川芎嗪聯(lián)合mTOR抑制劑調(diào)控卵巢癌SKOV-3細(xì)胞增殖、侵襲遷移的實(shí)驗(yàn)研究

程春來,車 元*,丁 雯,呂曉君

0 引言

卵巢癌是女性生殖器官常見的惡性腫瘤之一,嚴(yán)重威脅女性的健康,目前臨床上對(duì)于卵巢癌的治療主要為手術(shù)治療、紫杉醇或多柔比星聯(lián)合鉑類藥物化療、靶向治療及免疫治療、放射治療等[1-3]。雷帕霉素靶蛋白(mTOR)是一種絲氨酸/蘇氨酸激酶,mTOR信號(hào)通路促進(jìn)物質(zhì)代謝，參與細(xì)胞凋亡、自噬，在多種疾病中發(fā)揮重要作用。近年來,研究表明，mTOR抑制劑能夠有效抑制胃癌、肺癌、卵巢癌等腫瘤細(xì)胞的增殖分化及轉(zhuǎn)移,發(fā)揮抗腫瘤作用[4-6],其中,雷帕霉素是目前已明確的第一代mTOR抑制劑。川芎嗪是從傳統(tǒng)中藥材川芎中提取得到的單體化合物，具有心腦血管保護(hù)作用、抗血小板聚集、改善微循環(huán)、增強(qiáng)機(jī)體免疫力及抗腫瘤作用[7-12]。本文主要通過研究川芎嗪聯(lián)合mTOR抑制劑對(duì)卵巢癌SKOV-3細(xì)胞增殖、侵襲遷移的作用,為卵巢癌的治療提供參考和依據(jù)。

1 材料

1.1 主要儀器 酶標(biāo)儀購自北京島津公司,雙垂直電泳儀、轉(zhuǎn)印電泳儀、凝膠成像儀、流式細(xì)胞儀均購自伯樂生命醫(yī)學(xué)產(chǎn)品有限公司。

1.2 藥品與試劑 川芎嗪購自Sigma公司,雷帕霉素購自北京索萊寶科技有限公司,RNA提取試劑盒、PI3K、AKT、mTOR和GAPDH抗體均購自Proteintech公司,細(xì)胞周期與細(xì)胞凋亡檢測試劑盒、RIPA蛋白裂解液購自上海碧云天公司,ECL顯色液購自Thermo公司。RPMI1640培養(yǎng)基、胰蛋白酶、MTT、Transwell小室、Matrigel基質(zhì)膠均購自北京索萊寶科技有限公司。

1.3 細(xì)胞 人卵巢腺癌細(xì)胞SKOV-3購自中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞資源中心。

2 方法

2.1 細(xì)胞培養(yǎng)與傳代 從-80 ℃冰箱中取出SKOV-3細(xì)胞凍存管,于37 ℃恒溫溶解后移至超凈工作臺(tái),加入適量的 RPMI1640 培養(yǎng)基(含 10%胎牛血清),1 000 r/min 條件下離心 8 min。棄去上清,加入適量培養(yǎng)基使細(xì)胞重懸,并小心接種于培養(yǎng)皿中,于 37 ℃、5%CO2恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng),定期更換新鮮培養(yǎng)液并傳代。

2.2 MTT法檢測川芎嗪聯(lián)合雷帕霉素對(duì)SKOV-3細(xì)胞增殖的影響 根據(jù)文獻(xiàn)方法確定川芎嗪及雷帕霉素給藥濃度[13-16],在96孔板上分別設(shè)置給藥組(分別為40 μmol/L川芎嗪組、5 μmol/L雷帕霉素組、40 μmol/L川芎嗪聯(lián)合5 μmol/L雷帕霉素組)、對(duì)照組及調(diào)零組,每組設(shè)置5個(gè)復(fù)孔,調(diào)零組只加入等量培養(yǎng)液,不加入細(xì)胞懸液,其余各組加入對(duì)數(shù)生長期的SKOV-3細(xì)胞,并使其密度為1×104個(gè)/ml。各組在37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h,對(duì)照組及調(diào)零組更換新鮮培養(yǎng)液,給藥組川芎嗪組加入終濃度為40 μmol/L的川芎嗪,雷帕霉素組加入終濃度為5 μmol/L的雷帕霉素、川芎嗪聯(lián)合雷帕霉素組加入終濃度為40 μmol/L的川芎嗪及終濃度為5 μmol/L的雷帕霉素,并繼續(xù)于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h。培養(yǎng)結(jié)束后,在避光的環(huán)境下每孔加入20 μl MTT溶液(5 mg/ml),于培養(yǎng)箱中避光孵育4 h,然后吸去上清液,每孔加入150 μl DMSO,置于振蕩器上震蕩5 min至藍(lán)紫色結(jié)晶完全溶解后于酶標(biāo)儀490 nm處測定OD值。按照如下公式計(jì)算細(xì)胞抑制率:

