飼喂枯草芽孢桿菌對雜交鱘生長和腸道菌群結(jié)構(gòu)的影響

張書環(huán)，吳金平，褚志鵬，許巧情，何菊云，金佳利，陳細(xì)華

（1.中國水產(chǎn)科學(xué)研究院長江水產(chǎn)研究所，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部淡水生物多樣性保護(hù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，武漢 430223；2.貴州中醫(yī)藥大學(xué)鱘魚健康養(yǎng)殖與藥用價(jià)值研究中心，貴陽 550025；3.長江大學(xué)動物科技學(xué)院，湖北荊州 434025；4.贏創(chuàng)德固賽（中國）投資有限公司廣州分公司，廣州 510600）

鱘魚，即鱘形目魚類，是古老的軟骨硬磷魚類，起源于白堊紀(jì)時(shí)期，迄今已有2億年的歷史，素有“水中活化石”之稱［1-2］。其骨可成膠，肉質(zhì)細(xì)膩、味道鮮美，營養(yǎng)價(jià)值高，尤其是鱘魚子醬富含優(yōu)質(zhì)蛋白、氨基酸和微量元素，被譽(yù)為“黑色黃金”，與鵝肝、松露并稱為世界三大美食［2］。隨著鱘魚養(yǎng)殖業(yè)的快速發(fā)展，我國已經(jīng)成為世界鱘魚養(yǎng)殖第一大國，雜交鱘是目前的主養(yǎng)品種［1］。然而，雜交鱘集約化養(yǎng)殖規(guī)模的擴(kuò)大導(dǎo)致各種疾病不斷出現(xiàn)，如分枝桿菌病［3-4］、出血性敗血?。?］、腦膜敗血伊麗莎白菌感染［6］等。消毒劑和抗生素等傳統(tǒng)的疾病防治方法不能有效預(yù)防和控制疾病的發(fā)生，同時(shí)隨著菌株耐藥性及抗生素對人體危害等問題的發(fā)生，很多國家禁止某些抗生素作為飼料添加劑，抗生素的應(yīng)用受到越來越多的限制［7］。近年來，益生菌作為有效的飼料添加劑和疾病防治物質(zhì)受到了越來越多的關(guān)注，已經(jīng)成為有效的抗生素替代產(chǎn)品之一［7］。益生菌在畜禽養(yǎng)殖中被廣泛使用，近年來在水產(chǎn)動物養(yǎng)殖過程中也受到越來越多的關(guān)注。

枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）是在自然環(huán)境中廣泛存在的革蘭氏陽性、能形成芽孢的非病原微生物，該菌先后被美國食品藥品管理局（U.S.Food and Drug Administration，F(xiàn)DA）和我國農(nóng)業(yè)農(nóng)村部列為對人畜安全的微生物，已作為益生菌和生物防治劑產(chǎn)品被廣泛應(yīng)用在醫(yī)藥、畜牧、水產(chǎn)及農(nóng)作物種植等領(lǐng)域［1-2］。研究顯示，枯草芽孢桿菌對畜牧和水產(chǎn)動物具有抗病、促生長的效果。然而，枯草芽孢桿菌在鱘魚養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)的應(yīng)用較為滯后，截至目前，僅見少量報(bào)道［8-12］。本研究采用商品化枯草芽孢桿菌（產(chǎn)品名稱：GutCare?；菌株編號：DSM32315）投喂雜交鱘，通過對雜交鱘生長性能、血液理化指標(biāo)和腸道微生物菌群等的影響，評估枯草芽孢桿菌的應(yīng)用效果，以期為鱘魚的健康養(yǎng)殖提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 益生菌及飼料

以酪蛋白、明膠、魚粉、豆粕作為配方中的主要蛋白源，魚油、豆油作為配方中的主要脂肪源，配置基礎(chǔ)飼料，其組成和營養(yǎng)水平見表1。本研究所用益生菌為枯草芽孢桿菌（贏創(chuàng)德固賽（中國）投資有限公司），根據(jù)公司前期的市場應(yīng)用效果，在每千克基礎(chǔ)飼料中分別添加比例為0.00%（0 g，A組）、0.10%（1 g，B組）、0.20%（2 g，C組）、0.40%（4 g，D組）的枯草芽孢桿菌，即每克飼料中有效活菌含量分別為0、2×106、4×106、8×106CFU，含量0.00%組為對照組。飼料制作過程：將飼料原料經(jīng)粉碎處理后按配方準(zhǔn)確稱取，其中大宗原料先在V型混合機(jī)中混合10 min，微量元素等通過逐級擴(kuò)大法混合均勻，然后用雙螺桿擠條機(jī)加工成直徑為1.5 mm的硬顆粒飼料，在烘箱（60℃）中靜置30 min，風(fēng)干后分裝置于-20℃冰箱備用。為避免影響芽孢桿菌的活性，飼料制備過程中溫度不高于100℃。

