半滑舌鰨早期不同性別的形態(tài)差異及判別分析

王立萍，葉 展，張亞群，王巧欣，李恒德

（1.上海海洋大學，水產(chǎn)科學國家級實驗教學示范中心，上海 201306；2.中國水產(chǎn)科學研究院生物技術研究中心，北京 100141）

半滑舌鰨（Cynoglossus semilaevis）是我國近海水域常見的一種暖溫性大型底層魚類，其肉質(zhì)細嫩、營養(yǎng)豐富，深受養(yǎng)殖戶和消費者喜愛，是我國重要的海水經(jīng)濟魚類。半滑舌鰨性別決定系統(tǒng)為（ZW♀-ZZ♂）型［1-3］，在苗種期，部分遺傳雌性會逆轉為表型雄性，即偽雄魚（ZW♂），這種性別轉變是不可逆的［4］。半滑舌鰨成年雌性的體質(zhì)量是成年雄性的2～4倍［5］，雄性和偽雄性則存在著個體小、生長速度慢等缺點［6］。雖然半滑舌鰨剛孵化出的仔魚的遺傳雌、雄性別比例接近1∶1［7-9］，但是由于性逆轉現(xiàn)象，導致雌性比例過低，從而增加了飼養(yǎng)和管理成本，影響整體養(yǎng)殖產(chǎn)量，嚴重阻礙了半滑舌鰨養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。

在魚類中，具有明顯兩性性征的物種，可利用鰭條特征、生殖孔形態(tài)［10］、產(chǎn)卵管［11］、雄性體表的追星［12］和婚姻色有無［13］等特征鑒別性別，但對于外觀特征不明顯的物種，則可通過解剖觀察、組織切片［14］、超聲波［15-16］、強光照射［17］等方法鑒定，或從其基因組DNA中篩選出性別特異標記基因，采用PCR技術準確鑒定魚體遺傳性別，如黃顙魚（Pelteobagrus fulvidraco）［18］、半滑舌鰨［19-22］、哲羅魚（Hucho taimen）［23］、金錢魚（Scatophagus argus）［24］、 鰻鱺 （Anguilla japonica）［25］、翹嘴鱖（Siniperca chuatsi）［26］等。雖然同批次半滑舌鰨成體的雌、雄、偽雄性體質(zhì)量差別較大，較易辨別，但在幼魚期不同性別間差異則較小，不易辨別，需要養(yǎng)殖較長時間后才能依據(jù)體型大小差異基本辨別性別，這會在很大程度上增加養(yǎng)殖成本。在半滑舌鰨生產(chǎn)中，魚苗一般在70日齡左右出售，此時魚苗全長約5 cm左右。為了獲得客戶認可，育苗人員常常根據(jù)經(jīng)驗，將全長較短、體高較窄的貌似雄魚個體淘汰，以期提高所售苗種的雌性率。但由于這個時期的魚苗正處于性別分化時期，一些可能發(fā)育為偽雄魚的遺傳雌魚還未完成性別逆轉過程，這種經(jīng)驗式的篩選方式是否可靠，還缺少相應的科學依據(jù)。

通過測量大量樣本的魚體形態(tài)和框架指標，運用多元統(tǒng)計分析進行性別判定是一種較為簡便、實用、有效的方法。目前已有多種水產(chǎn)魚類通過測量魚體各形態(tài)特征指標，運用主成分分析、判別分析等方法較為準確地判別雌、雄。如對大黃魚（Larimichthys crocea）形態(tài)特征的主成分分析和判別分析發(fā)現(xiàn)，雌魚較雄魚變異大，雌雄個體間體長／體厚差異最大［27］；翹嘴鱖的全長和體高對體質(zhì)量的影響最大［28］；金錢魚的雌雄差異主要體現(xiàn)在頭部和體型［29］；紅鰭東方鲀（Takifugu rubripes）雄性較雌性體型寬、體周長［30］。而目前有關半滑舌鰨形態(tài)指標的研究很少，且大都集中于成魚，如利用相關性分析和通徑分析方法判斷半滑舌鰨形態(tài)性狀與個體體質(zhì)量的關系［31］，以及對半滑舌鰨的生長和形態(tài)參數(shù)方面進行研究［32］等。因此，本研究通過測量半滑舌鰨幼魚雌、雄、偽雄個體的形態(tài)學測量數(shù)據(jù)，進行主成分分析和判別分析，檢驗通過形態(tài)特征對半滑舌鰨幼魚進行早期性別判定的可行性和準確性，以期為半滑舌鰨生產(chǎn)中幼魚的性別鑒定提供科學的數(shù)據(jù)支持和理論指導。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

