谷子白發(fā)病典型癥狀觀測及細(xì)胞壁降解酶活性測定

劉 琴，張 蕊，張育銘，任 璐，張寶俊

（山西農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院，山西太谷 030801）

由禾生指梗霉（Sclerospora graminicola（Sacc.）Schroet）引起的谷子白發(fā)病在各主產(chǎn)區(qū)均有發(fā)生。據(jù)統(tǒng)計，每年因谷子白發(fā)病造成的產(chǎn)量損失平均可達(dá)5.75 億kg[1]。谷子白發(fā)病從苗期到成熟期均可發(fā)生，根據(jù)發(fā)病時期和發(fā)病部位，發(fā)病癥狀可分為芽腐、灰背、槍桿或白尖、刺猬頭和發(fā)絲。特別是在抽穗前，病株頂部2～3 片葉叢生，葉尖或全葉黃白，心葉抽出后不能正常展開，而是呈卷筒狀直立，心葉組織逐漸變褐直至枯死，葉片沿葉脈分裂成細(xì)絲，葉肉細(xì)胞被病原菌分解，只留下灰白色如發(fā)絲的葉脈組織，嚴(yán)重影響谷子的光合作用及產(chǎn)量的提高。

病原菌對植物寄主的侵染過程涉及復(fù)雜的致病機理。病原菌和寄主的種類不同，致病因子也不相同，主要涉及的致病因子包括毒素、激素和細(xì)胞壁降解酶等[2-3]。有研究表明，細(xì)胞壁降解酶是一種重要的致病因子[4]。植物病原菌在侵染致病的過程中會產(chǎn)生一系列細(xì)胞壁降解酶，通常包括果膠酶（EC）、纖維素酶（CE）、半纖維素酶（hCE）和其他酶類[5]，通過酶解植物多糖來破壞和分解細(xì)胞壁，以提供病原菌自身營養(yǎng)促進(jìn)其對寄主組織的侵染[6-7]。侵染寄主的病菌進(jìn)入有性態(tài)時期，會自上而下從寄主植物形態(tài)學(xué)的頂端至穗下節(jié)產(chǎn)生大量卵孢子，并通過細(xì)胞壁降解酶等的作用，降解植物葉肉細(xì)胞的細(xì)胞壁。病原真菌對寄主植物的傷害一般是通過果膠酶和纖維素酶協(xié)同作用完成的[8-9]。陳曉林等[10]研究發(fā)現(xiàn)，蘋果樹腐爛病菌（Valsa ceratosperma）在活體組織內(nèi)、外均能分泌多聚半乳糖醛酸酶（PG）、果膠甲基酯酶（PME）、纖維素酶等一系列的細(xì)胞壁降解酶，對寄主植物的細(xì)胞壁造成了破壞。

谷子白發(fā)病白尖癥狀的形成可能與病菌分泌的植物細(xì)胞壁降解酶有關(guān)，為深入了解這一特殊的生理現(xiàn)象，本研究重點測定了病葉的形態(tài)特點及其細(xì)胞壁降解酶活性，旨在為進(jìn)一步探索禾生指梗霉菌與谷子的互作機制提供理論依據(jù)，也為后續(xù)的研究提供新的研究方向與思路。

1 材料和方法

1.1 試驗地概況

試驗在山西省太谷區(qū)、交口縣和榆次區(qū)試驗田進(jìn)行。其中，太谷區(qū)試驗田（112°30′E，37°12′N）屬暖溫帶大陸性氣侯，春溫高于秋溫，夏季暖熱多雨，冬季長而偏冷，年平均氣溫9.8 ℃，無霜期175 d，降雨量458 mm；交口縣試驗田（111°34′E，36°43′N）屬中溫帶大陸性氣候區(qū)，四季分明，春季干旱多風(fēng)少雨，夏季炎熱雨量集中，秋季相對溫涼濕潤，冬季寒冷干燥少雪，年平均氣溫6.8 ℃，年均日照2 700 h，無霜期142 d，降雨量618 mm；榆次區(qū)試驗田（113°08′E，37°54′N）屬暖溫帶半濕潤大陸性季風(fēng)氣候，夏季炎熱多雨，冬季寒冷干燥，春、秋短促，年平均氣溫9.8 ℃，年日照時數(shù)2 662 h，無霜期158 d，降雨量483 mm。