細(xì)胞抑制率(%)=

2.3 Transwell實(shí)驗(yàn)檢測SKOV-3細(xì)胞侵襲能力 Matrigel基質(zhì)膠融化后進(jìn)行稀釋,將稀釋過的Matrigel膠包被Transwell小室底部,風(fēng)干待用。取對(duì)數(shù)生長期的SKOV-3細(xì)胞,使用不含胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24 h,然后收集細(xì)胞,并調(diào)整細(xì)胞密度為1×105個(gè)/ml。將Matrigel膠包被的Transwell小室置于24孔細(xì)胞培養(yǎng)板中,小室加入200 μl細(xì)胞懸液,下室加入600 μl含20%胎牛血清的培養(yǎng)基,川芎嗪組及雷帕霉素組分別加入川芎嗪(40 μmol/L)及雷帕霉素(5 μmol/L),川芎嗪聯(lián)合雷帕霉素組同時(shí)加入川芎嗪(40 μmol/L)及雷帕霉素(5 μmol/L),對(duì)照組不加藥物處理,每組重復(fù)5個(gè)樣本。置培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)48 h,取出小室,棄去培養(yǎng)液,使用PBS洗2遍,然后用70%甲醇固定30 min,臺(tái)盼藍(lán)染色,使用PBS洗3遍,用棉球輕輕拭去表面殘留細(xì)胞和凝膠,倒置顯微鏡觀察穿膜細(xì)胞數(shù)。統(tǒng)計(jì)各組細(xì)胞侵襲抑制率,細(xì)胞侵襲抑制率(%)=(1-給藥組穿膜細(xì)胞數(shù)/對(duì)照組穿膜細(xì)胞數(shù))× 100%。

2.4 劃痕實(shí)驗(yàn)檢測SKOV-3細(xì)胞遷移能力 取對(duì)數(shù)生長期的SKOV-3細(xì)胞,培養(yǎng)24 h后,對(duì)照組加入新鮮培養(yǎng)基,川芎嗪組及雷帕霉素組分別加入川芎嗪(40 μmol/L)及雷帕霉素(5 μmol/L),川芎嗪聯(lián)合雷帕霉素組同時(shí)加入川芎嗪(40 μmol/L)及雷帕霉素(5 μmol/L),繼續(xù)培養(yǎng)48 h后,將各組細(xì)胞接種于Matrigel基質(zhì)膠包被的 96 孔板上,常規(guī)培養(yǎng)至形成單層細(xì)胞,沿培養(yǎng)板底部做劃痕,在顯微鏡下記錄劃痕相對(duì)距離,繼續(xù)培養(yǎng)24 h,再次記錄劃痕相對(duì)距離,統(tǒng)計(jì)細(xì)胞遷移距離,遷移距離=0 h劃痕相對(duì)距離-24 h劃痕相對(duì)距離。

2.5 實(shí)時(shí)定量PCR檢測SKOV-3細(xì)胞中Bax、Bcl-2的mRNA水平 采用RNA提取試劑盒分別提取分別經(jīng)40 μmol/L川芎嗪、5 μmol/L雷帕霉素、40 μmol/L川芎嗪聯(lián)合5 μmol/L雷帕霉素作用48 h后的SKOV-3細(xì)胞的總RNA。將提取的總RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA后,實(shí)時(shí)定量PCR檢測各組SKOV-3細(xì)胞中GAPDH、Bax、Bcl-2的mRNA水平。各檢測基因的實(shí)時(shí)定量PCR引物見表1,實(shí)時(shí)定量PCR結(jié)果采用2-△△Ct法計(jì)算相對(duì)表達(dá)量。