半滑舌鰨樣品2019年采集于天津某養(yǎng)殖場，養(yǎng)殖水溫23℃左右，隨機撈取同批次的70日齡半滑舌鰨苗種，共計349尾，作為測量分析樣本。由于部分半滑舌鰨雌性苗種在50～120日齡期間會發(fā)生性逆轉現(xiàn)象，采用性腺組織切片的方法不能準確判定生理性別，故采用已知的半滑舌鰨性別特異基因位點的方法來準確鑒定各樣本生理性別。對各樣本分別取尾鰭提取基因組DNA，運用半滑舌鰨的特異微衛(wèi)星標記SCAR進行初步的遺傳性別鑒定［20］，區(qū)分出遺傳雄性、遺傳雌性，由于遺傳雌性中可能含有會性逆轉的生理性別為偽雄性的個體，之后通過半滑舌鰨遺傳雌魚Z染色體上兩個與性逆轉相關的單核苷酸多態(tài)性（SNP）位點［21-22］，擴增測序以準確辨別偽雄性和雌性。測序結果顯示，本次樣品中雌性116尾、雄性180尾、偽雄性53尾。雌性體長為3.154～7.959 cm，雄性體長為3.108～7.569 cm，偽雄性體長為3.569～6.489 cm。

1.2 形態(tài)學性狀測量

取實驗用魚置于白色實驗盤中，旁邊放置鋼尺，逐尾標號標記，水平拍照后，采用Motic Images Plus 2.0軟件測量全長（吻端到尾鰭末端，F(xiàn)L）、體高（垂直于魚體側線最寬的部位，BH）、尾巴角度（CA）、背部與水平線角度（DA）等形態(tài)性狀指標，精確至0.001 cm（圖1）。

圖1 半滑舌鰨幼魚各形態(tài)測量指標Fig.1 Morphologicalmeasurement indexes of Cynoglossus sem ilaevis seed ling

1.3 數(shù)據(jù)處理

對收集到的349尾半滑舌鰨幼苗進行有效可量性狀測量并統(tǒng)計。為消除個體差異對形態(tài)數(shù)據(jù)的影響，也便于差異比較，將測得的數(shù)據(jù)進行整理及標準化，考慮到數(shù)據(jù)連續(xù)性的問題，把角度值用正切轉換為長度后再分析，共得到5項性狀，包括全長（FL）、體高（BH）、全長／體高（FL／BH）、尾部角度正切值（CT）、背部與水平角度正切值（DT）。

1.4 統(tǒng)計分析

本研究應用Excel2016及R軟件（R4.0.0），對樣本各項形態(tài)測量數(shù)據(jù)進行處理分析。首先，將5項性狀數(shù)據(jù)進行分布檢驗，明確各項數(shù)據(jù)是否基本呈現(xiàn)正態(tài)分布，并檢驗各項數(shù)據(jù)的方差齊性。以P＜0.05表示差異顯著，P＜0.01表示差異極顯著。運用方差分析，將樣本的雌、雄、偽雄3種性別類別作為因子，對各項形態(tài)測量數(shù)據(jù)進行方差分析，分析各性別間的差異顯著性。之后，運用R中軟件princomp（）函數(shù)對各項形態(tài)性狀進行主成分分析，分析半滑舌鰨幼魚不同性別群體間的形態(tài)變異特征和程度。然后運用R軟件中l(wèi)da（）函數(shù)進行Fisher判別分析，根據(jù)各變量對模型貢獻的大小，建立70日齡半滑舌鰨雌、雄、偽雄個體判別方程式，并根據(jù)所建立的方程，對照鑒定的遺傳性別信息，檢驗判別的準確性。