1.2 試驗(yàn)魚和養(yǎng)殖條件

180尾雜交鱘（西伯利亞鱘Acipenser baerii♀×施氏鱘A.schrenckii♂，俗稱西雜）幼魚，購自湖北省荊州市某鱘魚苗種場。試驗(yàn)魚運(yùn)至長江水產(chǎn)研究所荊州太湖基地暫養(yǎng)7 d后，選取初始體質(zhì)量（30±5）g的個(gè)體，隨機(jī)分成4組，每組3個(gè)平行，每個(gè)平行15尾雜交鱘，養(yǎng)殖在一個(gè)圓形桶中（直徑105 cm，體積0.43 m3）?；A(chǔ)飼料喂養(yǎng)一周后開始實(shí)驗(yàn)，養(yǎng)殖時(shí)間為2018年8月23日至2018年11月23日。水源為過濾后的地下水，水交換率為2 L·min-1；水溫17～20℃，溶解氧5.9～8.2 mg·L-1，pH 7.8～8.2。每天定點(diǎn)飽食投喂飼料2次（8∶00、15∶00），投喂率3% ～5%，投喂后及時(shí)收集殘餌，持續(xù)投喂90 d。

表1 基礎(chǔ)飼料組成及營養(yǎng)水平（干物質(zhì)基礎(chǔ)，%）Tab.1 Composition and nutrient levels of the basal diet（in DM，%）

1.3 生長指標(biāo)測量

生長性能計(jì)算公式為：

增重率（weight gain，WG，%）=100×（Wt-W0）/W0

特定生長率 （specific growth rate，SGR，%·d-1）=100×（lnWt-lnW0）／t

投喂率（feeding rate，F(xiàn)R，%·d-1）=100×（F×2/（Wt+W0））／t

餌料系數(shù)（feed conversion ratio，F(xiàn)CR）是動物增長單位體質(zhì)量所消耗的飼料量，其數(shù)值大小可直接反映飼料與動物生長之間的關(guān)系。

FCR=F/（Wt-W0）式中，W0和Wt分別為實(shí)驗(yàn)雜交鱘初始和終末體質(zhì)量（g）；F為飼料攝入量（g），t為實(shí)驗(yàn)時(shí)間（d）

肥滿度（condition factor，CF，g·cm-3）=100×終末體質(zhì)量／體長3

臟體比（viscerasomatic index，VSI，%） =100×內(nèi)臟重／終末體質(zhì)量

肝體比（hepatosomatic index，HSl，%） =100×肝臟重／終末體質(zhì)量

1.4 血液生化指標(biāo)

實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，每組隨機(jī)選取12尾魚，采用無菌注射器采集尾動脈血5 mL，置于5 mL離心管中。4℃下放置12 h，待血清析出后，經(jīng)5 000 r·min-1離心15 min，收集血清。測定10項(xiàng)生化指標(biāo)，包括白蛋白（ALB）、堿性磷酸酶（ALP）、谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）、谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST）、血清葡萄糖（GLU）、高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）、低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）、血清總膽固醇（TC）、甘油三脂（TG）、總蛋白（TP）。生化指標(biāo)采用全自動生化分析儀（BS-460，深圳邁瑞生物醫(yī)療電子股份有限公司）測試，測試過程中所需要的各種試劑購自深圳邁瑞生物醫(yī)療電子股份有限公司。

