋曲線可知，各樣品曲線已趨于平坦，表明測序數(shù)據(jù)量合理，測序深度可靠。

表1 不同生長速度花鰻鱺腸道菌群的多樣性

由表1可知，F(xiàn)G組的OUTs、Shannon指數(shù)高于MG組和SG 組，MG 組的Chao1 指數(shù)高于FG 組和SG。各組的覆蓋度均接近1.00，表明該測序深度已基本覆蓋樣品所有物種。

2.2 不同組花鰻鱺腸道菌群在門水平上的組成差異（見圖2）

由圖2可知，不同組花鰻鱺腸道菌群在門水平上主要以梭桿菌門（Fusobacteria）和厚壁菌門（Fir?micutes）為主，其中MG 組和FG 組這2 個(gè)門所占比例在75%以上。在門水平上，F(xiàn)G 組梭桿菌門的相對(duì)豐度高于SG 組和MG 組，MG 組厚壁菌門的相對(duì)豐度高于FG 和SG 組，SG 組放線菌門（Actinobacteria）和擬桿菌門（Bacteroidetes）的相對(duì)豐度高于FG和MG組。

圖2 不同組花鰻鱺腸道菌群在門水平上組成的差異

2.3 基于屬水平的腸道菌群LEfSe分析（見圖3）

圖3 基于屬水平花鰻鱺腸道菌群LEfSe分析

圖3 的LEfSe 分析顯示，F(xiàn)G 組慢生根瘤菌屬（Bradyrhizobium）和不動(dòng)桿菌屬（Acinetobacter）的相對(duì)豐度顯著增加（P＜0.05），MG 組Iamia、固氮弧菌屬（Azoarcus）和厭氧黏細(xì)菌屬（Anaeromyxobacter）的相對(duì)豐度顯著增加（P＜0.05），SG組擬桿菌屬（Bacteroides）、代爾夫特菌屬（Delftia）和水棲菌屬（Enhydrobacter）等細(xì)菌的相對(duì)豐度顯著增加（P＜0.05）。

3 討論

正常魚類的腸道中存在大量的微生物菌群，腸道菌群結(jié)構(gòu)受發(fā)育階段、營養(yǎng)水平、飲食、季節(jié)、溫度和地理位置等多種因素的影響[6-10]。在微生物學(xué)研究中，Shannon 指數(shù)是用來衡量微生物種類多樣性的指標(biāo)，OTUs 和Chao1 指數(shù)通常用來估計(jì)物種總數(shù)，代表生態(tài)系統(tǒng)中細(xì)菌種類的豐富程度[6-7]。本研究發(fā)現(xiàn)FG組腸道菌群的Shannon指數(shù)高于SG組，說明快速生長的花鰻鱺腸道可能具有較高的微生物多樣性，與不同生長速度花鰻鱺腸道菌群變化的結(jié)果一致[6]。MG組的Chao1 指數(shù)在三組中最高，與不同生長速度歐洲鰻鱺腸道菌群變化的結(jié)果相同[7]，說明中速生長的花鰻鱺腸道中菌群豐度高于生長緩慢的花鰻鱺。各組覆蓋度均在99%以上，表示樣本未被測量的概率較低[11]。

本研究中，花鰻鱺腸道內(nèi)的優(yōu)勢菌門有梭桿菌門和厚壁菌門，其中梭桿菌門在FG組相對(duì)豐度最高，成為快速生長花鰻鱺的優(yōu)勢菌門，這與之前在花鰻鱺、歐洲鰻鱺中的研究結(jié)果相似[6-7]。梭桿菌是一種厭氧的革蘭氏陰性菌，能夠產(chǎn)生丁酸鹽等短鏈脂肪酸，被認(rèn)為是淡水魚類腸道菌群的優(yōu)勢菌[7，12]。MG 組厚壁菌門的相對(duì)豐度最高，在不同生長速度大黃魚（Pseu?dosciaena crocea）腸道菌群結(jié)構(gòu)的研究中也有類似結(jié)果[10]。研究表明，厚壁菌門能夠刺激魚類腸道內(nèi)脂肪酸的吸收和代謝，促進(jìn)宿主對(duì)能量的吸收和儲(chǔ)存[13]。屬于厚壁菌門的乳酸菌屬（lactobacillus）通常被認(rèn)為是與健康的腸道上皮相關(guān)的有益微生物[7]。因此，相對(duì)豐度較高的梭桿菌門和厚壁菌門可能對(duì)花鰻鱺的生長產(chǎn)生有益作用。此外，放線菌門和擬桿菌門在生長緩慢的花鰻鱺中相對(duì)豐度較高，與緩慢生長組花鰻鱺腸道菌群中的研究結(jié)果相似[3]。有研究發(fā)現(xiàn)，緩慢生長的大黃魚腸道內(nèi)放線菌門的含量低于正常生長的大黃魚，而擬桿菌門的含量則高于正常生長的大黃魚[10]。郁維娜等[14]通過對(duì)健康和患病凡納濱對(duì)蝦（Litopenaeus van?namei）腸道菌群分析，發(fā)現(xiàn)患病對(duì)蝦中擬桿菌門豐度較高而放線菌門豐度較低。這種差異的產(chǎn)生可能與水生動(dòng)物的物種、遺傳背景及環(huán)境等因素有關(guān)[15]。