表1 用于實(shí)時(shí)定量PCR檢測的基因引物序列

2.6 Western blot檢測 將對(duì)數(shù)生長期的SKOV-3細(xì)胞于6孔板中培養(yǎng)至貼壁后,川芎嗪組及雷帕霉素組分別加入川芎嗪(40 μmol/L)及雷帕霉素(5 μmol/L),川芎嗪聯(lián)合雷帕霉素組同時(shí)加入川芎嗪(40 μmol/L)及雷帕霉素(5 μmol/L),各組繼續(xù)培養(yǎng)48 h后,分別加入裂解液提取總蛋白,采用BCA法測定蛋白濃度,處理好待測樣品后,取50 μg蛋白進(jìn)行SDS-PAGE電泳分離,轉(zhuǎn)膜,將分離的蛋白電轉(zhuǎn)移至PVDF膜上。封閉液室溫封閉1 h后,經(jīng)PI3K、Akt、mTOR抗體(1∶1 000)孵育,4 ℃過夜。PBST充分洗膜后,加入二抗(1∶2 000)室溫孵育1 h,PBST清洗后顯色液顯影,利用凝膠成像儀成像后,應(yīng)用Image J軟件進(jìn)行免疫印跡灰度值檢測。

2.7 細(xì)胞周期檢測 分別取經(jīng)40 μmol/L川芎嗪、5 μmol/L雷帕霉素、40 μmol/L川芎嗪聯(lián)合5 μmol/L雷帕霉素作用48 h后的SKOV-3細(xì)胞,用PBS洗2遍后,加入預(yù)冷的70%乙醇固定,過夜。次日取出,離心(2 500 r/min,5 min,4 ℃),用移液槍吸除上清液,渦旋震蕩使SKOV-3細(xì)胞松散。用PBS洗滌SKOV-3細(xì)胞2次,然后加入已配好的碘化丙啶染色液,37 °C染色30 min后,利用流式細(xì)胞儀,進(jìn)行細(xì)胞周期檢測。

3 結(jié)果

3.1 川芎嗪聯(lián)合雷帕霉素對(duì)SKOV-3細(xì)胞增殖的影響 川芎嗪聯(lián)合雷帕霉素對(duì)SKOV-3細(xì)胞的增殖抑制率見圖1。結(jié)果表明,與對(duì)照組相比,川芎嗪組、雷帕霉素組及川芎嗪聯(lián)合雷帕霉素組OD值均顯著降低(P<0.05),表明單獨(dú)或聯(lián)合使用川芎嗪和雷帕霉素均能明顯抑制SKOV-3細(xì)胞的增殖;與川芎嗪組或雷帕霉素組相比,川芎嗪聯(lián)合雷帕霉素組能夠使SKOV-3細(xì)胞的增殖抑制率顯著提高(P<0.05),提示川芎嗪聯(lián)合雷帕霉素能夠顯著抑制卵巢癌細(xì)胞的增殖,且作用效果優(yōu)于單獨(dú)使用川芎嗪或雷帕霉素。

圖1 川芎嗪聯(lián)合雷帕霉素對(duì)SKOV-3細(xì)胞的增殖抑制率

3.2 川芎嗪聯(lián)合雷帕霉素對(duì)SKOV-3細(xì)胞侵襲力的影響 各組SKOV-3細(xì)胞侵襲力見圖2。結(jié)果表明,與對(duì)照組相比,川芎嗪組、雷帕霉素組及川芎嗪聯(lián)合雷帕霉素組SKOV-3細(xì)胞穿膜細(xì)胞數(shù)均顯著減少(P<0.05),同時(shí),與川芎嗪組或雷帕霉素組相比,川芎嗪聯(lián)合雷帕霉素組SKOV-3細(xì)胞侵襲抑制率顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，提示川芎嗪聯(lián)合雷帕霉素能夠有效抑制卵巢癌細(xì)胞的侵襲力,且侵襲抑制率優(yōu)于單獨(dú)使用川芎嗪或雷帕霉素。

圖2 各組SKOV-3細(xì)胞Transwell實(shí)驗(yàn)結(jié)果(40)