1.2 試驗材料

供試谷子品種晉谷57（JG57）、大白谷（DBG）、晉谷54（JG54）、晉谷21（JG21）、長生08（CS08）和晉汾52（JF52）由山西農(nóng)業(yè)大學(xué)生物工程研究所種質(zhì)資源庫提供。

1.3 主要試劑及儀器設(shè)備

供試試劑為2.5%戊二醛固定液、牛血清白蛋白、0.1 mol/L 磷酸緩沖液（PBS）（pH 值7.2）、0.1 mol/L磷酸緩沖液（pH 值6.8）、50 mmol/L 乙酸鈉緩沖溶液（pH 值5.2）、3，5-二硝基水楊酸試劑（DNS）、50mmol/L檸檬酸緩沖液（pH 值4.5）、50 mmol/L 檸檬酸緩沖液（pH 值5.0）、考馬斯亮蘭G-250、水楊苷、果膠酸鈉、果膠、甲基紅等，均購自生工生物工程（上海）股份有限公司。

主要儀器設(shè)備有葉面積儀（LI-3000C，美國LI-COR）、葉綠素儀（SPAD-502 PLUS，日本KONICA MINOLTA）、掃描電鏡（JEM-6490LV，日本電子株式會社JEOL）、酶標(biāo)儀（VERSA）、體視顯微鏡（SZX16，奧林巴斯）。

1.4 試驗方法

1.4.1 谷子白發(fā)病白尖表型觀測 2019 年按禾生指梗霉卵孢子與種子1∶50 的比例拌菌處理6 個品種谷子，播種于山西省太谷區(qū)試驗田作為試驗組，同時以播種未拌菌處理的不同品種谷子種子作為對照組。在谷子抽穗后，分別隨機選定6 個品種發(fā)病植株和健康植株各30 株，10 株為一次重復(fù)，重復(fù)3 次。用直尺或游標(biāo)卡尺測定倒2 葉的葉長、葉寬和葉厚，用葉面積儀測定倒2 葉葉面積；用葉綠素儀測定倒2 葉的SPAD 值，并在成株期測定寄主植物的株高，分析谷子白發(fā)病菌侵染對寄主植物株高及葉片發(fā)育的影響，同時期以健康植株同部位測定結(jié)果為對照。

1.4.2 葉片表皮毛形態(tài)觀測及不同地區(qū)表皮毛數(shù)量統(tǒng)計 2019 年谷子抽穗后，分別采集山西省交口縣（晉谷21-Ⅰ）、榆次區(qū)（晉谷21-Ⅱ）和太谷區(qū)（晉谷21-Ⅲ）谷子的健康葉與病葉各30 片，10 片為一次重復(fù)，重復(fù)3 次。用直徑為6 mm 的打孔器在倒2葉基部靠近主葉脈處切取葉碟，借助體式顯微鏡觀測單位面積內(nèi)病葉及健康葉片表皮毛的數(shù)量及密度。另選取山西太谷區(qū)晉谷21 病葉與健康葉片葉碟裝入加有2.5%戊二醛固定液進(jìn)行固定，依次用50%、70%、80%、90%、100%乙醇、乙醇與醋酸戊酯混合液（2∶1、1∶1、0∶1）脫水30 min，等到樣品充分干燥后鍍金，于掃描電鏡下觀察葉片表皮毛形態(tài)。