1.5 腸道微生物多樣性

實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，每組隨機(jī)采集6尾雜交鱘的后腸糞便，置于冷凍管中，液氮保存。分別提取樣品總DNA后，PCR擴(kuò)增建立細(xì)菌16S rDNA文庫。質(zhì)檢合格的文庫采用Illumina HiSeq2500進(jìn)行測序（北京百邁客生物科技有限公司）。腸道微生物分析采用如下步驟：1）對原始測序序列進(jìn)行過濾、雙端拼接，得到優(yōu)化序列（tags）；2）將優(yōu)化序列進(jìn)行聚類、劃分，即操作分類單元（operational taxonomic units，OTU），并根據(jù)OTU的序列組成得到其物種分類；3）基于OTU分析結(jié)果，對樣品在各個(gè)分類水平進(jìn)行分類學(xué)分析，獲得門、綱、目、科、屬、種分類水平上的群落結(jié)構(gòu)圖、物種聚類熱圖、屬分類學(xué)水平系統(tǒng)進(jìn)化樹及分類學(xué)樹狀圖；4）通過Alpha多樣性分析研究單個(gè)樣品內(nèi)部的物種多樣性，統(tǒng)計(jì)各樣品在97%相似度水平下的以豐度為基礎(chǔ)的覆蓋率估計(jì)值（abundance-based coverage estimator，ACE）、Chao1、Shannon及Simpson指數(shù)，繪制樣品稀釋曲線及等級豐度曲線；5）通過Beta多樣性分析來比較不同樣品在物種多樣性方面（群落組成及結(jié)構(gòu)）存在的差異大小。

1.6 數(shù)據(jù)分析

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤差（mean±SD）表示。所有數(shù)據(jù)采用SPSS 20.0軟件進(jìn)行單因素方差分析（one-way ANOVA），并采用Duncan氏法進(jìn)行組間多重比較，顯著性水平為P＜0.05。此外，對餌料系數(shù)進(jìn)行二次回歸分析，得出最佳餌料系數(shù)下益生菌的添加量。

2 結(jié)果與分析

2.1 生長指標(biāo)

飼料中添加不同水平的枯草芽孢桿菌對雜交鱘幼魚生長性能和形體指標(biāo)的影響見表2。實(shí)驗(yàn)各組存活率均大于91%。增重率與特定生長率隨枯草芽孢桿菌添加量的增加呈先上升后下降的趨勢，二者在添加量為0.10%時(shí)最高，但各組之間差異不顯著（P＞0.05）。投喂率及餌料系數(shù)隨枯草芽孢桿菌的添加先降低后升高，但大體上均顯著低于對照組（P＜0.05），其中0.20%添加組投喂率和餌料系數(shù)均為最低。為了獲得最低餌料系數(shù)下枯草芽孢桿菌的添加劑量，以餌料系數(shù)為判斷依據(jù)，根據(jù)二次模型（圖1）得出，飼料中添加0.22%的枯草芽孢桿菌餌料系數(shù)最低。各處理組之間的肥滿度、臟體比和肝體比均無顯著差異（P＞0.05）。

圖1 飼料中枯草芽孢桿菌添加量與雜交鱘幼魚餌料系數(shù)的關(guān)系Fig.1 Relationship between dietary Bacillus subtilis supp lem entation levels and FCR of juvenile hybrid sturgeon

2.2 血液生化指標(biāo)

飼料中添加不同水平枯草芽孢桿菌對雜交鱘幼魚血液生化指標(biāo)的影響見表3。與對照組相比，飼料中添加枯草芽孢桿菌可以增加血清葡萄糖含量，且0.10%添加組顯著高于對照組（P＜0.05）。其他各項(xiàng)血液生化指標(biāo)在各組之間無顯著性差異（P＞0.05）。

2.3 腸道微生物多樣性

2.3.1 腸道樣本測序數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

數(shù)據(jù)優(yōu)化后，3個(gè)試驗(yàn)組和1個(gè)對照組24個(gè)腸道糞便樣本總計(jì)獲得1 450 585條序列，260個(gè)OTUs（表4），其中4個(gè)分組有重疊OTUs 247個(gè)，A、B和C組重疊有OTUs 9個(gè)，僅A和B組重疊有OTUs 3個(gè)，僅B和C重疊有OTU 1個(gè)（圖2）。

表2 飼料中添加枯草芽孢桿菌對雜交鱘幼魚生長性能和形體指標(biāo)的影響（n=3）Tab.2 Effect of Bacillus subtilis supp lementation on grow th performance and body shape indexes of juvenile hybrid sturgeon（n=3）

表3 飼料中添加枯草芽孢桿菌對雜交鱘幼魚血液生化指標(biāo)的影響（n=3）Tab.3 Effect of Bacillus subtilis supplementation on p lasma biochem ical parameters of juvenile hybrid sturgeon（n=3）