3.3 川芎嗪聯(lián)合雷帕霉素對(duì)SKOV-3細(xì)胞遷移力的影響 各組SKOV-3細(xì)胞遷移距離見圖3。結(jié)果表明,與對(duì)照組相比,川芎嗪組、雷帕霉素組及川芎嗪聯(lián)合雷帕霉素組SKOV-3細(xì)胞遷移距離顯著縮短(P<0.05),提示單獨(dú)使用川芎嗪或雷帕霉素,或川芎嗪與雷帕霉素聯(lián)合使用均能明顯抑制卵巢癌細(xì)胞的遷移力;與川芎嗪組或雷帕霉素組相比,川芎嗪聯(lián)合雷帕霉素組SKOV-3細(xì)胞遷移距離顯著縮短，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),提示川芎嗪聯(lián)合雷帕霉素能夠明顯抑制卵巢癌細(xì)胞的遷移力,其作用效果優(yōu)于單獨(dú)使用川芎嗪或雷帕霉素。

圖3 各組SKOV-3細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果(40×)

3.4 川芎嗪聯(lián)合雷帕霉素對(duì)SKOV-3細(xì)胞Bax、Bcl-2的mRNA水平的影響 各組SKOV-3細(xì)胞Bax、Bcl-2的mRNA水平見圖4。結(jié)果表明,與對(duì)照組相比,川芎嗪組、雷帕霉素組及川芎嗪聯(lián)合雷帕霉素組SKOV-3細(xì)胞Bax mRNA水平顯著升高(P<0.05),Bcl-2水平顯著降低(P<0.05);同時(shí),與川芎嗪組或雷帕霉素組相比,川芎嗪聯(lián)合雷帕霉素組SKOV-3細(xì)胞Bax mRNA水平顯著升高(P<0.05),Bcl-2 mRNA水平顯著降低(P<0.05)，提示川芎嗪聯(lián)合雷帕霉素能夠顯著提高卵巢癌細(xì)胞內(nèi)Bax水平,降低Bcl-2水平,這可能與川芎嗪聯(lián)合雷帕霉素促進(jìn)卵巢癌細(xì)胞凋亡機(jī)制有關(guān)。

3.5 川芎嗪聯(lián)合雷帕霉素對(duì)SKOV-3細(xì)胞PI3K、Akt、mTOR水平的影響 各組SKOV-3細(xì)胞PI3K、Akt、mTOR水平見圖5。結(jié)果表明,與對(duì)照組相比,川芎嗪組、雷帕霉素組及川芎嗪聯(lián)合雷帕霉素組SKOV-3細(xì)胞PI3K、Akt、mTOR水平均顯著降低(P<0.05),同時(shí),與川芎嗪組或雷帕霉素組相比,川芎嗪聯(lián)合雷帕霉素組SKOV-3細(xì)胞PI3K、Akt、mTOR水平顯著降低(P<0.05),提示川芎嗪聯(lián)合mTOR抑制劑可能通過調(diào)節(jié)卵巢癌細(xì)胞中PI3K/Akt/mTOR信號(hào)通路相關(guān)蛋白水平,從而起到對(duì)卵巢癌細(xì)胞的抑制作用。

圖4 各組SKOV-3細(xì)胞Bax、Bcl-2的mRNA水平

圖5 各組SKOV-3細(xì)胞PI3K、Akt、mTOR水平

3.6 川芎嗪聯(lián)合雷帕霉素對(duì)SKOV-3細(xì)胞周期的影響 見圖6。結(jié)果表明,與對(duì)照組相比,川芎嗪組、雷帕霉素組及川芎嗪聯(lián)合雷帕霉素組G1期SKOV-3細(xì)胞顯著增加(P<0.05);與川芎嗪組或雷帕霉素組相比,川芎嗪聯(lián)合雷帕霉素組G1期SKOV-3細(xì)胞顯著增加(P<0.05)，提示川芎嗪聯(lián)合mTOR抑制劑能夠顯著影響卵巢癌細(xì)胞周期,改變卵巢癌細(xì)胞分裂過程,引起卵巢癌細(xì)胞G1/S期阻滯,從而抑制卵巢癌細(xì)胞的增殖,起到腫瘤抑制作用。