1.4.3 細(xì)胞壁降解酶提取及活性測定 采集山西榆次區(qū)晉谷21 病株，將不同發(fā)病程度取材并對不同部位編號為TG1～TG5，其中，TG1 表示第1 莖節(jié)植株；TG2 表示心葉基部退綠白化；TG3 表示心葉中部白化轉(zhuǎn)棕；TG4 表示心葉上段葉片全部變?yōu)樽厣?；TG5 表示倒2 葉為褐色發(fā)生縱裂形成發(fā)絲。健康植株的取材參照相同時期病株部位進(jìn)行，編號為CK1～CK5（圖1）。參照曹建康等[11]的細(xì)胞壁降解酶提取方法，稱取1 g 新鮮組織樣本，加入pH 值7.2 的PBS 緩沖液9 mL，用勻漿器將標(biāo)本勻漿充分，5 000 r/min 離心30 min 后，收集上清液（粗酶液），分裝成2 份，其中一份用于CE、PG、PME、PL 酶活的測定，另一份沸水浴10 min 后取出冷卻，制成失活粗酶液，作為測定PG、PME 酶活時的對照組，于-20 ℃保存（同時注意CE、PL 酶活性使用試劑盒測得，不需要失活酶液作為對照）。其中，CE 酶活性的測定使用上海酶聯(lián)生物的植物纖維素酶酶聯(lián)免疫分析試劑盒，450 nm 波長處測定吸光度值；測定PG酶和PME 酶活性參照HAGERMAN 等[12]的方法并修改，PG 酶活性的測定顯色劑為甲基紅，在525 nm波長處測定吸光度值，PME 酶活性測定顯色劑為DNS，在540 nm 波長處測定吸光度值；PL 酶活性測定是使用上海酶聯(lián)生物的植物果膠裂解酶酶聯(lián)免疫分析試劑盒進(jìn)行操作，在450 nm 波長處測定吸光度值，同時以健康植株同部位組織為對照，3 次重復(fù)。

1.5 數(shù)據(jù)分析

采用Excel 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)整理與作圖；利用SPSS 21.0 軟件對試驗數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析，采用鄧肯氏（Duncan）新復(fù)極差法進(jìn)行差異顯著性比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同品種健康植株與病株的葉片表型觀測結(jié)果

圖2 結(jié)果表明，谷子白發(fā)病菌侵染谷子植株后，對谷子的葉片的正常發(fā)育造成嚴(yán)重影響，6 個不同品種的病株與健康植株的表型各指標(biāo)相比均差異顯著（P＜0.05），株高降低，降低范圍為9.06～32.17 cm；葉面積減小，減小范圍為19.07～87.12 cm2；葉片增厚，增加范圍為0.50～1.00 mm；葉片葉綠素SPAD 值降低，降低范圍為20.27～37.19；葉片長度縮短，縮短范圍為5.23～17.49 cm；受侵染寄主的葉片會發(fā)生不正常橫向生長，葉片平均寬度與健康植株相比寬7.50～11.50 mm。

2.2 晉谷21 健康植株與病株葉片表皮毛觀測結(jié)果

2.2.1 葉片表皮毛數(shù)量觀測結(jié)果 健康葉與病葉表皮體式顯微鏡下觀測結(jié)果發(fā)現(xiàn)（圖3），與健康葉片相比病葉表皮毛數(shù)量明顯增多。

掃描電鏡下觀測結(jié)果發(fā)現(xiàn)（圖4），健康葉片表皮毛稀少，而病葉表皮毛密集且數(shù)量多。

2.2.2 葉片表皮毛數(shù)量統(tǒng)計結(jié)果 山西省交口縣、榆次區(qū)、太谷區(qū)3 個地點晉谷21 品種的健康葉與病葉表皮毛數(shù)量測定結(jié)果如表1 所示，結(jié)果表明，不同地點健康葉與病葉的表皮毛數(shù)量相比差異顯著（P ＜0.05），病葉上的表皮毛數(shù)量平均約為1.481～1.509 個/mm2，相同部位的健康葉的表皮毛數(shù)量約為0.093～0.111 個/mm2，病葉表皮毛數(shù)量約為健康葉的13～18 倍，表明病菌侵染可刺激寄主葉片的表皮毛過度生長。

表1 晉谷21 健康植株與病株葉片表皮毛數(shù)量測定結(jié)果 個/mm2

2.3 細(xì)胞壁降解酶活性測定結(jié)果

健康葉和病葉的細(xì)胞壁降解酶活性測定結(jié)果顯示（圖5），病葉CE 酶活性前期低于健康葉，隨著發(fā)病程度加重，CE 酶活性呈上升趨勢，發(fā)病程度處于所測定TG5 時，CE 酶活性達(dá)到最高值，為1 467.04 U/g，與健康葉CE 酶活性差值也達(dá)到最大，為480.47 U/g；病葉PME 和PL 的酶活性在不同發(fā)病程度均顯著高于健康葉（P＜0.05），尤其是在葉片發(fā)生縱裂時（即TG5），其酶活性分別達(dá)到最高值585.22、275.55 U/g；病葉PG 酶活性與健康葉相比差異不顯著（P＞0.05），其中，處于TG5 時也達(dá)到最高值931.34 U/g，與健康葉差值也達(dá)到最大，為777.70 U/g，在TG5 時酶活性明顯升高，并且差值達(dá)到最大時比CE、PME、PL 處于最大值時的酶活性都高。