2 結果與分析

2.1 半滑舌鰨幼魚雌、雄、偽雄形態(tài)性狀分析

對349尾半滑舌鰨70日齡幼魚雌、雄、偽雄性別樣本的形態(tài)測量性狀進行統(tǒng)計（表1）。經(jīng)檢驗，樣本中半滑舌鰨雌、雄、偽雄的各項測量數(shù)值均為正態(tài)性分布，且符合方差齊性（P＞0.05）。雌性群體的全長（FL）和體高（BH）大于雄性，全長／體高（FL／BH）小于雄性，且均有顯著差異（P＜0.05）；雌、偽雄群體間，只在全長／體高（FL／BH）方面差異顯著（P＜0.05）；雄魚和偽雄魚的形態(tài)性狀則無顯著差異。從以上統(tǒng)計可以得知，雌魚的整體輪廓較同期雄魚和偽雄魚更為寬大。

2.2 主成分分析

對半滑舌鰨早期幼魚樣本的5個形態(tài)測量性狀，運用R軟件princomp（）函數(shù)進行主成分分析，結果表明，前3個主成分（PC1、PC2、PC3）的特征值較大，它們的貢獻率分別為39.011%、27.976%、19.045%，累計貢獻率達到86.032%（表2）。其中PC1負荷量較大的有全長（FL）和體高（BH），主要反映半滑舌鰨整體輪廓大小特征；PC2負荷量較大的為尾巴角度正切值（CT）和全長體高比（FL／BH），反映了魚體的寬度大小以及尾巴角度的影響；PC3主要負荷量較大的為背部與水平線角度（DT）和全長體高比（FL／BH），主要反映視覺上魚體的長寬比。

根據(jù)主成分分析的結果，繪制半滑舌鰨早期個體樣本的主成分得分散點圖。如圖2所示，盡管分散不明顯，但仍表現(xiàn)出分離態(tài)勢，雌性個體整體得分較高，趨于圖的上部分，雄性個體得分趨于圖的下部，偽雄性個體分散于圖片中部。

2.3 判別分析

由于主成分分析只能揭示半滑舌鰨不同性別群體間形態(tài)變異的特征和程度，無法判別單一半滑舌鰨的性別，因此需要進行判別分析。進一步對349尾半滑舌鰨個體的5項形態(tài)測量性狀進行判別分析，根據(jù)各變量對模型的貢獻率，所建立的判別模型方程為：

第一判別式LD1對區(qū)分雌、雄、偽雄的貢獻率大小為0.813 7，第二判別式LD2對區(qū)分各性別組的貢獻率為0.186 3，誤判率為0.435 5。判別函數(shù)的顯著性檢驗顯示P＜0.01，達到極顯著水平。利用所建立的判別方程，對349尾半滑舌鰨雌、雄、偽雄個體性別進行判別檢驗。其中，雄性個體判別準確率較高，為85.000%；雌性個體判別準確率較低，為37.069%；偽雄魚個體判別準確率極低，為1.887%，偽雄魚形態(tài)特征不明顯且更易判為雄魚；綜合判別準確率為56.447%（表3）。

3 討論

分析不同性別魚體間的形態(tài)特征差異，建立形態(tài)指標體系，進行雌雄差異判別，是一種可行、有效的方法［33-35］。本研究針對生產(chǎn)中通過觀察半滑舌鰨幼魚形態(tài)來判斷性別的科學性問題，建立了3種性別判別模型方程進行判別檢驗，相關結果對能否通過體型差異淘汰雄性和偽雄性個體，以提高商品苗的雌性率提供了重要的理論依據(jù)。

表1 半滑舌鰨雌、雄、偽雄形態(tài)性狀的參數(shù)統(tǒng)計（N=349）Tab.1 Statistics ofmorphological characters of female，male and pseudomale in Cynoglossus sem ilaevis

表2 主成分貢獻率及各指標負荷量Tab.2 Contribution rate of principal com ponents and load capacity of each index