圖6 川芎嗪聯(lián)合雷帕霉素對(duì)SKOV-3細(xì)胞周期的影響

4 討論

近年來，隨著眾多學(xué)者對(duì)于川芎嗪的深入研究,川芎嗪對(duì)多種腫瘤的藥理活性逐漸被發(fā)現(xiàn)。Chen等[17]研究表明,川芎嗪能夠通過抑制血管內(nèi)皮生長因子誘導(dǎo)的血管生成,進(jìn)而抑制黑色素瘤轉(zhuǎn)移;黃芬等[18]研究證實(shí)，川芎嗪聯(lián)合CIK細(xì)胞能通過下調(diào)細(xì)胞基質(zhì)金屬蛋白酶-2,上調(diào)基質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑-2蛋白表達(dá),抑制骨架微絲重排,進(jìn)而抑制肝癌HepG2細(xì)胞的遷移及侵襲;楊劭劼等[19]發(fā)現(xiàn)，川芎嗪可以通過影響PTEN/AKT/cyclinD1信號(hào)通路,進(jìn)而誘導(dǎo)外陰鱗癌細(xì)胞SW962的凋亡,并抑制其轉(zhuǎn)移和侵襲;李高兵等[20]則證實(shí)了川芎嗪能夠抑制Wnt信號(hào)通路的激活,進(jìn)而抑制人肺癌細(xì)胞A549細(xì)胞的增殖、侵襲和遷移;來岳標(biāo)等[21]發(fā)現(xiàn)，對(duì)于耐藥肺癌細(xì)胞,川芎嗪也表現(xiàn)出顯著的促凋亡作用,并參與調(diào)節(jié)絲裂原活化蛋白激酶信號(hào)通路;同時(shí),殷娟等[22]發(fā)現(xiàn)，川芎嗪可以通過調(diào)節(jié)基質(zhì)金屬蛋白酶-9的表達(dá),抑制IL-8誘導(dǎo)的SKOV3細(xì)胞遷移。而川芎嗪聯(lián)合mTOR抑制劑雷帕霉素對(duì)于卵巢癌細(xì)胞的抗腫瘤活性,目前尚未見報(bào)道。本文研究川芎嗪聯(lián)合mTOR抑制劑雷帕霉素對(duì)于卵巢癌SKOV-3細(xì)胞的作用,結(jié)果表明,川芎嗪聯(lián)合雷帕霉素能夠顯著抑制卵巢癌SKOV-3細(xì)胞的增殖,抑制SKOV-3細(xì)胞侵襲、遷移,同時(shí)促進(jìn)SKOV-3細(xì)胞促凋亡基因的表達(dá),抑制抗凋亡基因的表達(dá),抑制PI3K/Akt/mTOR信號(hào)通路的異常激活,其作用效果顯著優(yōu)于單獨(dú)使用川芎嗪或單獨(dú)使用雷帕霉素,這為后期深入研究川芎嗪聯(lián)合mTOR抑制劑對(duì)細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路及基因的靶向調(diào)節(jié)作用提供了基礎(chǔ)。此外,本研究結(jié)果表明，川芎嗪聯(lián)合mTOR抑制劑能夠顯著影響卵巢癌細(xì)胞周期,引起卵巢癌細(xì)胞G1/S期阻滯,這提示川芎嗪聯(lián)合mTOR抑制劑可能對(duì)其他影響細(xì)胞周期相關(guān)通路存在潛在或反饋調(diào)節(jié)作用,值得進(jìn)一步研究。由于時(shí)間及儀器等條件的限制,本研究未能進(jìn)一步探討川芎嗪聯(lián)合mTOR抑制劑對(duì)細(xì)胞內(nèi)基因的靶向調(diào)節(jié)作用,同時(shí),川芎嗪與mTOR抑制劑的聯(lián)合使用比例對(duì)細(xì)胞周期、相關(guān)信號(hào)通路是否具有不同的作用強(qiáng)度,在今后的研究中將進(jìn)一步探討。

綜上所述,川芎嗪聯(lián)合mTOR抑制劑能夠顯著抑制卵巢癌SKOV-3細(xì)胞增殖、侵襲和遷移,其機(jī)制可能與調(diào)節(jié)PI3K/Akt/mTOR信號(hào)通路有關(guān)。