3 結(jié)論與討論

本研究發(fā)現(xiàn)，谷子植株受到禾生指梗霉病菌侵染后，會發(fā)生植株矮化，葉片變寬、變厚，葉面積減少，葉表皮毛數(shù)量增多等特殊的癥狀。章元壽[13]研究發(fā)現(xiàn)，許多病原菌能合成植物激素，如植物生長素（IAA）、赤霉素（GA）、脫落酸（ABA）等，誘導(dǎo)植物產(chǎn)生矮化、畸形、偏上性等病變形態(tài)。同時有研究報道[14]，生長素與油菜素內(nèi)酯（BR）、細(xì)胞分裂素（CTK）與赤霉素之間的相互作用對調(diào)控葉片形態(tài)、葉面積等方面可能發(fā)揮著重要作用。因此，下一步將重點通過測定相關(guān)激素含量的變化，探索禾生指梗霉菌致病過程中的關(guān)鍵激素類型及變化特點。同時，本試驗還調(diào)查統(tǒng)計了不同谷子品種病葉的變化，結(jié)果顯示，植株矮化，葉片變寬、變厚等現(xiàn)象不存在品種的差異。

HEILER 等[15]研究證明，在活體營養(yǎng)型蠶豆單胞銹菌（Uromyces viciae fabae）中纖維素降解酶被嚴(yán)格的分化?；哉{(diào)控。JPR 等[16]研究報道，在禾白粉菌（Erysiphe graminis DC.）產(chǎn)生分化的附著胞時有纖維素酶活性，從而支持了專性寄生真菌產(chǎn)生分化特異的細(xì)胞壁降解酶的論點。這些研究結(jié)果表明，細(xì)胞壁降解酶在病原菌侵染寄主植物時發(fā)揮著重要的作用。CHI 等[17]和COOPER 等[18]研究發(fā)現(xiàn)，病原菌與寄主植物互作過程中，病原菌分泌的細(xì)胞壁降解酶不僅能夠抵御植物的抗性反應(yīng)，還能維持自身的正常功能。大部分病原菌產(chǎn)生多種細(xì)胞壁降解酶協(xié)同作用，可有效分解寄主細(xì)胞壁利于其成功侵染。本研究發(fā)現(xiàn)，病原菌侵染后的植株，細(xì)胞壁降解酶的活性發(fā)生了變化，病原菌在侵染寄主時纖維素酶活性會發(fā)生變化，纖維素酶活性在前期活性較低，但隨著發(fā)病程度的加重，酶活性升高，與石延霞等[19]對接種黃瓜霜霉菌（Pseudoperonospora cubensis Berk.et Curt.Rostov.）葉片的細(xì)胞壁降解酶活性測定的結(jié)果非常相近。GIBSON 等[20]和PURBASHA 等[21]研究表明，病原菌在發(fā)病前期會抑制果膠酶的活性，而在發(fā)病后期酶活性顯著升高，與本研究果膠酶在病原菌侵染后期發(fā)揮重要作用的結(jié)果一致。本研究通過測定果膠酶等細(xì)胞壁降解酶活性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，不同發(fā)病程度的葉片果膠甲基酯酶和果膠裂解酶的酶活性在病菌侵染的不同時期均顯著高于健康葉，葉片發(fā)生縱裂時酶活性分別達(dá)到最高值，而多聚半乳糖醛酸酶酶活性病葉與健康葉相比差異不顯著，在TG5 時酶活性明顯升高，并且差值達(dá)到最大時比纖維素酶、果膠甲基酯酶和果膠裂解酶處于最大值時的酶活性都高。表明多聚半乳糖醛酸酶在葉片形成發(fā)絲時（TG5）發(fā)揮重要作用。

在本研究基礎(chǔ)上，可以進(jìn)一步研究細(xì)胞壁降解酶相關(guān)基因在病原菌侵染過程中發(fā)揮的作用，為研究病原菌與寄主的互作機制奠定基礎(chǔ)。病原菌侵染后植株表型的變化可能與植物激素含量的變化密切相關(guān)，但尚需進(jìn)一步研究證實。