在屬水平上花鰻鱺腸道菌群LEfSe 分析結(jié)果顯示，F(xiàn)G組花鰻鱺腸道內(nèi)，不動(dòng)桿菌屬和慢生根瘤菌屬的相對(duì)豐度顯著增加。研究表明，不動(dòng)桿菌是一種曾經(jīng)從魚類腸道中分離出來的革蘭氏陰性菌，是花鰻鱺、日本鰻鱺腸道的優(yōu)勢菌群[8,16]。Huang等[11]在不同階段歐洲鰻鱺腸道菌群組成的研究中，發(fā)現(xiàn)不動(dòng)桿菌在歐洲鰻鱺的幼鰻腸道中占有一定比例，而在其他生長階段均未檢測到。不動(dòng)桿菌屬還是銀鯽（Carassius aura?tusgibelio）、青魚（Mylopharyngodon piceus）、鳙（Para?bramis pekinensis）等淡水魚中的優(yōu)勢菌屬，可有效預(yù)防病原菌感染，產(chǎn)生消化酶，并且有產(chǎn)生抑制鰻弧菌的物質(zhì)的能力[8,17]。此外，在健康黃顙魚（Pelteobagrus fulvidraco）[18]、投喂益生菌后軍曹魚（Rachycentron can?adum）[19]，以及許氏平鲉（Sebastes schlegelii）仔魚、稚魚、幼魚[20]腸道中不動(dòng)桿菌是最優(yōu)勢菌屬。但有一些研究發(fā)現(xiàn)不動(dòng)桿菌屬中的魯氏不動(dòng)桿菌和鮑氏不動(dòng)桿菌為養(yǎng)殖鰻鱺的致病菌，可能導(dǎo)致細(xì)菌性疾病的發(fā)生[21-22]。在本研究采集花鰻鱺腸道樣品過程中，未發(fā)現(xiàn)腸道異?，F(xiàn)象。由于本試驗(yàn)中的16S rDNA測序未能對(duì)種水平細(xì)菌進(jìn)行鑒定，還不能確定腸道內(nèi)是否存有魯氏不動(dòng)桿菌或鮑氏不動(dòng)桿菌，這一點(diǎn)還有待于進(jìn)一步研究?？紤]到快速生長花鰻鱺腸道中不動(dòng)桿菌屬豐度的變化情況，我們認(rèn)為不動(dòng)桿菌屬中的一些細(xì)菌很可能是原籍益生菌，這與Hsu等[8]認(rèn)為不動(dòng)桿菌可能為益生菌的結(jié)論一致。慢生根瘤菌是一種對(duì)固氮有重要作用的革蘭氏陰性菌，在日本鰻鱺[8]、牙鲆（Paralich?thys olivaceus）[23]、大菱鲆（Scophthalmus maximus）[24]和斑點(diǎn)叉尾鮰（Ictalurus punctatus）[25]等魚類的腸道中均有發(fā)現(xiàn)，但是其功能還未見報(bào)道。

Iamia 是一種需氧型革蘭氏陽性菌，曾在鳙[17]和凡納濱對(duì)蝦[26]的腸道中被發(fā)現(xiàn)，在其他水生動(dòng)物中還鮮見報(bào)道。固氮弧菌被認(rèn)為能夠減少羅非魚（Oreo?chromis niloticus）養(yǎng)殖池塘中的含氮廢物污染，而厭氧黏細(xì)菌則存在于尼羅羅非魚養(yǎng)殖池塘的底泥中，具有降解有機(jī)質(zhì)和生態(tài)修復(fù)功能[27-28]。這兩種菌的代謝可能會(huì)影響池塘中的物質(zhì)循環(huán)，從而影響?zhàn)B殖魚類的健康狀況，但并未在其他魚類的腸道中發(fā)現(xiàn)，其在花鰻鱺腸道中的功能還有待進(jìn)一步研究。SG 組擬桿菌屬、代爾夫特菌屬和水棲菌屬的相對(duì)豐度顯著增加，與不同生長速度花鰻鱺腸道菌群的研究結(jié)果不同，可能是養(yǎng)殖環(huán)境不同造成的差異[6]。擬桿菌屬是一種厭氧的革蘭氏陰性菌，淡水魚類腸道中的主要菌屬之一[8]。有研究表明，擬桿菌與宿主的關(guān)系有益生性和致病性兩方面，一方面對(duì)機(jī)體健康有利，能夠釋放抗炎物質(zhì)來維持免疫系統(tǒng)的平衡，另一方面對(duì)機(jī)體有促炎作用，誘導(dǎo)結(jié)腸炎和胃炎的發(fā)生[29-30]。在本研究中，擬桿菌可能在花鰻鱺腸道中誘導(dǎo)腸炎發(fā)生進(jìn)而造成其生長緩慢。代爾夫特菌屬是一種嚴(yán)格好氧菌，其豐度在緩慢生長組斜帶石斑魚（Epinephelus coioides）腸道中較快速生長組高[5]，與本試驗(yàn)結(jié)果一致。另外，代爾夫特菌屬在牙鲆[23]、歐洲舌齒鱸（Dicentrarchus labrax）[31]、虹鱒（Oncorhynchus mykiss）[32]和大西洋鮭（Salmo salar）[33]腸道中均有發(fā)現(xiàn)，但其主要功能尚未報(bào)道。水棲菌屬屬于γ-變形菌綱（Gammaproteobacteria），弧菌科（Vib?rionaceae），是存在于日本鰻鱺腸道的常見菌群，也是水產(chǎn)養(yǎng)殖動(dòng)物常見的病原菌[16,34]，其相對(duì)豐度的增加與花鰻鱺生長的關(guān)系還需進(jìn)一步的研究。

4 結(jié)論

精養(yǎng)池條件下不同生長速度的花鰻鱺腸道菌群結(jié)構(gòu)存在差異，快速生長個(gè)體腸道菌群多樣性較高；一些不動(dòng)桿菌屬細(xì)菌可能是其腸道中潛在的益生菌。