本研究發(fā)現(xiàn)，雌性幼魚整體輪廓較雄性和偽雄性大，且腹部較寬，而雄魚和偽雄魚在形態(tài)上較為相似，這與其成體的外部形態(tài)也較為一致［7］。雌、雄、偽雄性個體間存在的這種形態(tài)差異，與其體內(nèi)性激素水平、性成熟時間有關，卵巢和精巢的細胞學分化通常不同步，雄魚較雌魚成熟所需時間短［36］。

本研究應用主成分分析方法，對可能反映半滑舌鰨不同性別形態(tài)差異的多維空間相關變化的數(shù)據(jù)集，降維轉化為少量且相互獨立的新綜合指標，從而簡化數(shù)據(jù)結構，并包含原指標中的主要信息。由主成分分析結果可知，提取的3個主成分（PC1、PC2、PC3）的累計貢獻率達86.032%，表明該方法既可保留變量間的大部分信息，又能夠保證較高的預測準確度。根據(jù)主成分分析得分情況可知，對性別分離作用較大的主要是全長、體高及其比值方面，表明半滑舌鰨雌、雄、偽雄性個體間的差異主要集中在整體輪廓大小的指標方面，這與其形態(tài)性狀差異顯著性分析的結果相符，可為半滑舌鰨幼魚性別判別、篩選培育高雌群體提供重要理論參考。

同時，判別分析是一種實用性很強的統(tǒng)計判別和分組技術，已有多種魚類通過本方法有效區(qū)分不同性別群體，如長江口鰻鱺的雌雄判別準確率為88.59%［37］，金錢魚的雌雄綜合判別準確率為85.96%［29］，紅鰭東方鲀的性別綜合判別準確率為 81.90%［30］，河川沙塘鱧（Odontobutis potamophila）雌雄綜合判別準確率為71.0%［33］，翹嘴紅鮊（Eryghroculter ilishaeformis）群體的識別正確率達91.0%［38］，翹嘴鱖雌、雄綜合判別準確率為61.7%［28］。本研究的檢驗結果顯示，半滑舌鰨70日齡幼魚雄性判別準確率為85%，可篩選淘汰大部分雄魚，雌性個體判別準確率為37%，偽雄魚個體易判為雄魚，偽雄魚的生長速度雖較雄魚稍快，但較正常雌魚慢，由于需要淘汰偽雄魚，因此盡管其判定準確性低，但是并不影響實際應用。本研究顯示，雌性判別率較低，相當一部分雌性個體存在易錯判為雄性個體而被淘汰掉，從而造成一定程度的苗種浪費，但由于生理雄魚的判別率較高，因而更容易被淘汰掉。所以總體上看，根據(jù)形態(tài)學性狀建立的判別方法可在70日齡左右區(qū)別并淘汰雄魚及偽雄魚，從而在一定程度上提高苗種的雌性率，但同時也會把一部分雌魚淘汰掉。

表3 70日齡半滑舌鰨性別判別結果Tab.3 Discrim inant results of sexual discrim ination of 70 days Cynoglossus sem ilaevis

綜上，本研究利用70日齡半滑舌鰨雌、雄、偽雄性別的形態(tài)差異建立判別模型，其雄魚判別準確率達85%，較之前通過強光照射方法肉眼判斷雄魚54.7%的準確率［17］有了較大提高，為生產(chǎn)上通過觀察幼魚形態(tài)指標、篩選淘汰雄性個體、提高商品苗的雌性率提供了科學依據(jù)。各性別魚體在生長過程中，由于體型的增大，全長／體高的比值會隨之變化，所以不易固定量化。但對于同一批次魚而言，大致符合雄魚比雌魚全長較短、體高較窄的特點。早期淘汰雄魚和偽雄魚會使一定比例的雌魚淘汰掉。由此建議半滑舌鰨早期苗種的篩選時間進行適當?shù)耐七t，如120日齡，此時魚體性別已完全分化，但同時也會增加苗期的養(yǎng)殖成本，因此在實際生產(chǎn)中需綜合權衡，以達到養(yǎng)殖效益最大化。