2.3.2 腸道微生物多樣性

Alpha多樣性（Alpha diversity）分析結(jié)果顯示，隨著枯草芽孢桿菌添加量的增加，OTU指數(shù)逐漸下降，0.40%添加組的OTU值顯著低于其他組（P＜0.05）。與其他各組相比，0.40%枯草芽孢桿菌添加組Chao1和Simpson指數(shù)顯著降低（P＜0.05）。添加0.10%枯草芽孢桿菌獲得最高ACE指數(shù)，但與其他各組之間差異不顯著（P＞0.05）。飼料中添加枯草芽孢桿菌也有提高Shannon指數(shù)的趨勢，但各組間差異不顯著（P＞0.05）（表5）。

2.3.3 腸道微生物物種組成分析

在屬水平上，各試驗(yàn)組中，鯨桿菌屬（Cetobacterium）為優(yōu)勢菌群，隨著枯草芽孢桿菌添加量的增加，鯨桿菌屬含量下降，并在0.40%添加組獲得最低比例（74.29%）；而鄰單胞菌屬（Plesiomonas）含量升高，當(dāng)枯草芽孢桿菌添加量達(dá)到0.40%時(shí)，鄰單胞菌屬含量最高達(dá)23.64%。

飼料中添加枯草芽孢桿菌可以降低鏈球菌屬（Streptococcus）、乳酸菌屬（Lactobacillus）及乳球菌屬（Lactococcus）豐度，并在0.40%添加組獲得最低豐度；梭桿菌屬（Clostridium）豐度隨枯草芽孢桿菌的添加而上升；芽孢桿菌屬在0.10%添加組獲得最高豐度（表6，圖3）。

表4 糞便樣本16S rDNA測序數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)Tab.4 M icrobiota samples 16S rDNA sequencing data statistics

表5 腸道微生物多樣性指數(shù)Tab.5 Diversity index of intestinalm icrobiota sam ples

表6 腸道微生物屬水平分布Tab.6 Community com position at genus level

圖3 腸道微生物物種分布柱狀圖Fig.3 Histogram of intestinalm icrobial genus distribution

3 討論

隨著我國人工養(yǎng)殖雜交鱘產(chǎn)量和密度的增加，雜交鱘在養(yǎng)殖過程中面臨多種問題。其中，最為突出的是疾病的暴發(fā)。鱘魚疾病主要發(fā)生在稚魚期和幼魚期，尤其是稚魚開口期和幼魚轉(zhuǎn)食期，是鱘魚苗種培育階段的兩個(gè)敏感期，在此期間往往出現(xiàn)鱘魚的大規(guī)模死亡；當(dāng)鱘魚異地馴養(yǎng)或在高溫度夏時(shí)，魚體某些生理機(jī)能失調(diào)，也容易引發(fā)疾?。?］。如何提高鱘魚苗種的成活率，已經(jīng)成為鱘魚產(chǎn)業(yè)發(fā)展的重要一環(huán)。水產(chǎn)動物益生菌的主要作用機(jī)制包括免疫作用［13-14］、抗病毒作用［15］、營養(yǎng)作用［16］、酶作用［17-19］及降解作用等，其中，免疫作用、抗病毒作用、營養(yǎng)作用及酶作用與畜禽動物益生菌的作用機(jī)制類似，但降解作用與之有顯著不同［20］。研究表明，水產(chǎn)動物益生菌通過加快有機(jī)物分解速率，釋放游離氨基酸和葡萄糖為微生物提供營養(yǎng)，并促進(jìn)浮游動物生長，同時(shí)自身大量繁殖形成優(yōu)勢菌，進(jìn)而提高水產(chǎn)動物的免疫功能［21］。此外，水產(chǎn)動物益生菌還能夠直接吸收養(yǎng)殖水體中的有機(jī)物或在一定程度上降解有毒物質(zhì)，顯著減少淤泥形成，正向調(diào)節(jié)水質(zhì)［19］。

近年來，枯草芽孢桿菌已經(jīng)是飼料添加劑中常用的益生菌，對水產(chǎn)動物等研究顯示，飼料中添加芽孢桿菌對鱘魚的生長具有促進(jìn)作用［9-11］。高欣等［14］將不同劑量的芽孢桿菌粉添加到配合飼料中對西伯利亞鱘幼魚進(jìn)行喂食，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，添加0.10%芽孢桿菌試驗(yàn)組幼魚增重率和特定生長率達(dá)到最大值，飼料中添加芽孢桿菌對西伯利亞鱘具有一定的促生長作用。然而，本研究特定生長率在試驗(yàn)組和對照組之間差異不顯著。分析原因，可能與試驗(yàn)鱘魚的品種或者投喂的芽孢桿菌的菌株不同有關(guān)。定植是益生菌發(fā)揮作用的前提，從禽類中分離純化的枯草芽孢桿菌在鱘魚體內(nèi)的定植情況需要進(jìn)一步研究。

芽孢桿菌促進(jìn)養(yǎng)殖動物健康生長的作用功效主要表現(xiàn)在促進(jìn)動物營養(yǎng)物質(zhì)的消化吸收、調(diào)節(jié)動物消化道的微生態(tài)平衡及增強(qiáng)動物免疫能力與抗病能力等3個(gè)方面［8，11，13］。已有的研究顯示，芽孢桿菌可降低雜交鱘餌料系數(shù)，如李斌等［10］在雜交鱘（達(dá)氏鰉Huso dauricus♀ ×施氏鱘♂）飼料中添加0.20%的枯草芽孢桿菌，餌料系數(shù)降低了22.04%；劉曉勇等［9］在雜交鱘（施氏鱘♀ ×西伯利亞鱘♂）飼料中添加0.25%的枯草芽孢桿菌粉劑，餌料系數(shù)下降了36.02%。本研究添加枯草芽孢桿菌，餌料系數(shù)呈先降低后升高的趨勢，3個(gè)試驗(yàn)組分別降低了23.33%、37.67%和9.67%（表2），與之前報(bào)道的研究結(jié)果相似。說明飼料中添加枯草芽孢桿菌可顯著提高飼料的利用率，特別是枯草芽孢桿菌添加量為0.20%的試驗(yàn)組，餌料系數(shù)降低最顯著，根據(jù)二次模型（圖1）得出，飼料中添加0.22%的枯草芽孢桿菌為最優(yōu)，能顯著改善鱘魚的飼料利用。

血液中理化指標(biāo)的改變可反映動物機(jī)體的生理變化情況［3］。動物機(jī)體內(nèi)GLU含量是機(jī)體能量周轉(zhuǎn)代謝的重要指標(biāo)。研究顯示，保育豬飼料中添加枯草芽孢桿菌可顯著增加血漿GLU含量［21］。本研究發(fā)現(xiàn)，在雜交鱘飼料中添加枯草芽孢桿菌0.10% ～0.40%均顯著提高血清中GLU含量，說明枯草芽孢桿菌可增強(qiáng)機(jī)體對GLU的利用和轉(zhuǎn)化能力。

芽孢桿菌對不同動物具有特異性，是否可以成為有利于魚體生長和免疫的益生菌尚缺乏相關(guān)的理論基礎(chǔ)，菌株特性及其對魚類生長發(fā)育的安全性等尚缺乏科學(xué)實(shí)驗(yàn)依據(jù)［25］。已有研究顯示，飼料中添加枯草芽孢桿菌能夠改善草魚（Ctenopharyngodon idella）的腸道菌群組成［23-24］。本研究發(fā)現(xiàn)，枯草芽孢桿菌添加量在0.10%的試驗(yàn)組，腸道微生物菌群有改善，如腸道微生物多樣性升高，腸道中的芽孢桿菌含量升高。隨著添加量增加到0.40%，腸道微生物多樣性顯著下降，鄰單胞菌屬（Plesiomonas）細(xì)菌比例顯著升高，該屬細(xì)菌可引起魚類的腹瀉。

綜上所述，不同劑量枯草芽孢桿菌投喂雜交鱘后，可顯著降低餌料系數(shù)，增強(qiáng)魚體對GLU和脂肪的利用和轉(zhuǎn)化能力。以餌料系數(shù)為判斷依據(jù)，根據(jù)二次模型得出，飼料中添加0.22%的枯草芽孢桿菌可顯著改善鱘魚的飼料利用?？莶菅挎邨U菌添加量為0.10%時(shí)，可在一定程度上改善雜交鱘腸道的微生態(tài)環(huán)境。因此，在鱘魚養(yǎng)殖過程中枯草芽孢桿菌在飼料中的推薦添加劑量為0.10%～0.20%。